其它有机酸发酵工艺苹果酸课件

第四章其他有机酸发酵工艺学4.2苹果酸的发酵生产4.2.1概述4.2.2苹果酸的性质以及用途4.2.3苹果酸的生产方法4.2.4苹果酸的提取和精制工艺

第四章其他有机酸发酵工艺学4.2苹果酸的发酵生产14.2.1概述

L-苹果酸(L-malicacid简称L-Ma)是生物体糖代谢过程中产生的重要有机酸，广泛存在于生物体中、在未成熟的苹果、葡萄、樱桃等的水果和蔬菜中含量约为0.4%。苹果酸发酵研究历史。我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作。苹果酸发酵生产的现状。4.2.1概述

L-苹果酸(L-malicacid简称L-2苹果酸发酵研究历史早在20世纪20代Kostychev等利用蔗糖发酵时，在加CaCO3的培养基中就获得了L-苹果酸。1959年阿部重雄等普查了260株曲霉、120株青霉和80株根霉的产苹果酸能力，选出了黄曲霉A-114菌株，并对此菌株进展发酵条件的探索。摇瓶发酵7～9d、产苹果酸最高浓度可达50g/L。苹果酸发酵研究历史早在20世纪20代Kostychev等利用31976年米光英一，利用出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans〕可直接由糖质原料生产L-苹果酸。例如由葡萄糖50g、NaNO32.0g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O0.05g、酵母膏0.05g，水1.0L配成培养基、灭菌冷却后，接种出芽短梗霉，同时加CaCO32%，27℃振荡培养5d，1.0L培养基中含L-苹果酸25.2g。1976年米光英一，利用出芽短梗霉(Aureobasidi4酶催化法生产苹果酸日本田道制药公司首创以精制富马酸为原料，通过产氯杆菌菌体固定化，将富马酸转化成L-苹果酸。1972年，千火田一郎等，以产氨短杆菌为生产菌株，以聚丙烯酰胺凝胶为载体进展菌体固定化连续生产L-苹果酸。但利用此菌种进展反响过程中，副产物琥珀酸很难与L-苹果酸分开,经过反复试验，用含脱氧胆酸或胆酸的基质溶液进展处理，可抑制副产物琥珀酸的生成。提高了L-苹果酸的产量。在工业生产上选择了最廉价的胆汁为胆酸。抑制副产物琥珀酸的生成。1974年田边制药公司以此法进展L-苹果酸连续生产。在容积1000L的充填塔中，日夜连续反响，日产L-苹果酸15.4吨。酶催化法生产苹果酸51987年Chikata、Ichiro等建立了一个1000L的以K-卡拉胶固定黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)的固定化反响柱，持续6个月，每小时能生产42.2Kg/L苹果酸。1990年Fialovo、Marie等建立了一个中试车间，用藻朊酸固定棒杆菌细胞、流加富马酸盐溶液，每90d生产20吨苹果酸。田道制药公司和三菱化成公司用此工艺大量生产L-苹果酸。产品主要用于医药工业的大输液、pH调节剂和某些药物的中间体。1987年Chikata、Ichiro等建立了一个10006我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母(Candidarugosa)的苹果酸生产技术。福建省三明真菌研究所研究了L-苹果酸的霉菌固体发酵。1981年起无锡轻工大学金其荣等，普查了261株各种曲霉的苹果酸生产能力，并对菌种进展了诱变处理和发酵最正确条件的探讨，选出了优良菌株黄曲霉(Aspergillusflavus)UVT3，并在昆山味精厂协作下完成了500L罐中试，产率稳定在68%左右。1991年吴梧桐用K-卡拉胶固定黄色短杆菌胶，用0.3mol/LKCl作固化剂，胆汁酸作激活剂、半衰期为200d。以富马酸钠为底物，反响生成L-苹果酸钠和剩余的富马酸钠。利用苹果酸钙溶解度比富马酸钙低的特性，将L-苹果酸从混合液中别离出来。我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作中国科学院北京微生物研究7L-苹果酸生产现状目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等，世界总产量每年约为10万吨，其中L-苹果酸产量每年约为4万吨，而世界市场潜在需求量到达每年6万吨，日本是世界主要的L-苹果酸生产国与出口国主要生产厂商：日本扶桑化学公司，美国Denka化学公司，加拿大Batek化学公司以及英国、南非等，但这些公司是用化学合成法生产，产品为DL-苹果酸，每吨售价2.4-3.0万元人民币。日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的苹果酸生产能力占世界生产能力之60%。由于D-苹果酸不能被人体所利用，因此DL-苹果酸的消费市场将受到限制。1988年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为4%．到1991年上升到4.5%。但由于苹果酸的价格太高，故只用于特殊食品。一步发酵法一旦大规模投产，的价格将会有大幅度地下降。1997年Bayer公司称，美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中，将减少柠檬酸用量，增加L-苹果酸用量，尤其在使用二肽甜味剂时更能突出L苹果酸风味，改善口感，提高产品质量。L-苹果酸生产现状目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日8目前我国的L-苹果酸产量仅为1万吨左右。主要企业有：常茂生物化学工程股份〔产量3000吨〕，南京国海生物工程〔产量1000吨〕，滦南九州生物化工〔产量1000吨〕。产量上还远落后于国外同行企业，可见市场开展空间之大。其它有机酸发酵工艺苹果酸课件94.2.2苹果酸的性质以及用途4.2.2.1苹果酸的性质苹果酸又名羟基丁二酸或羟基琥珀酸性状：无色结晶，易吸潮。相对密度(d420)1.595。熔点约130℃，沸点150℃(分解)。易溶于水，1g本品能溶于l.4mL醇、1.7mL醚、0.7mL甲醇、2.3mL丙醇、几乎不溶于苯。具有酸味．结晶体，在水中具有旋光性。分子中含有一个不对称碳原子，故有L-、D-、DL型3种。分子式：C4H6O5。HO-CH-COOH∣CH2-COOH4.2.2苹果酸的性质以及用途4.2.2.1苹果酸的性质10化学性质苹果酸用发烟硫酸处理可氧化得到75%-80%香豆酸(2-吡喃酮-5-羧酸)。苹果酸的水溶液在Fe2+催化下与H2O2反响生成草酰乙酸。苹果酸在三氯化硼催化下，可与醇发生酯化反响，形成苹果酸酯。与多元醇，芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚树脂。苹果酸酯在氨的醇溶液中能形成苹果酸酰胺。化学性质苹果酸用发烟硫酸处理可氧化得到75%-80%香豆酸(114.2.2.2苹果酸的用途

苹果酸得最大用途在食品加工业，其次在医药行业和工业也有应用。苹果酸在食品行业的应用：〔1〕苹果酸具有明显的呈味作用，其酸味柔和、爽快，与柠檬酸相比刺激性缓慢、保存时间长，具有特殊的香味，并且不损伤口腔和牙齿等特点。〔2〕苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜〔天冬氨酰苯丙氨酸甲酯〕配合使用，作为软饮料的风味固定剂。(3)苹果酸在医学方面的作用：由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用。4.2.2.2苹果酸的用途

