DNARNA蛋白质等各种生物物质的保存

各种生物活性物质的保存Experience2009-08-1616:34:36阅读336评论0字号：大中小订阅DNA、RNA、蛋白质、抗体和探针的保存方法：（网上搜索，仅供参考A_A）1.DNA短期保存，两年之内吧，无菌水和TE缓冲液是ok的。如果是长期保存，比如10年20年的话，我推荐你刚提取好的DNA直接保存到乙醇里，放—20°,1放年没问题。需要用的时候，再离心后，弃去乙醇，加水或TE溶解即可。长期保存用TE,DNA本来就是酸性，所以需要弱碱性环境保存，如果用中性或者酸性环境保存容易降解。保存两年应该会降解的！还是不要超过两年，再一年内都有降解的可能，所以还是要尽快的利用了。做成干粉不太可能，哪里有那么多的量！还是在-80度以下保存吧，也要避免反复冻融。如果DNA很纯的话，应该影响不是很大啊，有文献报道高纯DNA的最佳保存条件是4度，你也可以应证一下你的DNA有没有降解啊，跑个电泳看看啊，如果出现smear,就不要用了啊！提纯的DNA放在4度一段时间（数周-数月）都没问题。但是长期保存建议-20度，并且浓度不要稀释的太低，否则容易降解。2.RNARNA若要长期保存，需沉淀下来后置于无水乙醇冻在-70度，用的时候再离心下来除去无水乙醇，用DEPC水溶解。保存RNA应该尽量低温。为了防止痕量RNase的污染，从富含RNase的样品（如胰脏、肝脏）中分离到的RNA需要贮存在甲醛中以保存高质量的RNA,对于长期贮存更是如此。从大鼠肝脏中提取的RNA,在水中贮存一个星期就基本降解了，而从大鼠脾脏中提取的RNA,在水中保存3年仍保持稳定。另外，长度大于4kb的转录本对于痕量RNase的降解比小转录本更敏感。为了增加贮存RNA样品的稳定性，可以将RNA溶解在去离子的甲酰胺中，存于-70C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的杂物。来源于胰脏的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。当准备使用RNA时，可以使用下列方法沉淀RNA:加入NaAc至0.3M,12,000Xg离心5分钟。RNA即使是放在-80度下也会降解，所以最好的保存方法是将RNA逆转成cDNA后保存。提取的RNA保存在DEPC处理的水中，加入RNAse抑止剂，在-80度保存2个月，应该是可以保证不降解的。最好是反转录后保存。一旦生物样品被收集采摘，离体组织的RNA会立刻变得非常不稳定，极易被降解。由于特异及非特异的RNA降解，或者由于样品采集过程中的应激反应产生新的RNA都会引起RNA状态的改变。对于生物芯片、基因表达矩阵分析(ArrayAnalysis)、定量RT-PCR等实验来说，采样后立即稳定样品里的RNA以保存当时RNA的表达状态，是精确/定量研究基因表达分析的重要前提。记得以前学植物遗传的同学常常要带着液氮罐，骑着单车到田里采样一一那个液氮罐的盖子有点问题，一颠就冒白烟，吓得一路上行人、车辆纷纷躲避，很是招摇，据说有一次觉得液氮不够了，赶着坐出租回来，那可是连哄带骗才上了的士，到学校时司机已经紧张得面无人色了一一这真令贪玩的我们非常羡慕，只恨这等趣事怎么就落不到我们头上。对当事人来说，每周一次带着液氮罐到处跑实在不算一种有趣的经历。没有办法，为了保持样品的RNA完整真实，要么当场提RNA,要么液氮保存，一直如此。不过自从有了RNAlater,这种有趣的场面就会越来越少了。RNAlater是特殊的样品储存液，只要在采样后立即将新鲜样品浸入这种液体试剂，RNlater可以迅速渗透到组织或其他生物样本中，稳定并保护RNA完整而不被降解，确保下游分析得到的数据真实反应样品的表达信息。样品储存液中保存的新鲜样品可以在不超过37度的高温天气下保存一天，或者在25度室温下保存一周；或者4度冰箱存放一个月；或者负20度长期保存而使RNA保持完整免受降解。这种技术为在不同温度和不同地点下的采样、运输和保存样品提供了极大的方便，同样适合手术/解剖过程中部分样品的保存。RNAlater的用法非常简单，只要在采样后立即将样品完全浸入适量(10ul/1mg组织或者5倍体积)的RNAlater中即可。取样的动作要尽量快速利索，组织样品的大小以厚度不超过0.5公分为宜。对于一些小的组织如小鼠的脾、肾等器官则可以整个取出浸入溶液中，较大的则应切开为厚度小于0.5公分的小块，以确保RNAlater能迅速扩散渗透入组织块中的所有细胞中。采样的容器应该足够大以容纳10倍于组织重量的溶液，避免组织块挤在一起，同时建议将溶液加满容器以避免在运输过程中组织块露出液面。