转基因.动物技术课件

主要内容转基因动物技术发展转基因动物技术的原理转基因动物技术中目的基因的转移方法转基因动物技术的应用现状转基因动物技术研究中出现的问题转基因动物技术的展望一转基因动物技术发展

★1974年，美国Jaenisch应用显微注射法，在世界上首次成功地获得了SV40DNA转基因小鼠。★

1981年，Costantini将兔-珠蛋白基因注入小鼠的受精卵，使受精卵发育成小鼠，表达出了兔一珠蛋白。★1982年，palmiter等分别将小鼠金属硫蛋白基因启动子(MT一1)与大鼠生长激素(rGH)结构基因和人生长激素(bGH)结构基因融合并导入小鼠受精卵中，获得了生长超过正常小鼠的超级小白鼠★1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌α—抗胰蛋白酶。★1989年，意大利学者用精子作为载体，成功地获得了纯系转基因小鼠。

★1990年，荷兰phraming公司培育了含有人乳铁蛋白的转基因牛。每生牛奶中含有人乳铁蛋白1g，是母乳的良好替代品。★1991年英国爱丁堡PPL制药公司培育成功a1-抗胰蛋白酶转基因山羊，现已拥有这种山羊200多只，一升羊奶中含有这种蛋白30g。★1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。★1997年10月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出3只携带有人凝血因子Ⅸ基因转染绵羊。★1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。★2000年6月22日晚8时整，生物胚胎工程专家张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。

导入的外源基因称为转入基因(transgcne)。

获得转基因动物的整个技术叫转基因动物技术（TransgenicAnimaltechnology）（二）转基因动物技术的原理

转基因动物技术是利用重组DNA技术获得目的基因，通过一定方法将其导入动物基因组并发生重组，动物个体遗传性状得以改造，使之向着有利于人类方向发展。三目的基因的转移方法

(一)显微注射法

也称原核显微注射法，目前应用较广泛，最早最经典的方法。以单细胞受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建好的载体DNA直接注射入受精卵的原核，再将接受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。

1.程序目的基因的制备受精卵的准备准备假孕母鼠显微注射胚胎移植对幼鼠的鉴定2.优点：导入过程直观；整合率高没有其它载体或化学试剂对细胞造成的毒性。外源DNA大小基本不受限制（1～50kb）3.缺点：设备昂贵、环节较多对操作人员有较高的技术要求低效率（尤其是大家畜）对卵子伤害大，胚胎存活率低基因整合随机性转基因沉默

2.必备条件胚胎干细胞(ES细胞)能在体外培养，保留发育的全能性外源目的基因打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpessimplexvirus)胸腺嘧啶激酶(thymidinekinase)3.基本程序打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞：重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种4.优点：外源基因整合情况的可控性高。可预先在细胞水平检测外源基因的拷贝数、定位、表达的水平及插入的稳定性。外源基因导入ES细胞的方法多样，细胞鉴定及筛选方便。5.缺点：目前可用于该系统的ES细胞系只来源于小鼠，适用物种少。所得个体为嵌合体，实验周期长ES细胞系建立困难在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。

（三）逆转录病毒法（Retrovirusmediatedgenetransfer）

主要是利用逆转录病毒DNA的长末端重复顺序（LTR）区域具有转录启动子活性这一特点，将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵，或微注入囊胚腔中，携带外源基因的逆转录病毒DNA可以整合到宿主染色体。在各种基因转移方法中,通过反转录病毒载体把基因整合到受体细胞核基因组中是最有效的方法之一。

2.优点：操作简单外源基因的整合率较高动物病毒所具有的启动子既可引发一些选择标记基因的表达，还能引发所导人的外源基因的表达

3.

缺点：只能转移小片DNA(=<10kb)并且外源基因难以植人生殖系统，成功率较低。携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞基因组过程中有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或其他有害基因。

（四）体细胞基因转移和克隆

此法是以体外培养的哺乳动物体细胞为材料，通过普通的哺乳动物细胞基因转移技术．获得相应的经过遗传修饰的细胞后，直接利用核移植介导的哺乳动物体细胞克隆技术，即将该体细胞的细胞核移入去核的卵细胞中，并将所得细胞移入代孕动物，获得转基因动物克隆个体。

（五）精子栽体法

一种直接利用精子作为外源DNA载体的基因转移方法。其方法是利用精子可以俘获外源DNA的特点，将成熟的精子直接与外源DNA混合培养，外源DNA可以直接进入精子的头部，再经受精后，并使外源DNA整合于受精卵中,再将受精卵发育成转基因动物。（六）人工酵母染色体（YAC）法

人工酵母染色体（YAC）载体是近年来发展起来的新型载体，具有克隆百万碱基对级的大片段外源DNA的能力。其技术途径有二：一是ES细胞转染YAC后体外筛选阳性ES细胞囊胚腔注射。二是YAC的原核微注射。

（七）基因打靶法

该技是利用DNA体内同源重组的原理，将外源基因稳定地插入特定的位点，再经适当的筛选，从而得到既定的转化细胞。这一技术不仅为基因定位整合进而为哺乳动物种系改造开拓了道路，而且在缺陷基因的修复以及生命科学的理论研究上，将有很大的研究价值。我国2002年在国际上首创采用基因打靶技术得到功能基因转基因山羊。除上述几种转基因方法外，为了某种特殊需要也探索一些其他方法，如激光导人法、受体介导的基因转移法、脂质体介导法、电转移法、微弹轰击法等，但总体看来仍不十分理想，效率不高四转基因动物技术的应用现状

目前，转基因动物技术主要应用于以下个方面：（一）促进动物生长、提高产量、改善品质（二）生产药用