苹果酸得最大用途在食品加工业，其12其它有机酸发酵工艺苹果酸课件13

①、由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料。②、代谢的正常运行可以使各种营养物质顺利分解，促进食物在人体内吸收代谢，低热量，可有效地防止肥胖，可以起到减肥的作用。③、在药物中添加苹果酸可增加其稳定性，促进药物在人体的吸收、扩散；复合氨基酸输液生产中就是利用L-苹果酸这一功能而用它来调节pH值的，同时作为混合氨基酸输液组分之一，可提高氨基酸利用率，用于治疗尿毒症、高血压等和减少抗癌药物对正常细胞的侵害，用于癌症放、化疗后的辅助药物，用于烧伤治疗可以促进伤口愈合。④、L-苹果酸可以促进氨代谢，降低血氨浓度，对肝脏有保护作用，是治疗肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良药。①、由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与14⑤、L-苹果酸作为治疗心脏病根底液成分之一，用于K+、Mg2+的补充，保持心肌的能量代谢，对心肌堵塞的缺血性心肌层起到保护作用。⑥、L-苹果酸是乳酸钙注射液的稳定剂，也可作为抗癌药的前体及用作动物生长促进剂。⑦、抗牙垢，苹果酸具有酸度大、味道柔和、香味独特及苹果酸的腐蚀破坏作用比较弱，相应的牙釉质磨损体积损失较小，有不损害口腔和牙齿等特点。⑧、可以改善脑组织的能量代谢,调整脑内神经递质,有利于学习记忆功能的恢复，对学习记忆有明显的改善作用⑤、L-苹果酸作为治疗心脏病根底液成分之一，用于K+、M15其他行业的应用：苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用，作为保色剂和增效剂，广泛用于染料工业；用由于pH值调节，因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清洁剂、焊锡助焊剂、洗涤剂、废气脱硫剂、锅炉水垢清洁剂、空气清洁剂和除臭剂，特别是去除室内鱼腥臭、香烟臭及食品贮藏室的异味，代替柠檬酸作为各种金属外表或容器的除锈剂。苹果酸是制备特殊性能聚合物的单体，用苹果酸聚合可合成生物降解塑料，有利于环境保护；在建材行业，苹果酸添加在水泥中，可缩短凝固时间，防止碱性聚合反响发生，提高混凝土的强度，代替草酸作为各种石块的外表清洗剂，使其外表变得光滑、平整、美观；苹果酸还可作为饲料添加剂，改善汽车排气质量或应用于海带养殖业。其他行业的应用：164.2.3苹果酸的生产方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的方法主要有：一步发酵法，二步发酵法，固定化细胞或酶法转化。4.2.3.1一步发酵法〔1〕一步发酵法产苹果酸菌种的选育〔2〕一步发酵法发酵工艺与条件4.2.3.2二步发酵法4.2.3.3固定化细胞或酶法4.2.3苹果酸的生产方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的174.2.3.1一步发酵法

〔1〕一步发酵法产苹果酸菌种的选育直接发酵法主要采用的微生物是：黄曲霉、米曲霉(Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Asp.parasiticus)、出芽短梗霉(Aureabasidiumpullulans)等。特点：三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累。4.2.3.1一步发酵法

〔1〕一步发酵法产苹果酸菌种的选育18〔2〕一步发酵法发酵工艺与条件

一步发酵法又称直接发酵法，即采用一种微生物直接发酵糖质原料或非糖质原料（如正构烷烃）生成L-苹果酸的方法。以糖类为原料，由黄曲霉、米曲霉等直接发酵生产苹果酸〔2〕一步发酵法发酵工艺与条件

一步发酵法又称直接发酵法，即19金其荣等选出的黄曲霉T2803菌种，经诱变剂联合处理后经，获得株产酸较稳定的菌种TH5007。可用薯干粉经α-淀粉酶液化后作初糖进展发酵，而在发酵中间参加葡萄糖，使总糖到达13%，发酵产L-苹果酸达7.33%，扣除杂酸，对糖转化率为56.4%，发酵强度1g／(L．h)的结果。刘建军等人从土壤中别离出几株直接利用糖质原料生产L-苹果酸的黄曲霉菌株，经紫外线、亚硝基胍,Co60,硫酸二乙脂等诱变处理、高酸和高渗透压平板别离，获得一株L-苹果酸高产突变株黄曲霉HA5800，以100g/L的葡萄糖为碳源,35℃,200r/min摇瓶发酵120h,L-苹果酸产率稳定在72g/L以上，糖酸转化率达74.23%。传代实验证明该菌株产酸性能稳定吴清平等人以曲霉菌LMO2为出发株，选育出Nl-14、NEUl2、Nul416和Nul419。其中N1-14菌种可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖为碳源，最大发酵体积为20m3，发酵120h产L苹果酸酸85.8g／L并己取得了中国专利(CN1112160)。以色列Battat等人报道黄曲霉(ATCC13697)以葡萄糖为碳源，16升发酵罐发酵，以葡萄糖为碳源，16升发酵罐发酵，通过条件优化培养190小时，产酸高达11.3%。这些微生物最大的特点就是三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累。

