植物组织培养技术第七章 植物脱毒快繁技术

第七章植物脱毒快繁技术一、病毒危害

多数栽培植物，尤其无性繁殖植物，都易受到一种或几种，甚至几十种病毒的侵染。例如，草莓染60多种病毒。并且随着培养时间的推移，侵染病毒的种类越来越多。植物病毒病原体可通过维管束传导。因此，对无性繁殖的植物来说，一旦感染上病毒之后，就会代代相传越趋严重。受病毒侵染的植物生长缓慢、畸形、产量大幅度下降，品质变劣，甚至完全丧失商品价值。病毒的危害给植物生产带来的损失很大，如草莓病毒的危害，使草莓产量严重降低，品质大大退化。葡萄扇叶病毒使葡萄减产10％~18％，花卉病毒的危害一般会影响花卉的观赏价值，其表现是花少而小，产生畸形、变色等。由于病毒对植物造成如此严童的危害，所以世界各国都积极开始重视这方面的研究。

小麦黄矮病毒病

草莓镶脉病毒西瓜病毒病烟草普通花叶病

目前，对细菌和真菌侵染的病害，可通过药物处理达到治愈的目的。但还没有治病毒的特效药。种子一般不带病毒，种子繁殖可得无毒植株。但对于无性繁殖植物，必须采取一些特殊方法脱除病毒。无病毒植株培育的意义

1.去除病毒危害，提高作物品质与产量。采用生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效。而通过组织培养的方法可以脱除严重患病毒植物的病毒种类，提高产量、质量。因此，到60至70年代在花卉、蔬菜和果树等得到广泛的应用。

2.减少环境污染，有利于保护环境栽培去病毒植物可减少药剂的使用。

二、脱毒方法

(一)

热处理脱毒（一）发现：

1889年印度尼西亚爪畦人发现，患枯萎病的甘蔗(现证明为病毒病)，放在50-52℃的热水中保持30min，甘蔗就可去病生长良好。以后此方法被广泛用于防治许多植物的病毒病。