保存在RNAlater中的样品RNA可以：37C下稳定保存1天18-25C保存7天2-8C稳定4周-20C永久保存3.蛋白质辛辛苦苦纯化得到的那么一点蛋白，可千万不能因为不懂得怎么保存而白白浪费了！选择什么样的贮存方法取决于该蛋白的稳定性和你打算保存多长时间以及下一步你打算如何利用。一般来说，蛋白溶液应避免极端的pH（强酸or强碱），同时也不能接近其等电点的pH。另外，还应该避免其他物质的掺入。如果保存时间在24h以内，大多数蛋白可以放置到4C。如果保存时间在24h以上，应该考虑避免蛋白溶液长菌，可以事先过滤一下（througha0.22mmfilter）或者加入抑菌的物质（如叠氮化钠）。如果保存时间超过一周，则应该将蛋白溶液冷冻起来。通过液氮或干冰冷冻的方法使蛋白溶液迅速冷冻，可以有效避免蛋白的变性。为避免多次冻溶致使蛋白活性降低或变性，应该将蛋白溶液分装保存,一次用多少就取多少。除此之外，还可以加入一些甘油(5-50%(w/v))或者血清(10mg/ml)帮助目的蛋白保持稳定。如果打算保存数月之久，则需要将其放置于-20C,此时要加入一定量甘油，避免“冻伤”。另外，还可以用硫酸镂将蛋白沉淀置于4c保存(损失较多，不建议采用)；也可以将蛋白以干粉状态保存(保存时间最久)。新提取的蛋白可以分装存在-80度冰箱，保存（保险系数）1年，如果加入buffer煮过的蛋白在-20保存。最好提取的蛋白，一部分保存，一部分立刻加Buffer煮，做实验。蛋白的稳定性及保存方法一一PIERCE公司技术资料Proteinscompriseanextremelyheterogeneousclassofbiologicalmacromolecules.Theyareoftenunstablewhennotintheirnativeenvironments,whichcanvaryconsiderablyamongcellcompartmentsandextracellularfluids.Ifcertainbufferconditionsarenotmaintained,extractedproteinsmaynotfunctionproperlyorremainsoluble.Proteinscanloseactivityasaresultofproteolysis,aggregationandsuboptimalbufferconditions.Purified

canvaryfromaproteinsoftenneedtobestoredforanextendedperiodoftimewhileretainingtheiroriginalstructuralintegrityand/oractivity.Theextentofstorage'shelflifecanvaryfromafewdaystomorethanayearandisdependentonthenatuoftheproteinandthestorageconditionsused.Optimalconditionsforstoragearedistinctivetoeachprotein;nevertheless,itispossibletosuggestsomegeneralguidelinesforproteinstorageandstability.Commonconditionsforproteinstoragearesummarizedandcomparedbelow.Generally,therearetradeoffsassociatedwitheachmethod.Forexample,proteinsstoredinsolutionat4Ccanbedispensedconvenientlyasneededbutrequiremorediligencetopreventmicrobialorproteolyticdegradation;suchproteinsmaynotbestableformorethanafewdaysorweeks.Bycontrast,lyophilizationallowsforlong-termstorageofproteinwithverylittlethreatofdegradation,buttheproteinmustbereconstitutedbeforeuseandmaybedamagedbythelyophilizationprocess.