金其荣等选出的黄曲霉T2803菌种，经诱变剂联合处理后经，获20控制条件①生孢斜面培养基：麦芽汁琼脂斜面②锥形瓶培养基：麦芽汁，33℃静止培养2～4d③种子培养基(g/L)：葡萄糖30，豆饼粉10，K2HPO4·3H200.2，MgSO4·7H2O0.1，NaCl0.01，FeSO4·7H2O0.5，CaCO360(单独灭菌)，MnSO4·H2O1.2控制条件21④发酵培养基采用葡萄糖70～80g/L，其余成分与种子培养基一样。种子培养基分别参加种子罐补足水量，参加泡敌(50L培养基参加20ml)抑制泡沫生成。并缓慢搅拌，0.1MPa实罐灭菌20～30min，冷却至35℃左右参加已灭菌的CaCO3，并接种黄曲霉锥形瓶种子，在33～34℃，180r/min搅拌培养、通气量0.15～0.3vvm，培养18～20h后接入发酵罐。发酵罐培养基配制同上法,灭菌后降温至34℃时，接入10%种子培养液，通气搅拌进展发酵。发酵时控制温度33～34℃，通气量0.7vvm，搅拌转速180r/min，自动流加泡敌控制泡沫生成，发酵周期约40h。待残糖降到1.0g/L时，放罐提取。④发酵培养基采用葡萄糖70～80g/L，其余成分与种子培养基22金其荣使用薯干粉液化为碳源，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工序，有利于降低生产本钱。薯干粉液化液分批发酵，不补加糖，发现初糖浓度9.7%时产酸最高。初糖浓度过高或过低，都不利于发酵产酸和转化率。吴清平等筛出的曲霉菌诱变株N1-14也具有糖化酶活力，也可以淀粉液化液为碳源发酵生产L-苹果酸。不同菌种对氮源的要求不同。例如金其荣等用的氮源对产L-苹果酸的影响研究中，无机氮源，NaNO3和NH4NO3不利于产酸。0.5%豆饼粉效果较好，且较为经济。豆饼粉用量为0.3-0.5%,产L-苹果酸最为理想，发酵液中总酸达7.0%左右。玉米粉中也含有一定量的氮源，而且玉米粉中也含有65%左右的淀粉。玉米粉用量低于0.5%时，对产酸不利。一般采用1.0%-1.5%玉米粉，此时也可扣除初糖的用量。无机盐成分经实验证明，K2HPO4,KH2PO4,FeSO4,MgSO4,MsSO4等对产酸有一定的影响。在正交实验中，用高压液相色谱进展分析时，初步认为KH2PO4和K2HPO4浓度为0.015%-0.02%，以0.015%时为最正确。表8.2.6列出了N1-14菌种20m3发酵罐数据。金其荣使用薯干粉液化为碳源，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工234.2.3.2二步发酵法二步发酵法即采用两种不同功能的微生物，其中之一先将糖质或其他原料转化生成富马酸〔延胡索酸〕，另一种微生物将富马酸转化成L-苹果酸。二步发酵法，由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率相对较低，副产物较多4.2.3.2二步发酵法二步发酵法即采用两种不同功能的微生物24蒋明珠等从41株根霉属菌株中选出产富马酸能力最高，同时产生局部L-苹果酸的菌株R25，经鉴定为无根根霉〔Rhizopusarrhizus〕,再用具有高富马酸酶活力的普通变形杆菌〔Proteeasvulgaris〕P1.可将富马酸转化为L-苹果酸。无根根霉菌株R25在含有12g/dL葡萄糖的培养基中,31℃培养3天，完成了富马酸的发酵。然后将在液体培养基中31℃培养2天的普通变形杆菌P1接入，在同样的条件下发酵2天，L-苹果酸的产量可达5.48g/dL。在含有18g/dL薯干粉培养基中发酵，能得到一样的产量，产物经别离提纯为白色结晶，经纸色谱，红外光谱鉴定为苹果酸。蒋明珠等从41株根霉属菌株中选出产富马酸能力最高，同时产生局25华侨大学的胡纯铿等人采用A-23菌株和V-81菌株混合培养发酵L-苹果酸，分别探讨碳源浓度对A-23菌株和V-81菌株发酵水平的影响。实验说明，A-23菌株产延胡索酸能力强。V-81菌株具有高活性的延胡索酸酶，研究A-23菌株和V-81菌株混合培养方式对发酵L-苹果酸的影响，结果说明A-23菌株接入含有150g/L葡萄糖的混合发酵培养基中培养3d,后接入V-81菌株并继续培养2天，产酸水平最高，L-苹果酸浓度达73.3g/L,对糖的转化率达65.6%。华侨大学的胡纯铿等人采用A-23菌株和V-81菌株混合培养发26

N1-14菌种20m3发酵罐数据N1-14菌种20m3发酵罐数据274.2.3.3固定化细胞或酶法利用具有高活性富马酸酶的微生物细胞或富马酸酶，采用固定化酶或细胞反响器，将富马酸转化成L-苹果酸。虽然固定化细胞和固定化酶均有应用，但由于酶的提取技术复杂，收率不高，本钱昂贵，因而在实际生产中多用固定化细胞。采用的载体主要有藻酸钙凝胶，角叉菜胶及聚丙烯酰氨凝胶等4.2.3.3固定化细胞或酶法28有富马酸酶活力的菌种有：产氨短杆菌〔Brevibacteriumammoniagenes〕，黄色短杆菌〔Brevibacteriumflavum〕，假单胞杆菌〔Pseudomonasfumarase〕，膜噗毕赤酵母〔Pichiamembranaefaciens〕，皱褶假丝酵母〔Candidarugose〕，马棒杆菌〔Corynebacteriumequi〕，大肠杆菌〔E.coli〕，普通变形杆菌〔Proteeasvulgaris〕，荧光假单胞菌〔Pseudomonasfluorescens〕，枯草芽孢杆菌〔Bacillussubtilis〕和八叠球菌〔Sarcinavarihils〕。含有较高活性富马酸酶的微生物有短杆菌，产氨短杆菌，黄气短杆菌，解脂假丝酵母和温特曲霉等。有富马酸酶活力的菌种有：产氨短杆菌〔Brevibacteri29黄腾华和王雪根，以富马酸铵为酶反响底物，选用黄色短杆菌，在16L发酵罐中培养20h，酶活力到达40000单位。12L发酵液得到的菌体制成容积为16L的固定化细胞，取其中8L装成反响柱，在37℃每天流过14%的富马酸铵溶液100L，可产L-苹果酸12.5%，质量转化率近89.29%。杨廉婉等人以富马酸为原料采用固定化细胞的方法生产苹果酸。将发酵得到的微生物细胞用多孔珍珠岩粉吸附再用聚乙烯醇包埋，低温固定化。固定化细胞的富马酸酶回收率90%以上，产物对底物的转化率80%以上。〔91103606专利〕黄腾华和王雪根，以富马酸铵为酶反响底物，选用黄色短杆菌，在130西德专利2450137公布了用聚丙烯酰胺凝胶包埋产延胡索酸酶的微生物细胞生产苹果酸的方法。Yamamoto等也报道了用相似的方法固定化产氨短杆菌连续生产苹果酸的方法。Takata报道了用卡拉胶包埋黄色短杆菌连续生产苹果酸的方法。中国专利92107642也描述了用卡拉胶包埋黄色短杆菌生产苹果酸的方法。其它有机酸发酵工艺苹果酸课件31该方法的劣势：生产本钱较高以化学合成原料富马酸生产的苹果酸存有疑虑，从混合液中把苹果酸和富马酸彻底分开难度较大，产品质量很难到达出口要求所以这种方法生产苹果酸也具有一定的局限性。该方法实施现状日本自二十世纪70年代开场使用这种工艺小批量生产L-苹果酸，但开展不快，产量至今不大。我国八十年代末九十年代初，固定化酶或细胞转化法生产L-苹果酸的研究到达了高潮，全国各地相继建立了多条生产线，但由于固定化酶的转化率低，半衰期短，国产富马酸质量不稳定，生产本钱相对较高，该方法的劣势：32对该方法的研究:固定化细胞酶活力稳定性的研究固定化方法的选择，主要包括固定介质，细胞浓度，胆汁酸和胆氧胆酸浓度，温度，底物浓度和pH值等因素。对该方法的研究:33⑴固定化黄色短杆菌生产L-苹果酸流程