热处理又称温治疗法。1、热处理脱毒原理：

①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。

依据病毒对高温的敏感，寄主耐高温。利用这一差异，选择适当的温度和处理时间，进行高温处理，就能使寄主体内病毒浓度降低，传递速度减慢或失去活性，而寄主细胞仍然存活，并加快分裂和生长。热处理区低温高温生长区寄主无损伤病原微生物被消除寄主被杀死BAC(1)温汤浸渍处理(2)热空气处理2、热处理脱毒方法（1）.温汤汤浸浸渍渍处处理理适用用：：休眠眠器器官官、、剪剪下下的的接接穗穗或或种种植植的的材材料料方法法：50℃左右右的的温温水水中中浸浸渍渍10min至数数小小时时特点点：：方法法简简便便易易行行，，但但易易使使材材料料受受伤伤。。（2.）热热空空气气处处理理适用用：：对活活跃跃生生长长的的茎茎尖尖效效果果较较好好方法法：：将生生长长的的盆盆栽栽植植株株移移人人温温热热治治疗疗室室(箱)内，，一一般般在在35~40℃℃下处处理理几几十十分分钟钟至至数数月月。。处处理理时时间间因因植植物物而而异异，，如如香香石石竹竹于于38℃℃下处处理理两两个个月月，，其其茎茎尖尖所所含含病病毒毒即即可可被被清清除除。。马马铃铃薯薯在在35℃℃下处处理理几几个个月月才才能能获获得得无无病病毒毒苗苗。。特点点：：热处处理理方方法法主主要要缺缺陷陷是是并并非非能能脱脱除除所所有有病病毒毒。。例例如如在在马马铃铃薯薯中中，，应应用用这这项项技技术术只只能能消消除除卷卷叶叶病病毒毒。。因因此此热热处处理理需需与与其其他他方方法法配配合合应应用用，，才才可可获获得得良良好好的的脱脱毒毒效效果果。。热处处理理广广泛泛应应用用于于葡葡萄萄、、草草莓莓、、马马铃铃薯薯和和菊菊花花等等植植物物。。如如：：葡葡萄萄置置于于38℃可可去去除除扇扇叶叶病病毒毒。。热处处理理对对葡萄萄扇叶叶病病毒毒、、草草莓莓斑斑驳驳病病毒毒、、苹苹果果花花叶叶病病毒毒等等球球形形病病毒毒有有作作用用，，而而对对另另一一些些病病毒毒不不起起作作用用，，因因此此，，必必须须与与茎茎尖尖培培养养相相结结合合脱脱毒毒效效果果更更好好。。葡萄萄扇扇叶叶病病毒毒苹果果花花叶叶病病毒毒1、、茎茎尖尖培培养养脱脱毒毒原原理理2、、培培养养基基3、、茎茎尖尖培培养养方方法法4、、影影响响微微茎茎尖尖培培养养的的因因素素①外外植植体体大大小小②培培养养条条件件③外外植植体体的的生生理理状状态态（二二））茎茎尖尖培培养养脱脱毒毒植物物的的去去病病毒毒技技术术，实实质质上上就就是是采采取取不不含含病病毒毒颗颗粒粒或或病病毒毒颗颗粒粒含含量量甚甚少少的的0.1～～0.5mm带1～～2个个叶叶原原基基的的茎茎尖尖作为为外外植植体体，，进进行行微微繁繁殖殖，，使使其其培培养养成成完完整整的的无无病病毒毒小小植植株株的的技技术术。。1、、茎茎尖尖培培养养脱脱毒毒原原理理病毒毒在在植植物物体体内内分分布布不不均均匀匀，其其数数量量随随植植株株部部位位及及年年龄龄而而异异，，越越靠靠近近茎茎顶顶端端区区域域，，病病毒毒感感染染的的程程度度越越低低，，生生长长点点即即分分生生组组织织（（约约0.1-1mm）几几乎乎不不含含或或含含病病毒毒很很少少。。1、、植植物物体体病毒毒的的移移动动主要要靠靠2条条途途径径：：一一是是通通过过维维管管系系统统，，而而分分生生组组织织中中尚尚未未形形成成维维管管系系统统；；二二是是通通过过胞胞间间连连丝丝，，但但这这条条途途径径病病毒毒移移动动速速度度非非常常慢慢，，赶不不上上茎尖尖和和根根尖尖细胞胞不不断断分分裂裂和和活活跃跃的的生生长长速速度度。。2、、当植植物物细细胞胞分分裂裂DNA复制制时时，，病病毒毒DNA随着着复复制制。。因因此此，，植植物物细细胞胞分分裂裂和和病病毒毒繁繁殖殖之之间间存存在在相相互互竞竞争争。。在旺旺盛盛分分裂裂的的分分生生组组织织中中，，代谢谢活活动动很很高高，正常常核核蛋蛋白白合合成成占占优优势势，，使病毒毒无无法法进进行行复复制制。