2022骨髓间充质干细胞及其外泌体在终末期肝病治疗中的应用(全文)

2022骨髓间充质干细胞及其外泌体在终末期肝病治疗中的应用（全文）终末期肝病(ESLD)以肝功能不能满足人体的正常生理需求为特征，是各种急、慢性肝损伤所致的晚期阶段，主要包括病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝炎等疾病引起的失代偿期肝硬化及肝衰竭。本类疾病病死率高、医疗负担重，严重危害人民健康。肝移植作为临床有效治疗方法，存在供体短缺、费用高昂等问题[1]。近年来细胞疗法研究突显间充质干细胞(MSC)治疗肝病的潜在临床应用优势。MSC可从骨髓、脂肪、脐带血以及胚胎等组织分离，但不同来源的MSC的生物学特性不同。一项研究[2]表明，骨髓来源MSC迁移能力最强，而这种能力是组织再生修复过程中不可或缺的因素。同时，骨髓间充质干细胞(BMSC)具有强大的旁分泌功能，特别是其来源的外泌体在肝病治疗中颇受关注。本文就BMSC及其外泌体在ESLD中的研究进展作一综述，为进一步临床应用研究提供部分参考。1、BMSC及其外泌体概述BMSC是源于中胚层的成体干细胞，具有自我更新及多向分化潜能，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为多种组织细胞，如骨、软骨、心肌细胞、上皮细胞等。目前BMSC仍缺乏特异性标志物，通常认为其表达CD73、CD90和CD105，而不表达CD14、CD34和CD45。由于免疫原性低，不易触发受体免疫反应，BMSC适用于同种异体或自体移植。BMSC可以迁移到受损肝组织并直接分化为肝细胞，也可旁分泌可溶性因子，如前列腺素E2、肝细胞生长因子(HGF)、吲哚胺2，3-双加氧酶和血管内皮生长因子等以改善肝组织微环境，促进受损肝细胞修复[3-4]。外泌体是由细胞内的多泡小体与细胞膜融合并释放到细胞外空间的细胞外囊泡，直径40~160nm，是一种新的非细胞性的信号传递方式。外泌体携带大量生物活性物质，包括蛋白质、脂质、DNA、mRNA、微小RNA，通过不同的信号通路诱导靶细胞活性的改变。外泌体几乎可由各种细胞类型分泌和吸收，BMSC是其重要细胞来源[5]。与BMSC相比，BMSC来源外泌体(BMSC-Ex)更容易获取，不存在免疫排斥反应，安全性更好，且具有跨生物屏障能力，可开发为药物递送载体。BMSC-Ex向受损肝脏传递生物信息，参与调控肝细胞再生、肝纤维化与肝脏炎症损伤等病理生理过程[6-7]。2、BMSC移植治疗ESLD的临床应用已有大量临床研究表明，BMSC移植治疗以失代偿期肝硬化与肝衰竭为代表的ESLD具有显著的临床效果。2.1 治疗失代偿期肝硬化的临床研究失代偿期肝硬化是慢性肝病的终末阶段，由于广泛的肝细胞坏死与肝组织结构破坏，造成肝功能失代偿，出现一系列严重并发症[8]。BMSC移植对多种原因引起的失代偿期肝硬化具有良好疗效。一项临床试验[9]招募了例乙型肝炎肝硬化患者，经肝动脉注入自体BMSC，随访24周，共39例患者完成试验，其中移植组20例，对照组19例。结果显示，自体BMSC移植组患者的肝功能、终末期肝病模型(MELD)评分和Child-Pugh评分改善程度显著优于常规治疗组。同样，自体BMSC经外周静脉移植治疗丙型肝炎肝硬化[10]，经肝动脉移植治疗酒精性肝硬化[11]均能改善患者肝功能并减轻纤维化程度。然而，并非所有研究均呈现BMSC移植对肝硬化患者有理想疗效。如一项随机对照临床研究[12]招募了27例肝硬化失代偿期患者，其中15例患者从外周静脉注射自体BMSC，12例患者注射等体积的生理盐水作为对照，12个月后观察两组的肝功能、Child-Pugh评分、MELD评分、国际标准化比值(INR)变化均无显著差异。这可能与BMSC移植的细胞数量、移植途径以及移植前是否预处理等因素有关。2.2 治疗肝衰竭的临床研究肝衰竭是多种因素引起的严重肝损伤，导致肝功能严重障碍，出现以黄疸、腹水、凝血功能障碍、肝性脑病等为主要表现的一组临床症候群。一项随机对照临床试验[13]经外周静脉输注自体BMSC治疗乙型肝炎相关肝衰竭患者，每周1次，持续4周，随访24周，结果显示，BMSC移植组累积存活率(73.2%)显著高于常规治疗组(55.6%)，且BMSC移植可显著降低患者血清TBil水平、改善MELD评分以及降低严重感染的发生率，提高周生存率。另有研究[14]对BMSC进行预处理后注入丙型肝炎相关肝衰竭患者体内观察其疗效。