⑴固定化黄色短杆菌生产L-苹果酸流程34此工艺一般包括两步：一是固定化细胞的制备：将产酶菌株培养成熟后，收集菌体细胞，包埋菌体，制备固定化酶或细胞，通常在37℃条件下运行，转化半衰期可达160天左右；二是L-苹果酸制备：先将富马酸和CaCO3反响转化为富马酸钙，经提取得L-苹果酸。目前这种方法生产苹果酸的转化率可达98%以上，此工艺一般包括两步：35⑵斜面培养基普通肉膏琼脂培养基⑶摇瓶种子培养基(g/dL)柠檬酸二胺2.0～3.0,玉米浆2.0～4.0,KH2PO4·3H2O0.2，MgSO4·7H2O0.05，尿素0.2，pH7.0，0.1MPa灭菌20min。⑷发酵培养基(g/dL)葡萄糖1.5，玉米浆1.5，富马酸0.4，KH2PO4·3H2O0.1,MgSO4·7H2O0.05,尿素0.2,pH6.7～7.0,0.1MPa灭菌20min。⑵斜面培养基普通肉膏琼脂培养基36⑸发酵过程肉膏斜面菌种活化无菌水洗下1000ml摇瓶(内装300ml摇瓶培养基)

发酵罐每隔2～4h取样测定。30℃16～24h少量无菌水洗下转接至克氏瓶肉膏琼脂表面上24h30℃摇床16～24h30℃12h30℃⑹收集活菌体发酵结束后经16000rpm离心15min，生理盐水洗涤活菌体2次，每次洗涤离心15min，发酵液中菌体浓度为3%～4%，每次1g温菌体的酶活力为2.0～2.5万单位。⑸发酵过程30℃16～24h少量无菌水洗下转接至克氏24h337⑺菌体包埋以8g湿菌体加8ml生理盐水将菌体制成悬浮液,放在温水浴内,加温使品温达40～45℃备用。取1.5gK-卡拉胶加34ml蒸馏水，放在70～80℃热水浴中搅拌，待卡拉胶充分溶胀后，慢慢冷却至品温45℃，立即将保温的细胞悬浮液，迅速倒入卡拉胶液中,不断搅拌10min，等其冷却成型，放置2～10℃冰箱中，2h后取出，用0.3mol/LKCl浸泡4h，再切成3×3×3mm3小块，整个操作在无菌条件下进展。所得固定化细胞参加15ml由1mol/L富马酸钠内含0.3%的胆酸组成的活化液，在37℃下保温20～24h进展活化，其目的是激活富马酸的活力并抑制琥珀酸副产物的产生。活化后的固定化细胞颗粒用0.1mol/LKCl洗涤2～3次，再用无离子水洗至无胆酸为止，装柱待用。其它有机酸发酵工艺苹果酸课件38⑻上柱前的准备及酶转化工业级富马酸加NaOH配制成1∶1mol/L的富马酸钠溶液，pH7.0保温37～40℃，然后将溶液上柱转化。将底物溶液以恒速流过装有固定化细胞的反响柱,底物通过富马酸酶转化成L-苹果酸。流出液中L-苹果酸钠浓度以0.85mol/L为标准，大于此值可适当加快流速。流出液中已转化好的L-苹果酸钠占大局部,在整个反响过程中底物和柱的温度要始终保持在37～40℃。至于固定化细胞内酶活力的半衰期，据报导与菌种、固定化材料、工艺操作等因素有关,据王博彦、金其荣研究,观察6个月未见L-苹果酸产率下降的现象。1972年千火田一郎用聚丙烯酰胺包埋产氨短杆菌制成固定化细胞，装入充填柱内进展连续反响生产L-苹果酸,算出在37℃时酶活力的半衰期为52.5d。⑻上柱前的准备及酶转化394.2.4苹果酸的提取和精制工艺苹果酸的提纯：钙盐沉淀法、吸附沉淀法、电渗析法。钙盐沉淀法：钙盐沉淀法包括转化，过滤，酸解，过滤，净化，浓缩，结晶，枯燥等，流程钙盐沉淀法工艺流程4.2.4苹果酸的提取和精制工艺钙盐沉淀法工艺流程40溶剂萃取法：近年来人们有提出了一种从水溶液中提取苹果酸的工艺流程。该法以TRPO〔三烷基氧化瞵〕为萃取剂，以煤油为稀释剂的萃取体系。于常温下进展萃取，然后再用去离子水进展反萃，反萃温度为60℃,萃取率为80%，溶剂萃取法：近年来人们有提出了一种从水溶液中提取苹果酸的工艺41苹果酸精制采用离子交换和活性炭联合处理，进展除杂质和脱色。滤清液送入高位槽，进入酸性阳离子交换柱，再进入弱碱性阳离子交换柱进展脱盐处理；再把净化液引入真空浓缩罐中，在50～70℃下浓缩至1000～1300g/L，然后放入结晶罐中缓缓搅拌降温至5～20℃，参加晶种，待晶体成长完成后，用离心机分出晶体，用少量无盐水洗去晶面母液，收集湿晶,放入沸腾枯燥床上，用30～60℃的枯燥空气枯燥，枯燥后的L-苹果酸经质检合格后即行包装贮存。苹果酸精制采用离子交换和活性炭联合处理，进展除杂质和脱色。424.2.5苹果酸的检测和标准

苹果酸生产相关的检测技术主要:4.2.5.1富马酸酶活力的测定4.2.5.2苹果酸检测方法⑴定性检验⑵定量测定⑶富马酸定量检测①高锰酸钾滴定法②紫外分光光度法③高效液相色谱法4.2.5.3苹果酸的质量标准4.2.5苹果酸的检测和标准

苹果酸生产相关的检测技术主要:434.2.5.1富马酸酶活力的测定1.富马酸酶活力的测定酶活力的含义即每毫升发酵液或每克湿菌体每小时消耗富马酸的毫克数，即单位活力mg/(h.ml)或mg/(h.g

)。2、测定方法：取2ml发酵液,8000rpm离心，去清液，用生理盐水洗涤活菌体，离心,再去清液。将活菌体置于37℃水浴中保温5～10min。准确吸取3ml在37℃水浴中保温的底物(1mol/L富马酸钠含0.04%十六烷基溴化三钾铵，50mmol/LKH2PO4·3H2O，pH7.0)，参加装有菌体的小试管中，于37℃水浴中搅拌15min，立即将反响试管放于沸水中加热5min，中止反响。离心取上清液，转入容量瓶中，测富马酸含量(从标准曲线上查出富马酸含量，然后根据活力单位含义算出扩大培养液每1ml酶活力)。用培养时间作横坐标(h),用酶活力单位作纵坐标，画出产富马酸酶曲线图。4.2.5.1富马酸酶活力的测定1.富马酸酶活力的测定444.2.5.2苹果酸检测方法

⑴定性检验采用显色反响即称取样品1g，溶于20ml水中，吸1ml此液放于15ml试管中，用氨水(分析纯)中和，用量0.05～0.1ml,切勿过量，参加1%对氨基苯磺酸水溶液，在沸水浴中加热5min，再参加20%亚硝基钠溶液5ml，稍加热后，以4%NaOH溶液调pH至碱性，此液应呈红色，说明有苹果酸存在；另外还有三氯化钛法，即在试管中参加5ml待试溶液，滴入3滴15%三氯化钛溶液，几分钟后，出现白色沉淀，说明有苹果酸存在。假设气温过低，可稍加热，此法对苹果酸最低检出浓度为0.5g/L。4.2.5.2苹果酸检测方法