3、、茎茎尖尖中中存存在在高水水平平内内源源激激素素，可可抑抑制制病病毒毒的的增增殖殖。。4、、在在植植物物体体内内存存在在有有一一种种““病毒毒钝钝化化系系统统”，，在在分分生生组组织织中中的的活活性性最最高高，，因因而而使使分分生生组组织织不不受受侵侵染染。。分生生组组织织不不带带病病毒毒，可可能能有有4方方面面的的原因因：2、、培培养养基基一般般以以White、、MS为基基本本培培养养基基，，提提高高钾钾盐盐和和铵铵盐盐含含量量有有利利于于茎茎尖尖生生长长。。MS培养养某某些些植植物物茎茎尖尖时时，，有有些些离离子子浓浓度度过过高高应应稀稀释释。。在双双子子叶叶植植物物中中，，激激素素可可能能在在第第2对对叶叶原原基基中中合合成成，，所所以以茎茎尖尖的的圆圆锥锥组组织织生生长长激激素素不不能能自自给给，，必必须须加加入入生生长长素素与与细细胞胞分分裂裂素素，，浓浓度度要要合合适适。。在在生生长长素素中中应应避避免免用用易易促促进进愈愈伤伤组组织织化化的的2，，4-D，宜用NAA或IBA；细胞分裂素用用KT或BA；GA3对某些植物茎茎尖培养有用用。3、茎尖的培培养方法需要一台解剖镜（8-40倍倍）。剥离茎尖要迅速并尽快接种，，或在一个衬衬有无菌湿滤滤纸的培养皿皿内进行操作作，以防茎尖变干干。茎尖分生组织织由于有彼此此重叠的叶原原基的严密保保护，只要仔仔细解剖，(无须表面消消毒)就可得到无菌菌的外植体。。有时消毒处处理会增加培培养物的污染染率。即：叶片包被被严紧的芽，，如菊花、兰兰花，只须75%酒精中中浸蘸一下，，而叶片包被被松散的芽，，如香石竹、、马铃薯等，，则要用0.1%次氯酸酸钠表面消毒毒10min。兰花马铃薯茎尖长（ｍｍ）叶原基数小植株数脱毒植株数脱毒率（％）0.1215024480.272421842.90.646400离体茎尖大小小对马铃薯脱脱毒效果的影影响切取茎尖越小小脱毒效果越越好，但太小小不易成活，，过大又不能能保证完全出出去病毒，所所以茎尖大小要合合适。TheApicalMeristem剥取茎尖过程程:解剖镜下用解剖针将将叶片剥掉，，解剖针要常消消毒。当一个半圆圆球的顶端分分生组织充分分暴露出来之之后，用解剖剖刀片将带1-2个叶原原基的分生组织切切下，接到培培养基上。将将接种种的茎尖置于于22℃左右右温度下。2000-3000lx16h/d光照下培养。。由于在低温温和短日照下下，茎尖有可可能进入休眠眠；所以较高的温度和和充足的日照照时间必须保保证。微茎尖需数月月才能成功。。茎尖培养的继继代培养和生生根培养和一一般器官的培培养相同。茎尖培养脱毒毒，由于其脱脱毒效果好，，后代稳定，，所以是目前前培育无病毒毒苗最广泛和和最重要的一一个途径。4、影响微茎茎尖成活及脱脱毒的因素（1）母体材材料病毒侵染染程度被单一病毒感感染的植株脱脱毒较容易，，复合感染的的较难。（2）外植体体大小在最适培养条条件下，外植体的大小小决定茎尖的存存活率，外植植体越大，产产生再生植株株的机会也就就越多。除了了外植体的大大小之外，叶原基的存在在与否也影响分分生组织形成成植株的能力力，一般认为为，叶原基能能向分生组织织提供生长和和分化所必需需的生长素和和细胞分裂素素。（2）培养条条件在茎尖培养中中，光下培养的效果通常比比暗培养效果果好，如马铃铃薯茎尖培养养时，当茎已已长到1cm高时，光照强强度便增加到到4000lx。（3）外植体的生理理状态茎尖最好要由由活跃生长的芽上切取。。取取芽的时间也也很重要，一一般选萌动期较好。否则采采用适当的处处理，打破休休眠才能进行行。（三）茎尖与与热处理相结结合方法能克服单独茎茎尖培养时，，茎尖过小成成活率太低，，茎尖太大又又脱除不掉病病毒的缺点。。1、热处理后后取较大茎尖尖培养获得脱脱毒苗。2、取茎尖（（或茎段）培培养获得无菌菌苗。然后将将试管苗热处处理，再取茎茎尖培养获得得脱毒苗。