western常见问题及解决方法课件

Westernblot实验技术

Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

Western实验是一项连贯的有多个步骤的实验技术，在实验过程中会遇到很多的问题，每一个环节出现问题都可能导致最后结果的失败。蛋白提取SDS凝胶配制电泳电转封闭及一抗显色实验流程√细胞和组织的处理问题一.RIPA裂解液裂解细胞，离心后，还有很多粘稠物质？

RIPA裂解细胞后的粘稠物质主要是DNA，10000rpm以上离心五分钟就可以沉淀，取上清液。如果一次离心后还有粘稠可重复一次。细胞和组织的处理问题二.组织应该如何裂解最合适？1、对于有韧性的组织比如血管，神经等，不能选用玻璃匀浆器，可以选择手动匀浆器和液氮研磨2、对于一般较柔软的组织比如脑，肝脏等，使用上述三种方法均可。细胞和组织的处理问题三.液氮研磨后离心样本不能分层研磨的时候不充分，会形成絮状的液态物质，如有手动匀浆器可以再进行处理注意：裂解时抑制剂的添加非常重要，做一般的蛋白加入PMSF即可，个别蛋白需要加Aprotinin，Leupeptin，做磷酸化的蛋白需要加入磷酸酶抑制剂（cocktail）细胞和组织的处理问题四.提取的蛋白样本如何保存最合适？解答：温度越低越好1、液氮2、-80度冰箱3、-30度冰箱4、加入loadingbuffer煮后保存于-20度。SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。2、按前面方法配10％分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。4、按前面方法配5％的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

SDS凝胶配制问题一.胶凝的效果不好是什么原因？1、AP时间过长，重新配制AP2、可以适当多加入TEMED3、室温低4、混合不均匀蛋白提取SDS凝胶配制电泳电转封闭及一抗显色实验流程√电泳电泳时间一般2～3h，电压为根据分子量需要，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。电泳问题一.如果所做蛋白分子量很大，比如220KD，大分子的Marker跑不下去，怎么办？小分子量的蛋白如10KD左右应该注意什么？

大分子：使劲跑；小分子：谨慎跑电泳问题二.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。也可能母液（30%聚丙烯酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察

电泳问题三.怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道和band都能很直，是不是上样的量很重要，灌胶有什么技巧吗？想跑漂亮，是不是应该先小电压，再高电压?

影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶，使胶不均匀。

电泳问题四：电泳时上样量应为多少？

这个没有确切的定值，一般来说20微克就可以，但是如果你的样品中目的蛋白含量很少，可以加大上样量到60微克甚至更高（进行预实验）蛋白提取SDS凝胶配制电泳电转封闭及一抗显色实验流程√膜的选择还要考虑到目的蛋白分子量的大小，如果目的蛋白分子量为20KD以下，最好用0.22微米的膜，大于20KD可以选择0.45微米的膜。电转电转

问题二.电转时膜、滤纸、胶大小有何讲究？

如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。蛋白提取SDS凝胶配制电泳电转封闭及一抗显色实验流程√封闭及一抗问题一.封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?

均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。封闭及一抗问题二.一抗的浓度为多少合适？

不同的抗体效价是不一样的，一些好的公司的抗体可以稀释到1：1000或更多，一般的抗体稀释比例为1：200——1：500,如果低于这样的稀释比例，说明抗体质量太差。封闭及一抗问题四.封闭液的选择有什么区别吗？

一般用BSA或者脱脂奶粉脱脂奶粉封闭后背景比较干净，而检测磷酸化蛋白则用BSA（因脱脂牛奶含有较多的磷酸化蛋白，会形成干扰）蛋白提取SDS凝胶配制电泳电转封闭及一抗显色实验流程√显色问题一.发光液用DAB显色好还是用ECL好？

一般的说，ECL比DAB更灵敏，从实验的结果来看，个人认为ECL更好一些。（选择进口发光液）显色问题二.加上ECL发光液能看到很亮的条带，而放入显影液和定影液洗完后，却发现条带很模糊，这是为什么？

显影液使用次数太多，已经失效。更换新的显影液。显影液在使用数次后会发黄，这时要及时更换。而定影液只要是清亮的就可以一直用。（注意避光保存）显色问题三.背景很脏是什么原因？1.没有洗干净（使用PBST或者TBST）2.一抗浓度过大，可以降低一抗浓度3.二抗浓度过大4.封闭时间短5.抗体稀释液效果不好显色问题四.同一张膜如何进行蛋白的反复检测？使用膜修复液洗15-30分钟，再用PBST或TBST洗3×10min。然后再封闭，加一抗。一般每张膜可以反复检测4-5次。显色NC膜是通过疏水作用来和蛋白质