⑴定性检验45⑵定量测定酸碱滴定法即准确称取样品1.5g放于250ml容量瓶中，溶解后定容。准确吸取此溶液25.0ml放于三角瓶中，参加2滴酚指示剂，用0.1mol/LNaOH溶液滴定至微红色(持续时间不得少于30s)。每毫升0.1mol/LNaOH溶液相当于6.704mg苹果酸。紫外分光度法,即取1ml样品溶液(苹果酸浓度控制在0.05～0.8mg/L)，放入试管中，参加6ml硫酸〔分析纯〕，参加0.1ml2，7-萘二酚溶液，在100℃水浴中加热12～15min，冷却至接近室温后，在385nm处进展比色测定，以蒸馏水作对照，校正仪器零点。用标准样品先制作标准曲线，以苹果酸含量为横坐标，385nm处吸收值即OD385为纵坐标。通过未知样品在385nm处的OD值，那么可在标准曲线上找到相应的苹果酸浓度。⑵定量测定酸碱滴定法46⑶富马酸定量检测

①高锰酸钾滴定法即准确称取1～2g待测样品，置于50ml锥形瓶内，加2ml蒸馏水，使样品溶解后加1滴浓硫酸(分析纯)，然后用0.1mol/L高锰酸钾标准液滴定，滴定速度为每3s1滴，从开场出现红色持续4s不褪色即终点。记下耗用高锰酸钾升数，查标准曲线，就可计算出富马酸含量。m1富马酸含量=—×100%m2式中m1为标准曲线上查得的富马酸克数，m2为样品质量⑶富马酸定量检测

①高锰酸钾滴定法47②紫外分光光度法准确称取1～2g待测样品，用0.2mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)准确配制10mg/ml浓度的待测液，准确吸取1ml待测液，在280nm紫外光测定，记下吸光度值A280nm，可以从标准曲线上查到富马酸含量。②紫外分光光度法48③高效液相色谱法

现对苹果酸质量控制越来越高，要求99%以上都是苹果酸，富马酸残留量要求在0.5%以内，对检验手段也要求很高。高效液相色谱就是利用高分辨树脂层析，在同一流动相中将富马酸、苹果酸和其他有机酸很好地分开。它们在210nm紫外检测器中，可以记录出峰的顺序，而且系列稳定，可以重复。具体操作：分别配制标准苹果酸、富马酸等10%标准溶液，分别注入一定量于树脂柱中，用洗脱液洗出，记录各标样出峰时间和相应的峰值，如带计算机的还可用峰的积分面积计算。③高效液相色谱法

现对苹果酸质量控制越来越高，要求99%以上493.苹果酸的质量标准苹果酸及其相关工程的检验方法可参照美国药典(1995年23版P22d2、P22)的规定进展。苹果酸的质量指标见下表。3.苹果酸的质量标准50其它有机酸发酵工艺苹果酸课件51第四章其他有机酸发酵工艺学4.2苹果酸的发酵生产4.2.1概述4.2.2苹果酸的性质以及用途4.2.3苹果酸的生产方法4.2.4苹果酸的提取和精制工艺

第四章其他有机酸发酵工艺学4.2苹果酸的发酵生产524.2.1概述

L-苹果酸(L-malicacid简称L-Ma)是生物体糖代谢过程中产生的重要有机酸，广泛存在于生物体中、在未成熟的苹果、葡萄、樱桃等的水果和蔬菜中含量约为0.4%。苹果酸发酵研究历史。我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作。苹果酸发酵生产的现状。4.2.1概述

L-苹果酸(L-malicacid简称L-53苹果酸发酵研究历史早在20世纪20代Kostychev等利用蔗糖发酵时，在加CaCO3的培养基中就获得了L-苹果酸。1959年阿部重雄等普查了260株曲霉、120株青霉和80株根霉的产苹果酸能力，选出了黄曲霉A-114菌株，并对此菌株进展发酵条件的探索。摇瓶发酵7～9d、产苹果酸最高浓度可达50g/L。苹果酸发酵研究历史早在20世纪20代Kostychev等利用541976年米光英一，利用出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans〕可直接由糖质原料生产L-苹果酸。例如由葡萄糖50g、NaNO32.0g、KH2PO41.5g、MgSO4·7H2O0.05g、酵母膏0.05g，水1.0L配成培养基、灭菌冷却后，接种出芽短梗霉，同时加CaCO32%，27℃振荡培养5d，1.0L培养基中含L-苹果酸25.2g。1976年米光英一，利用出芽短梗霉(Aureobasidi55酶催化法生产苹果酸日本田道制药公司首创以精制富马酸为原料，通过产氯杆菌菌体固定化，将富马酸转化成L-苹果酸。1972年，千火田一郎等，以产氨短杆菌为生产菌株，以聚丙烯酰胺凝胶为载体进展菌体固定化连续生产L-苹果酸。但利用此菌种进展反响过程中，副产物琥珀酸很难与L-苹果酸分开,经过反复试验，用含脱氧胆酸或胆酸的基质溶液进展处理，可抑制副产物琥珀酸的生成。提高了L-苹果酸的产量。在工业生产上选择了最廉价的胆汁为胆酸。抑制副产物琥珀酸的生成。1974年田边制药公司以此法进展L-苹果酸连续生产。在容积1000L的充填塔中，日夜连续反响，日产L-苹果酸15.4吨。酶催化法生产苹果酸561987年Chikata、Ichiro等建立了一个1000L的以K-卡拉胶固定黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)的固定化反响柱，持续6个月，每小时能生产42.2Kg/L苹果酸。1990年Fialovo、Marie等建立了一个中试车间，用藻朊酸固定棒杆菌细胞、流加富马酸盐溶液，每90d生产20吨苹果酸。田道制药公司和三菱化成公司用此工艺大量生产L-苹果酸。产品主要用于医药工业的大输液、pH调节剂和某些药物的中间体。1987年Chikata、Ichiro等建立了一个100057我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作中国科学院北京微生物研究所研究了固定化皱褶假丝酵母(Candidarugosa)的苹果酸生产技术。福建省三明真菌研究所研究了L-苹果酸的霉菌固体发酵。1981年起无锡轻工大学金其荣等，普查了261株各种曲霉的苹果酸生产能力，并对菌种进展了诱变处理和发酵最正确条件的探讨，选出了优良菌株黄曲霉(Aspergillusflavus)UVT3，并在昆山味精厂协作下完成了500L罐中试，产率稳定在68%左右。1991年吴梧桐用K-卡拉胶固定黄色短杆菌胶，用0.3mol/LKCl作固化剂，胆汁酸作激活剂、半衰期为200d。以富马酸钠为底物，反响生成L-苹果酸钠和剩余的富马酸钠。利用苹果酸钙溶解度比富马酸钙低的特性，将L-苹果酸从混合液中别离出来。我国在发酵法生产苹果酸方面的研究工作中国科学院北京微生物研究58L-苹果酸生产现状目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日本等，世界总产量每年约为10万吨，其中L-苹果酸产量每年约为4万吨，而世界市场潜在需求量到达每年6万吨，日本是世界主要的L-苹果酸生产国与出口国主要生产厂商：日本扶桑化学公司，美国Denka化学公司，加拿大Batek化学公司以及英国、南非等，但这些公司是用化学合成法生产，产品为DL-苹果酸，每吨售价2.4-3.0万元人民币。日本扶桑、理研、川崎化成三家公司的苹果酸生产能力占世界生产能力之60%。由于D-苹果酸不能被人体所利用，因此DL-苹果酸的消费市场将受到限制。1988年苹果酸在美国酸味剂市场上占有率为4%．到1991年上升到4.5%。但由于苹果酸的价格太高，故只用于特殊食品。一步发酵法一旦大规模投产，的价格将会有大幅度地下降。1997年Bayer公司称，美国和欧洲软饮料使用的酸味剂中，将减少柠檬酸用量，增加L-苹果酸用量，尤其在使用二肽甜味剂时更能突出L苹果酸风味，改善口感，提高产品质量。L-苹果酸生产现状目前世界苹果酸主要生产国有美国、加拿大、日59目前我国的L-苹果酸产量仅为1万吨左右。主要企业有：常茂生物化学工程股份〔产量3000吨〕，南京国海生物工程〔产量1000吨〕，滦南九州生物化工〔产量1000吨〕。产量上还远落后于国外同行企业，可见市场开展空间之大。其它有机酸发酵工艺苹果酸课件604.2.2苹果酸的性质以及用途4.2.2.1苹果酸的性质苹果酸又名羟基丁二酸或羟基琥珀酸性状：无色结晶，易吸潮。相对密度(d420)1.595。熔点约130℃，沸点150℃(分解)。易溶于水，1g本品能溶于l.4mL醇、1.7mL醚、0.7mL甲醇、2.3mL丙醇、几乎不溶于苯。具有酸味．结晶体，在水中具有旋光性。分子中含有一个不对称碳原子，故有L-、D-、DL型3种。分子式：C4H6O5。HO-CH-COOH∣CH2-COOH4.2.2苹果酸的性质以及用途4.2.2.1苹果酸的性质61化学性质苹果酸用发烟硫酸处理可氧化得到75%-80%香豆酸(2-吡喃酮-5-羧酸)。苹果酸的水溶液在Fe2+催化下与H2O2反响生成草酰乙酸。苹果酸在三氯化硼催化下，可与醇发生酯化反响，形成苹果酸酯。与多元醇，芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚树脂。苹果酸酯在氨的醇溶液中能形成苹果酸酰胺。化学性质苹果酸用发烟硫酸处理可氧化得到75%-80%香豆酸(624.2.2.2苹果酸的用途