（四）其它途途径脱毒1、愈伤组织织培养脱毒2、茎尖微体体嫁接3、化学疗法法脱毒1、愈伤组织织培养脱毒愈伤组织细胞胞带病原菌不不均一，部分分细胞不带病病毒，由这些些细胞再生的的植株是无病病毒的。多次次继代的愈伤伤组织中病毒毒含量下降，，甚至检测不不出病毒。愈伤组织的某某些细胞不带带病毒原因：：1、病毒的复复制速度赶不不上细胞的增增殖速度；2、有些细胞胞通过突变获获得了抗病毒毒的抗性。愈伤组织脱毒毒的缺陷是植植株遗传性不不稳定，可能能会产生变异异植株。理由：①病毒的复制制速度赶不上上细胞的增殖殖速度；②有有些细胞通通过突变获得得了抗病毒的的抗性。缺点：植株遗传性不不稳定，可能能会产生变异异植株（二）茎尖微微体嫁接概念：将无病毒茎尖尖（0.4~1.0mm）嫁接在培养养基上培养的的实生砧木上上，以获得脱脱毒苗木的技技术。适宜：茎尖培养难难以生根的植植物，如桃、、柑橘、苹果果等无病毒茎尖来来源：成年无病毒植植物、温室培培养的植物、、热处理植物物和脱毒试管管苗。（三）化学疗疗法脱毒许多化学药品品(包括嘌呤、嘧嘧啶类似物、、氨基酸、抗抗菌素等)对离体组织和和原生质体的的培养具有脱脱毒效果。常用的药品有有：8-氮鸟嘌呤、2-硫脲嘧啶、杀杀稻瘟抗菌素素、放线菌素素D、庆大霉素等等。例如，将100ug2-硫脲嘧啶加入入培养基可除除去烟草愈伤伤组织中的PVY(马铃薯病毒)。三、脱毒快繁繁材料的选择择应注意以下几几点：1）品种要可可靠2）要选择经经当地栽培确确认的高产优优质的品种来来作为脱毒材料3）名贵的植植物良种4）植物生长长旺盛期，再再生率高，脱脱毒效果好四、植物病毒毒的鉴定1、外观判断法法2、指示植物物法3、抗血清鉴鉴定法4、电子显微微镜检查法5、酶联免疫疫鉴定法(ELISA)1、外观判断断法：带病毒株往往往叶片发黄，，凹凸不平，，畸形，可根根据这些表现现来判断。但但有些病毒表表现不明显，，仅靠这一方方法还不够。。2、指示植物物检测法：指示植物又称称鉴别寄主，，指的是对某某种或某些特特定病毒非常常敏感，而且且症状表现十十分明显的植植物。通通常不同同病毒应选用用不同的植物物。马铃薯病病毒常用指示示植物有千日日红、曼陀罗罗、豇豆、辣辣椒等。分为2种①①汁液感染法法②嫁接检测法法千日红曼陀罗豇豆3、抗血清鉴鉴定法（抗原原－抗体反应应）原理：由于病病毒是由蛋白白质和核酸组组成的，是一一种较好的抗抗原。将病毒毒给动物注射射后产生抗体体。抗原和抗抗体结合产生生血清反应。。抗原：病毒毒。抗体：是是指生物体在在外来抗原的的刺激下产生生的一种免疫疫球蛋白，主主要存在于血血清中，含抗抗体的血清称称为抗血清。。鉴定方法：抗原的制备→→→抗血清清的采收，分分离→→把稀稀释的抗血清清与未知的病病毒植物的汁汁液在小试管管内混合→→→根据沉淀反反应来鉴定病病毒种类。植物无病毒苗苗的培育3.特点：特异性高（这这种抗血清是是高度专一性性的试剂），，测定速度快快，一般几小小时甚至几分分钟就可以完完成。所以抗抗血清法成为为植物病毒鉴鉴定中最有用用的方法之一一。植物无病毒苗苗的培育4、电子显微镜镜检查法病毒有一定的的形态（球球状、杆状、、线状等）和和大小（0.01~0.3um）。采用电子显微微镜（分辨率率0.0001um）可以直接观观察病毒，检检查出有无病病毒存在，并并鉴定病毒的的种类。优点：灵敏度度高，能在植植物粗提取液液中定量测定定病毒。5、酶联免疫疫吸附测定法法(ELISA)把抗原-抗体体的免疫反应于酶的催化反应应相结合而发展展起来的一种种综合性技术术，灵敏度高高，特异性强强，发展最快快应用最广的的方法。原理：采用酶标记的的特异抗体指指示抗原-抗抗体的结合，，从而检测样样品中的抗原原定量测定法法。操作程序：将待检植物汁汁液注入酶联联板（聚苯乙乙烯多孔微量量反应板）中中，使抗原吸吸附在它的孔孔壁，加入酶酶(过氧化物物酶或碱性磷酸酸酶)标记的的特异抗体，，抗原-抗体充充分反应后，，清洗，固相相载体酶联板表面只只留下以酶标标记的抗原-抗体复复合物。加入入酶嘚无色底底物，复合物物上的酶催化化底物降解，，生成有色物物。