20例患者经皮下注射粒细胞集落刺激因子5d后抽取其BMSC，经分离纯化后由外周静脉输注于自体接受治疗；随访26周以上，移植组中54%患者的血清ALT、AST恢复正常，肝脏合成功能改善。另一项研究[15]将自体BMSC向肝细胞样细胞诱导分化后移植入体内，随访6个月，结果显示，BMSC移植可显著改善肝衰竭患者的腹水、下肢水肿、血清白蛋白含量和Child-Pugh评分。3、BMSC移植治疗ESLD的作用机制ESLD的病理学特点是大量肝组织炎症坏死及胶原纤维沉积。对重度肝损伤、肝纤维化模型的干预研究均表明，BMSC移植疗法可促进肝细胞再生，减轻肝脏炎症及抑制肝纤维化进程(图1)。1BMSC及其外泌体治疗ESLD的作用机制3.1 BMSC促进肝细胞再生肝细胞作为肝实质细胞的主要组成部分，负责肝脏生物合成、转化、代谢等功能，维持肝脏稳态。持续的慢性肝损伤造成大量肝细胞坏死、凋亡，肝细胞增殖能力严重不足，无法满足机体肝功能需求。因此，有效促进肝细胞再生是治疗ESLD的重要途径。BMSC移植疗法促进肝再生。如给D-半乳糖胺/脂多糖[16]以及90%肝切除[17]诱导的肝衰竭大鼠注射BMSC，肝组织增殖细胞核抗原(PCNA)、Ki-67阳性染色面积显著增加，且肝细胞中β-catenin发生核易位，上调原癌基因和细胞周期蛋白D1(cyclinD1)的表达，促进肝细胞增殖。这种现象与BMSC归巢至受损肝脏，通过直接分化或旁分泌功能促进肝细胞再生有关。给CCl4诱导的肝纤维化小鼠[18]尾静脉注射BMSC，绿色荧光蛋白标记的BMSC迁移到受损肝脏，肝组织肝细胞标志物Alb的表达升高。在细胞因子包括HGF、血管内皮生长因子、半乳糖凝集素-3或巨噬细胞集落刺激因子的作用下[3,19-20]，BMSC向肝脏归巢并分化为肝细胞样细胞的能力增强。BMSC向肝脏归巢的机制并未完全阐明，研究[21]表明与SDF-1/CXCR4轴活化有关。肝损伤时肝组织SDF-1表达升高，刺激其受体CXCR4在BMSC表面的表达上调，进而介导BMSC迁移至受损肝组织。外泌体是BMSC旁分泌机制的重要组成部分，发挥与其母体细胞类似的生物学功能。动物实验[22]表明，BMSC-Ex可迁移至刀豆球蛋白-A(Con-A)诱导的肝损伤小鼠肝脏，抑制肝细胞凋亡，同时促进肝组织再生修复。细胞实验[23]证实，BMSC-Ex通过自噬途径抑制肝细胞凋亡，显著降低促凋亡蛋白Bax和cleavedcaspase-3的表达，而上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。同时，可诱导肝细胞损伤模型中G0期肝细胞重新进入G1期，显著上调cyclinD1和PCNA的表达，加速肝细胞再生周期[24]。3.2 BMSC抑制肝纤维化进展肝纤维化是响应慢性肝损伤的病理变化，是失代偿期肝硬化的重要病理基础。肝损伤刺激肝星状细胞(HSC)活化，并转分化为表达α-SMA的肌成纤维细胞，分泌大量胶原，导致细胞外基质过度沉积[8]。动物实验[25]表明，BMSC移植可减轻CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，发挥显著的抗肝纤维化作用。这种作用主要归结于BMSC可抑制HSC活化并诱导活化的HSC凋亡。在采用TGFβ1诱导人HSC活化细胞模型[26]中观察到，BMSC干预后，HSC的活化能力显著减弱，且α-SMA和Ⅰ型胶原的表达显著下降。BMSC可通过调控多条信号通路作用于HSC发挥抗肝纤维化作用。给硫代乙酰胺诱导的肝硬化大鼠移植BMSC后，肝组织TGFβ1及其下游受体Smad3的表达水平显著降低，且α-SMA的表达减少，提示BMSC可通过调控TGFβ/Smad信号通路抑制HSC活化进而改善肝纤维化[27]。NADPH氧化酶是自由基(ROS)的主要来源，ROS参与肝纤维化病理过程。BMSC降低HSC中ROS的标志物4-HNE与NOX的亚型p47phox的表达，通过调控NADPH氧化酶通路抑制HSC活化[26]。另外，细胞外基质的合成与降解受基质金属蛋白酶(MMP)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)调控。BMSC移植可上调肝组织MMP-9的表达，下调肝组织TIMP-1的表达，促进细胞外基质降解[28]。BMSC-Ex也能有效干预HSC活化环节，阻止肝纤维化进展。在CCl4诱导的肝纤维化大鼠模型[29]中，人来源BMSC-Ex能抑制HSC中Wnt/β-catenin通路信号转导，减少HSC增殖、活化，从而减轻肝纤维化。此外，外泌体可作为信号递送载体在细胞间传递。