苹果酸得最大用途在食品加工业，其次在医药行业和工业也有应用。苹果酸在食品行业的应用：〔1〕苹果酸具有明显的呈味作用，其酸味柔和、爽快，与柠檬酸相比刺激性缓慢、保存时间长，具有特殊的香味，并且不损伤口腔和牙齿等特点。〔2〕苹果酸常与人工合成的二肽甜味剂阿斯巴甜〔天冬氨酰苯丙氨酸甲酯〕配合使用，作为软饮料的风味固定剂。(3)苹果酸在医学方面的作用：由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用。4.2.2.2苹果酸的用途

苹果酸得最大用途在食品加工业，其63其它有机酸发酵工艺苹果酸课件64

①、由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，起到抗疲劳、迅速恢复体力的作用利用苹果酸的抗疲劳、护肝、肾、心脏作用可以开发保健饮料。②、代谢的正常运行可以使各种营养物质顺利分解，促进食物在人体内吸收代谢，低热量，可有效地防止肥胖，可以起到减肥的作用。③、在药物中添加苹果酸可增加其稳定性，促进药物在人体的吸收、扩散；复合氨基酸输液生产中就是利用L-苹果酸这一功能而用它来调节pH值的，同时作为混合氨基酸输液组分之一，可提高氨基酸利用率，用于治疗尿毒症、高血压等和减少抗癌药物对正常细胞的侵害，用于癌症放、化疗后的辅助药物，用于烧伤治疗可以促进伤口愈合。④、L-苹果酸可以促进氨代谢，降低血氨浓度，对肝脏有保护作用，是治疗肝功能不全、肝衰竭、肝癌尤其是肝功能障碍导致的高血氨症的良药。①、由于苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与65⑤、L-苹果酸作为治疗心脏病根底液成分之一，用于K+、Mg2+的补充，保持心肌的能量代谢，对心肌堵塞的缺血性心肌层起到保护作用。⑥、L-苹果酸是乳酸钙注射液的稳定剂，也可作为抗癌药的前体及用作动物生长促进剂。⑦、抗牙垢，苹果酸具有酸度大、味道柔和、香味独特及苹果酸的腐蚀破坏作用比较弱，相应的牙釉质磨损体积损失较小，有不损害口腔和牙齿等特点。⑧、可以改善脑组织的能量代谢,调整脑内神经递质,有利于学习记忆功能的恢复，对学习记忆有明显的改善作用⑤、L-苹果酸作为治疗心脏病根底液成分之一，用于K+、M66其他行业的应用：苹果酸具有抗氧化和较强的螯合作用，作为保色剂和增效剂，广泛用于染料工业；用由于pH值调节，因此可作牙膏及烟草的调味剂、皮肤清洁剂、焊锡助焊剂、洗涤剂、废气脱硫剂、锅炉水垢清洁剂、空气清洁剂和除臭剂，特别是去除室内鱼腥臭、香烟臭及食品贮藏室的异味，代替柠檬酸作为各种金属外表或容器的除锈剂。苹果酸是制备特殊性能聚合物的单体，用苹果酸聚合可合成生物降解塑料，有利于环境保护；在建材行业，苹果酸添加在水泥中，可缩短凝固时间，防止碱性聚合反响发生，提高混凝土的强度，代替草酸作为各种石块的外表清洗剂，使其外表变得光滑、平整、美观；苹果酸还可作为饲料添加剂，改善汽车排气质量或应用于海带养殖业。其他行业的应用：674.2.3苹果酸的生产方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的方法主要有：一步发酵法，二步发酵法，固定化细胞或酶法转化。4.2.3.1一步发酵法〔1〕一步发酵法产苹果酸菌种的选育〔2〕一步发酵法发酵工艺与条件4.2.3.2二步发酵法4.2.3.3固定化细胞或酶法4.2.3苹果酸的生产方法目前采用的和发酵或生物转化法相关的684.2.3.1一步发酵法

〔1〕一步发酵法产苹果酸菌种的选育直接发酵法主要采用的微生物是：黄曲霉、米曲霉(Aspergillusoryzae)、寄生曲霉(Asp.parasiticus)、出芽短梗霉(Aureabasidiumpullulans)等。特点：三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累。4.2.3.1一步发酵法

〔1〕一步发酵法产苹果酸菌种的选育69〔2〕一步发酵法发酵工艺与条件

一步发酵法又称直接发酵法，即采用一种微生物直接发酵糖质原料或非糖质原料（如正构烷烃）生成L-苹果酸的方法。以糖类为原料，由黄曲霉、米曲霉等直接发酵生产苹果酸〔2〕一步发酵法发酵工艺与条件