结果可由由肉眼识别，，也可用特殊分光光光度计对底物物的降解量进进行测定。五、快速繁殖殖茎尖培养得到到的脱毒苗不不多，用于生生产需扩大繁繁殖。扩繁方法：1）组培快繁繁2）无毒苗栽栽到土壤中进进行扩繁。如如甘薯、草莓莓等利用用蔓，马铃薯薯、姜、蒜等等利用地下部部分繁殖。为为了预防病毒毒再感染，扩扩繁应在培育育温室或防虫虫罩内，因为为昆虫传播病病毒。3）两种方法法相结合，试试管内扩繁，，移栽后再扩扩繁。注意：1、培养变异异的产生，应应及时去除2、脱毒苗并并非永远是无无毒苗，由于于昆虫等的传传播，不免会会再感染病毒毒，所以要经经常脱毒，一一般脱毒苗用用1－3代。。脱毒试管苗为为原原种－－－繁殖一代为为原种－－原原1代－－原原2代六、脱毒苗在在生产中的应应用脱毒苗用于生生产可以明显显提高产量和和质量，一般般产量可提高高30％以上上。目前，甘薯、、马铃薯、草草莓、大蒜、、百合花、菊菊花、康乃馨馨等都广泛利利用脱毒苗。。小结：脱毒快快繁的一般过过程1、诊断：首首先了解供试试材料感染病病毒的种类2、茎尖培养养脱毒或结合合热处理3、鉴鉴定4、繁繁殖5、驯驯化移移植马铃薯薯微型薯马铃薯薯营养养繁殖殖时易易受病病毒浸浸染，，当条条件适适合时时，病病毒就就会在在植株株内增增殖，，转运运和积积累，，随着世世代传传递，病毒毒危害害逐年年加重重，一一般造造成减减产50％％以上上。研研究发发现，，有30多多种病病毒易易感染染马铃铃薯，，并引引起品品种退退化，，严重重影响响马铃铃薯的的生产产。通通过微微茎尖尖组织织培养养技术术能从从马铃铃薯体体内脱脱除PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒毒。全国现现有马马铃薯薯播种种面积积300多多万公公顷，，且有有逐步步增加加的趋趋势，，每年年需合合格种种薯45亿亿公斤斤，脱脱毒原原种4亿公公斤，，脱毒毒小薯薯或微微型薯薯45亿粒粒。因因此，，脱毒毒马铃铃薯推推广具具有广广阔的的市场场前景景。采用组组培技技术，，通过过一定定良种种繁殖殖体系系，生生产优优质种种薯，，是保保证马马铃薯薯高产产、稳稳产的的一项项有效效措施施。1．脱脱毒种种薯生生产程程序用微茎茎尖组组织培培养法法，诱诱导出出苗，，联免免疫吸吸附法法或指指示植植物法法鉴定定马铃铃薯病病毒，，经鉴鉴定后后无主主要病病毒的的试管管苗可可定为为脱毒毒试管管基础础苗。。一、马铃薯薯脱毒毒技术术试管基基础苗苗在无无菌条条件下下，采采用固固体、、液体体培养养基相相结合合的方方法，，进行行扩繁繁基础础苗，，在防防虫网网室栽栽植或或封闭闭温室室扦插插，生生产出出原原原种（（或称称脱毒毒小薯薯）。。用原原原种种在一一定隔隔离条条件下下产生生原种种1代代，以以后逐逐级称称为原原种2代、、良种种1代代、良良种2代。。2．茎茎尖培培养脱脱毒（1））取取材和和培养养多采用用在室室内发发芽，，芽经经热处处理(38℃)2周周。然然后取取顶芽芽或侧侧芽1cm的茎尖尖，自自来水水冲洗洗干净净，无无菌条条件下下先用用70％酒酒精浸浸润30s，再用2％次次氯酸酸钠液液浸4-5min，然后用用无菌菌水冲冲洗3次。。消毒芽芽在解解剖镜镜下仔仔细逐逐层剥剥去幼幼叶，，露出出圆滑滑的生生长点点，可可留1-2个叶叶原基基，0.2-0.3mm，，接种于于液体体培养养基:MS+BA0.5+NAA0.1+GA30.2+2%蔗糖，，pH值5.8。。培养条条件：：21~25℃℃、2000-3000lx、、12h/d。。3--6月月长成成2-3cm小芽。。(2)继继代和和生根根脱毒苗苗经ELISA（试剂剂盒））鉴定定后,采采用固固、液液培养养基相相结合合方法法扩繁。。取试试管苗苗单节节切段段扦插插，每瓶插插20个茎茎段，，20d长成5-10cm高小植植株，，继续续切段段繁殖殖，每每月可可繁5~8倍。。试试管苗苗多节节接种种进行行浅层层静止止液体体培养养。培养基基:MS+NAA0.2-0.5+D-泛酸钙钙10+3%蔗糖糖，20-25℃℃，，3000-4000LX，，14-16h/d，每3周继继代一一次，，单芽芽茎段段约1cm，，可插也也可平平放，，原则则试管管苗用用2年年-3年。。