通过质粒转染环状DNAcircDIDO1进入BMSC中，随后circDIDO1成功包装到BMSC-Ex内，分离携带circDIDO1的BMSC-Ex并与LX2细胞共孵育，发现BMSC-Ex介导的circDIDO1转移通过上调PTEN以抑制AKT信号通路活性，从而抑制HSC的活化[30]。3.3 BMSC参与免疫调控BMSC具有强大的调控免疫的能力，通过改善肝脏免疫细胞状态，抑制促炎因子分泌，减轻肝脏炎性损伤。巨噬细胞是固有免疫的主要参与者，通常认为M1型巨噬细胞具有促炎作用，而M2型巨噬细胞具有抗炎作用。在CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型[31]中，BMSC干预后促进巨噬细胞向M2亚型极化，抑制其向M1亚型极化，从而降低炎性因子IL-12b、IFNγ、TNFα和IL-6的表达，减轻炎症反应。同样，BMSC干预Con-A诱导的肝损伤小鼠后，M2型巨噬细胞数量增多，且血清IL-10水平上调并刺激信号传导及转录激活蛋白3的磷酸化，进而降低肝组织TUNEL阳性细胞数量和cleaved-Caspase3/8/9的蛋白表达，抑制肝细胞凋亡[32]。BMSC也可调控Hedgehog/SMO/Gli1通路和Notch1信号发挥抑制炎症作用，BMSC上的CD47和巨噬细胞中SIRPα直接结合可诱导巨噬细胞Gli1和Notch1胞内结构域(NICD)的核易位，而NICD与Gli1相互作用并调节其靶基因Dvl2，进而抑制NLRP3炎症小体驱动的炎症反应[33]。T淋巴细胞被激活后，大量增殖、分化，同时释放促炎因子以发挥其效应功能[34]。BMSC抑制肝脏T淋巴细胞向CD4+亚型分化，进而降低血清促炎因子与肝组织α-SMA的表达，减轻炎症与纤维化[35]。同样，使用携带Becn1-shRNA慢病毒载体转染的BMSC也显示出抑制CD4+和CD8+T淋巴细胞的增殖能力[36]。此外，将肝脏脱细胞生物支架植入大鼠体内，外周静脉输注BMSC后能减轻中性粒细胞浸润和纤维组织形成，但这作用仅能维持2周左右[37]。在胆汁淤积性肝损伤环境下，肝脏血管内皮黏附分子1表达升高，招募中性粒细胞与CD8+T淋巴细胞，促进胆道周围炎性损伤以及纤维化；而BMSC-Ex可降低血管内皮黏附分子1的表达，减少免疫细胞浸润，保护肝脏免受炎症损伤[38]。另外，外泌体包含的miRNA是其发挥作用的重要生物活性物质之一。研究[39]发现使用慢病毒转染过表达miR-223的BMSC-Ex能够改善小鼠肝功能与肝组织炎性损伤，且显著降低肝组织NLRP3和Caspase-1的表达，而抑制BMSC-Ex中miR-223的表达后其治疗作用消失，提示BMSC-Ex中miR-223通过抑制NLRP3炎症小体信号通路发挥抗炎作用。4、中医药联合BMSC移植干预ESLD的作用近年来，大量研究[40]集中于如何提高BMSC治疗ESLD的临床效果，常用方法如基因编辑技术、细胞因子或生长因子对BMSC进行预处理，但是基因重编程具有潜在的安全风险。值得关注的是，已有研究[41-42]表明中医药能促进BMSC增殖分化能力，且具有低成本、安全性高的优点，有望开发成为潜在的BMSC移植的辅助治疗投入应用。越来越多研究显示，中药复方与BMSC联用干预ESLD具有协同增效作用。BMSC联用一贯煎[43]、鳖甲煎丸[44]、济生肾气丸[45]均能改善CCl4诱导的肝硬化大鼠肝功能，减轻肝纤维化，两者联用的效果优于单用BMSC移植。进一步研究发现中药复方及其有效成分可增强BMSC归巢至受损肝脏并分化为肝细胞的能力。如在CCl4诱导的肝硬化大鼠模型[41]中，柔肝化纤颗粒联用BMSC移植组肝组织内绿色荧光蛋白标记的BMSC数量明显多于单用BMSC移植组。体外采用虫草多糖含药血清培养大鼠BMSC，发现虫草多糖组7天时细胞可见AFP的表达，14天时细胞表达CK18与Alb，提示虫草多糖能诱导BMSC向肝细胞分化[42]。课题组前期采用胆管结扎诱导大鼠胆汁淤积性肝纤维化模型，发现肝脏Notch信号通路活化并促进肝祖细胞向胆管上皮细胞分化，伴随Notch信号通路的负向调节因子Numb表达水平降低，阻断Notch信号可抑制肝纤维化进展[46]。黄芪汤干预可显著抑制Notch信号的活化及肝纤维化进展，并显著提高Numb的表达水平[47]。进一步在胆管结扎的同时将BMSC和Numb敲减的BMSC(BMSCNumb-KD)经脾脏注射大鼠肝内，发现BMSC移植可显著降低肝组织胶原沉积，并抑制胆管反应和HSC活化，提示BMSC移植可抑制胆汁性肝纤