一步发酵法又称直接发酵法，即70金其荣等选出的黄曲霉T2803菌种，经诱变剂联合处理后经，获得株产酸较稳定的菌种TH5007。可用薯干粉经α-淀粉酶液化后作初糖进展发酵，而在发酵中间参加葡萄糖，使总糖到达13%，发酵产L-苹果酸达7.33%，扣除杂酸，对糖转化率为56.4%，发酵强度1g／(L．h)的结果。刘建军等人从土壤中别离出几株直接利用糖质原料生产L-苹果酸的黄曲霉菌株，经紫外线、亚硝基胍,Co60,硫酸二乙脂等诱变处理、高酸和高渗透压平板别离，获得一株L-苹果酸高产突变株黄曲霉HA5800，以100g/L的葡萄糖为碳源,35℃,200r/min摇瓶发酵120h,L-苹果酸产率稳定在72g/L以上，糖酸转化率达74.23%。传代实验证明该菌株产酸性能稳定吴清平等人以曲霉菌LMO2为出发株，选育出Nl-14、NEUl2、Nul416和Nul419。其中N1-14菌种可以蔗糖、液化淀粉、甜菊糖为碳源，最大发酵体积为20m3，发酵120h产L苹果酸酸85.8g／L并己取得了中国专利(CN1112160)。以色列Battat等人报道黄曲霉(ATCC13697)以葡萄糖为碳源，16升发酵罐发酵，以葡萄糖为碳源，16升发酵罐发酵，通过条件优化培养190小时，产酸高达11.3%。这些微生物最大的特点就是三羧酸循环中苹果酸到草酰乙酸这一步的苹果酸脱氢酶缺失或处于低水平使得苹果酸得以积累。

金其荣等选出的黄曲霉T2803菌种，经诱变剂联合处理后经，获71控制条件①生孢斜面培养基：麦芽汁琼脂斜面②锥形瓶培养基：麦芽汁，33℃静止培养2～4d③种子培养基(g/L)：葡萄糖30，豆饼粉10，K2HPO4·3H200.2，MgSO4·7H2O0.1，NaCl0.01，FeSO4·7H2O0.5，CaCO360(单独灭菌)，MnSO4·H2O1.2控制条件72④发酵培养基采用葡萄糖70～80g/L，其余成分与种子培养基一样。种子培养基分别参加种子罐补足水量，参加泡敌(50L培养基参加20ml)抑制泡沫生成。并缓慢搅拌，0.1MPa实罐灭菌20～30min，冷却至35℃左右参加已灭菌的CaCO3，并接种黄曲霉锥形瓶种子，在33～34℃，180r/min搅拌培养、通气量0.15～0.3vvm，培养18～20h后接入发酵罐。发酵罐培养基配制同上法,灭菌后降温至34℃时，接入10%种子培养液，通气搅拌进展发酵。发酵时控制温度33～34℃，通气量0.7vvm，搅拌转速180r/min，自动流加泡敌控制泡沫生成，发酵周期约40h。待残糖降到1.0g/L时，放罐提取。④发酵培养基采用葡萄糖70～80g/L，其余成分与种子培养基73金其荣使用薯干粉液化为碳源，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工序，有利于降低生产本钱。薯干粉液化液分批发酵，不补加糖，发现初糖浓度9.7%时产酸最高。初糖浓度过高或过低，都不利于发酵产酸和转化率。吴清平等筛出的曲霉菌诱变株N1-14也具有糖化酶活力，也可以淀粉液化液为碳源发酵生产L-苹果酸。不同菌种对氮源的要求不同。例如金其荣等用的氮源对产L-苹果酸的影响研究中，无机氮源，NaNO3和NH4NO3不利于产酸。0.5%豆饼粉效果较好，且较为经济。豆饼粉用量为0.3-0.5%,产L-苹果酸最为理想，发酵液中总酸达7.0%左右。玉米粉中也含有一定量的氮源，而且玉米粉中也含有65%左右的淀粉。玉米粉用量低于0.5%时，对产酸不利。一般采用1.0%-1.5%玉米粉，此时也可扣除初糖的用量。无机盐成分经实验证明，K2HPO4,KH2PO4,FeSO4,MgSO4,MsSO4等对产酸有一定的影响。在正交实验中，用高压液相色谱进展分析时，初步认为KH2PO4和K2HPO4浓度为0.015%-0.02%，以0.015%时为最正确。表8.2.6列出了N1-14菌种20m3发酵罐数据。金其荣使用薯干粉液化为碳源，因此菌有糖化酶活力，可省去制糖工744.2.3.2二步发酵法二步发酵法即采用两种不同功能的微生物，其中之一先将糖质或其他原料转化生成富马酸〔延胡索酸〕，另一种微生物将富马酸转化成L-苹果酸。二步发酵法，由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率相对较低，副产物较多4.2.3.2二步发酵法二步发酵法即采用两种不同功能的微生物75蒋明珠等从41株根霉属菌株中选出产富马酸能力最高，同时产生局部L-苹果酸的菌株R25，经鉴定为无根根霉〔Rhizopusarrhizus〕,再用具有高富马酸酶活力的普通变形杆菌〔Proteeasvulgaris〕P1.可将富马酸转化为L-苹果酸。无根根霉菌株R25在含有12g/dL葡萄糖的培养基中,31℃培养3天，完成了富马酸的发酵。然后将在液体培养基中31℃培养2天的普通变形杆菌P1接入，在同样的条件下发酵2天，L-苹果酸的产量可达5.48g/dL。在含有18g/dL薯干粉培养基中发酵，能得到一样的产量，产物经别离提纯为白色结晶，经纸色谱，红外光谱鉴定为苹果酸。蒋明珠等从41株根霉属菌株中选出产富马酸能力最高，同时产生局76华侨大学的胡纯铿等人采用A-23菌株和V-81菌株混合培养发酵L-苹果酸，分别探讨碳源浓度对A-23菌株和V-81菌株发酵水平的影响。实验说明，A-23菌株产延胡索酸能力强。V-81菌株具有高活性的延胡索酸酶，研究A-23菌株和V-81菌株混合培养方式对发酵L-苹果酸的影响，结果说明A-23菌株接入含有150g/L葡萄糖的混合发酵培养基中培养3d,后接入V-81菌株并继续培养2天，产酸水平最高，L-苹果酸浓度达73.3g/L,对糖的转化率达65.6%。华侨大学的胡纯铿等人采用A-23菌株和V-81菌株混合培养发77