(3)驯驯化移移植3.脱脱毒毒苗切切繁基础苗苗成活活后便便可切切繁，，但切切繁量量的多多少和和质量量的高高低，，除与与水与与温湿湿度条条件有有关外外，正正确的的切繁繁方法法和适适宜的的切繁繁苗龄龄也非非常重重要。。脱毒毒苗切切繁主主要是是剪取取顶部部芽尖尖茎段段（主主茎芽芽尖和和腋芽芽芽尖尖）直直接扦扦插。。微型薯薯生产产：网室内内铺6cm蛭石，，3%撒撒可富富稀释释1倍倍，喷喷潮湿湿即可可。插前浇浇水湿湿润，，插后后浇透透。覆膜7d，湿度80%以上上，期期间喷喷水2次。。揭膜后后喷营营养液液3%撒可可富，，每周周2次次，每每周喷喷一次次0.5%硫酸酸铜，，中后后期喷喷药防防病虫虫，连连续喷喷2-4次次。苗高6-8cm培蛭石石防绿绿薯，，1-2cm厚，35-40d出现气气生薯薯，不不断盖盖蛭石石。二、马铃铃薯无无病毒毒苗的的鉴定定材料料1、指指示植植物鉴鉴定在马铃铃薯的的病毒毒鉴定定中，，汁液液鉴定定是最最常用用的方方法，，Ｘ病病毒、、Ｓ病病毒和和纺锤锤块状状病毒毒很容容易通通过汁汁液来来接种种。2、鉴鉴定寄寄主的的准备备马铃薯薯常用用的鉴鉴定寄寄主植植物有有苋科科的千千日红红，茄茄科的的洋酸酸浆、、毛曼曼佗罗罗等。。寄主主植物物应在在无虫虫网室室中培培养。。３.接接种液液制备备及接接种放置防防虫室室中，，一般般5－－10d可发病病。三、马铃铃薯无无病毒毒株的的繁殖殖和保保存通过茎茎尖培培养只只能得得到很很少的的无病病毒植植株，，而生生产上上需要要数以以万计计的健健康种种薯。。同时时无病病毒植植株并并没有有对该该病毒毒获得得免疫疫能力力，仍仍会在在繁殖殖中再再次侵侵染。。如何何在以以后繁繁殖中中防止止受病病毒再再侵染染是很很关键键的一一环。。繁殖殖主主要要:(１１)直直接接块块茎茎繁繁殖殖(２２)扦扦插插繁繁殖殖(３３)组组织织培培养养切切段段繁繁殖殖A：：继代代培培养养B：：低温温保保存存9、静夜四四无邻，，荒居旧旧业贫。。。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、雨中黄黄叶树，，灯下白白头人。。。01:12:2201:12:2201:1212/25/20221:12:22AM11、以我独独沈久，，愧君相相见频。。。12月-2201:12:2201:12Dec-2225-Dec-2212、故人人江海海别，，几度度隔山山川。。。01:12:2201:12:2201:12Sunday,December25,202213、乍见见翻疑疑梦，，相悲悲各问问年。。。12月月-2212月月-2201:12:2201:12:22December25,202214、他乡生白白发，旧国国见青山。。。25十二二月20221:12:22上上午01:12:2212月-2215、比不了得得就不比，，得不到的的就不要。。。。十二月221:12上上午12月-2201:12December25,202216、行动出出成果，，工作出出财富。。。2022/12/251:12:2201:12:2225December202217、做前，，能够环环视四周周；做时时，你只只能或者者最好沿沿着以脚脚为起点点的射线线向前。。。1:12:22上午午1:12上午午01:12:2212月-229、没有失败，，只有暂时停停止成功！。。12月-2212月-22Sunday,December25,202210、很多事情努努力了未必有有结果，但是是不努力却什什么改变也没没有。。01:12:2201:12:2201:1212/25/20221:12:22AM11、成成功功就就是是日日复复一一日日那那一一点点点点小小小小努努力力的的积积累累。。。。12月月-2201:12:2201:12Dec-2225-Dec-2212、世世间间成成事事，，不不求求其其绝绝对对圆圆满满，，留留一一份份不不足足，，