N1-14菌种20m3发酵罐数据N1-14菌种20m3发酵罐数据784.2.3.3固定化细胞或酶法利用具有高活性富马酸酶的微生物细胞或富马酸酶，采用固定化酶或细胞反响器，将富马酸转化成L-苹果酸。虽然固定化细胞和固定化酶均有应用，但由于酶的提取技术复杂，收率不高，本钱昂贵，因而在实际生产中多用固定化细胞。采用的载体主要有藻酸钙凝胶，角叉菜胶及聚丙烯酰氨凝胶等4.2.3.3固定化细胞或酶法79有富马酸酶活力的菌种有：产氨短杆菌〔Brevibacteriumammoniagenes〕，黄色短杆菌〔Brevibacteriumflavum〕，假单胞杆菌〔Pseudomonasfumarase〕，膜噗毕赤酵母〔Pichiamembranaefaciens〕，皱褶假丝酵母〔Candidarugose〕，马棒杆菌〔Corynebacteriumequi〕，大肠杆菌〔E.coli〕，普通变形杆菌〔Proteeasvulgaris〕，荧光假单胞菌〔Pseudomonasfluorescens〕，枯草芽孢杆菌〔Bacillussubtilis〕和八叠球菌〔Sarcinavarihils〕。含有较高活性富马酸酶的微生物有短杆菌，产氨短杆菌，黄气短杆菌，解脂假丝酵母和温特曲霉等。有富马酸酶活力的菌种有：产氨短杆菌〔Brevibacteri80黄腾华和王雪根，以富马酸铵为酶反响底物，选用黄色短杆菌，在16L发酵罐中培养20h，酶活力到达40000单位。12L发酵液得到的菌体制成容积为16L的固定化细胞，取其中8L装成反响柱，在37℃每天流过14%的富马酸铵溶液100L，可产L-苹果酸12.5%，质量转化率近89.29%。杨廉婉等人以富马酸为原料采用固定化细胞的方法生产苹果酸。将发酵得到的微生物细胞用多孔珍珠岩粉吸附再用聚乙烯醇包埋，低温固定化。固定化细胞的富马酸酶回收率90%以上，产物对底物的转化率80%以上。〔91103606专利〕黄腾华和王雪根，以富马酸铵为酶反响底物，选用黄色短杆菌，在181西德专利2450137公布了用聚丙烯酰胺凝胶包埋产延胡索酸酶的微生物细胞生产苹果酸的方法。Yamamoto等也报道了用相似的方法固定化产氨短杆菌连续生产苹果酸的方法。Takata报道了用卡拉胶包埋黄色短杆菌连续生产苹果酸的方法。中国专利92107642也描述了用卡拉胶包埋黄色短杆菌生产苹果酸的方法。其它有机酸发酵工艺苹果酸课件82该方法的劣势：生产本钱较高以化学合成原料富马酸生产的苹果酸存有疑虑，从混合液中把苹果酸和富马酸彻底分开难度较大，产品质量很难到达出口要求所以这种方法生产苹果酸也具有一定的局限性。该方法实施现状日本自二十世纪70年代开场使用这种工艺小批量生产L-苹果酸，但开展不快，产量至今不大。我国八十年代末九十年代初，固定化酶或细胞转化法生产L-苹果酸的研究到达了高潮，全国各地相继建立了多条生产线，但由于固定化酶的转化率低，半衰期短，国产富马酸质量不稳定，生产本钱相对较高，该方法的劣势：83对该方法的研究:固定化细胞酶活力稳定性的研究固定化方法的选择，主要包括固定介质，细胞浓度，胆汁酸和胆氧胆酸浓度，温度，底物浓度和pH值等因素。对该方法的研究:84⑴固定化黄色短杆菌生产L-苹果酸流程

⑴固定化黄色短杆菌生产L-苹果酸流程85此工艺一般包括两步：一是固定化细胞的制备：将产酶菌株培养成熟后，收集菌体细胞，包埋菌体，制备固定化酶或细胞，通常在37℃条件下运行，转化半衰期可达160天左右；二是L-苹果酸制备：先将富马酸和CaCO3反响转化为富马酸钙，经提取得L-苹果酸。目前这种方法生产苹果酸的转化率可达98%以上，此工艺一般包括两步：86⑵斜面培养基普通肉膏琼脂培养基⑶摇瓶种子培养基(g/dL)柠檬酸二胺2.0～3.0,玉米浆2.0～4.0,KH2PO4·3H2O0.2，MgSO4·7H2O0.05，尿素0.2，pH7.0，0.1MPa灭菌20min。⑷发酵培养基(g/dL)葡萄糖1.5，玉米浆1.5，富马酸0.4，KH2PO4·3H2O0.1,MgSO4·7H2O0.05,尿素0.2,pH6.7～7.0,0.1MPa灭菌20min。⑵斜面培养基普通肉膏琼脂培养基87⑸发酵过程肉膏斜面菌种活化无菌水洗下1000ml摇瓶(内装300ml摇瓶培养基)

发酵罐每隔2～4h取样测定。30℃16～24h少量无菌水洗下转接至克氏瓶肉膏琼脂表面上24h30℃摇床16～24h30℃12h30℃⑹收集活菌体发酵结束后经16000rpm离心15min，生理盐水洗涤活菌体2次，每次洗涤离心15min，发酵液中菌体浓度为3%～4%，每次1g温菌体的酶活力为2.0～2.5万单位。⑸发酵过程30℃16～24h少量无菌水洗下转接至克氏24h388⑺菌体包埋以8g湿菌体加8ml生理盐水将菌体制成悬浮液,放在温水浴内,加温使品温达40～45℃备用。取1.5gK-卡拉胶加34ml蒸馏水，放在70～80℃热水浴中搅拌，待卡拉胶充分溶胀后，慢慢冷却至品温45℃，立即将保温的细胞悬浮液，迅速倒入卡拉胶液中,不断搅拌10min，等其冷却成型，放置2～10℃冰箱中，2h后取出，用0.3mol/LKCl浸泡4h，再切成3×3×3mm3小块，整个操作在无菌条件下进展。所得固定化细胞参加15ml由1mol/L富马酸钠内含0.3%的胆酸组成的活化液，在37℃下保温20～24h进展活化，其目的是激活富马酸的活力并抑制琥珀酸副产物的产生。活化后的固定化细胞颗粒用0.1mol/LKCl洗涤2～3次，再用无离子水洗至无胆酸为止，装柱待用。其它有机酸发酵工艺苹果酸课件89⑻上柱前的准备及酶转化工业级富马酸加NaOH配制成1∶1mol/L的富马酸钠溶液，pH7.0保温37～40℃，然后将溶液上柱转化。将底物溶液以恒速流过装有固定化细胞的反响柱,底物通过富马酸酶转化成L-苹果酸。流出液中L-苹果酸钠浓度以0.85mol/L为标准，大于此值可适当加快流速。流出液中已转化好的L-苹果酸钠占大局部,在整个反响过程中底物和柱的温度要始终保持在37～40℃。至于固定化细胞内酶活力的半衰期，据报导与菌种、固定化材料、工艺操作等因素有关,据王博彦、金其荣研究,观察6个月未见L-苹果酸产率下降的现象。1972年千火田一郎用聚丙烯酰胺包埋产氨短杆菌制成固定化细胞，装入充填柱内进展连续反响生产L-苹果酸,算出在37℃时酶活力的半衰期为52.5d。⑻上柱前的准备及酶转化904.2.4苹果酸的提取和精制工艺苹果酸的提纯：钙盐沉