YflldpLCompHiisaiofP*v*dll(iornpvCandiiiKItMr>rmtC小Hei（1|*鼬旧出1L.k:-0—Fraaw-30^toMinL}mpbilua>d上।jhifiiMvik1>1iHfUf*tcnDnib1YtJrsRfqirim«4*riJr修。用itmiM¥c>L^uiUyXo3mjH*“wkb+Obm：Epwl/Will.□rot；iihlyui^ihfct5叫hBUlJlIpkI1I1JC!!□Mr1.Uoi旧[即nProtvnscliduliiiar；PioHmfIklnbllorProlf>eW4rlciu^foufrutrAriouPMKFS^lUidpiOWclrf-iHeivfintidiiieSennejwaten^1nAIAAndpi叫ek1US.nd[jrupqjliHTIupL|gtCHfaCS1匿i\dAprndinnSerine包f《卜/ill!匐面加IITluolpiai*141p.gudEDTAwdEOTA乂矶川loiiTQlWMyOJIttM问：纯化后的蛋白质4度保存约15天，怎么分子量发生了变化？答：蛋白质样品如果是溶液状态的，在4度下顶多保存一个礼拜。15天太长了。估计分降解成很多小蛋白。电泳时出现很多条带。在-20度也就是保存一个月。最好的保存办法还是将蛋白样品冻干成粉末。保存，这样保存的时间会很长。如果条件不具备，-70度也可以。蛋白样品最忌讳反复冻融。答：蛋白保存应根据对活性的要求及蛋白的种类而定：抗体：除非一些公司特别要求-20C冻存，一般4c可稳定一年（无菌，如加叠氮钠），因为抗体是一种具有非常稳定结构的蛋白；要求具有活性的蛋白，最好根据需要小量保存4c（一周）、-20C（一个月）、-80C（六个月）、液氮（基本无限期），反复冻融会导致诸多不良后果，如聚集、修饰、降解、污染等（取决于蛋白浓度、缓冲液成分及蛋白本身的特点）；冻干是一种很好的长期保存法（如条件具备），在大多数情况下可以很好地保存蛋白的活性，但不适于某些蛋白（因有些蛋白对冻干重溶时必然产生的盐离子浓度的急剧变化反应不佳，其活性会永久丧失（应具体对待，尚无规律可循）。另：蛋白聚集与二硫键形成是两个概念，航基乙醇只负责维持-SH的游离状态，形成二硫键是一化学反应，产生纯净物，聚集一般只通过一些离子键、范德华力、疏水力形成，可以用物理方法分开。答：较长时间的保存最好用DTT。在加入缓冲液中24小时内，航基乙醇被氧化，其后可加速蛋白的失活，而DTT不危及蛋白质的航基。因此，最好是在制备蛋白质样品的时候用大约12mmol/L航基乙醇，而长期储存则使用1-5mmol/L的DTT。（见《蛋白质技术手册》）另外，我有印象看产品目录的时候，看到有一种用于western的试剂盒，提供的试剂可以在还原二硫键之后在航基上烷基化，这样就防止了二硫键的再次生成。.抗体抗体储存容器应由不吸附蛋白质的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如储存的抗体中蛋白浓度很低（10-100Mg/L），就应另加隔离蛋白以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应存在4C-8C条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20C条件下，并避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，应将污染的抗体溶液及其他试剂弃之。为防止细菌污染，可于抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20C以下可保存3-5年。保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠浓度。大多数稀释抗体可进行冷冻保存，少数抗体可能会丢失抗原活性。大多数单抗，只要蛋白浓度适当，可在4c下保存数月。其他注意事项：分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4oC,避免再冻起来！抗体工作液应该当天配制当天用完，在4oC尽量不要超过1天。绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上。无论是保存还是运输，绝对避免反复冻融！反复冻融会导致抗体变性，导致多聚体形成，从而降低抗体的结合能力!蛋白在高浓度时更不容易降解(1mg/ml或者更高)，这就是为什么在抗体中加入BSA之类作为稳定剂的原因了；另一方面，加入的蛋白也可以减少抗体由于管壁吸附所造成的损失。但是如果抗体要用来标记的话，则不能加入蛋白稳定剂，因为这些稳定剂会和抗体一起竞争结合标记物。为了防止微生物污染，叠氮化钠经常被加入到抗体中(终浓度0.02%(w/v))。叠氮化钠会干扰任何含有氨基基团的偶联，因此在进行偶联之前，应将叠氮化钠去除。偶联后的抗体可以加入叠氮化钠保存，但是浓度只能是0.01%。对于需要偶联的抗体，thimerosal(merthiolate)可以替代叠氮化钠作为保护剂！注：叠氮化钠的去除方式：可以通过凝胶电泳或过滤的方式去除！IgG的分子量是150kDa(IgM是〜600kDa);叠氮化钠的分子量只有65Da。使用cutoff14kDa的滤膜即可将叠氮化钠从抗体中去除。纯化IgG:不要保存稀释的抗体，高浓度有利于保存。IgG会粘附于玻璃或塑料，低于0.1mg/ml的蛋白会很快被吸收并变性失去活性。F面是我的读书笔记，内容全部摘录自《UsingAntibodies»这本书。该书中专门有HandlingAntibodies这样一个章节，对于像我这样的入门级还是很有启发的。首先要树立的一个观念是“抗体可一点儿都不脆弱，很强悍的”“Antibodieshaveacompactthree-domainstructurethathasevolvedtoretainactivityinmostbiologicalsettings.Onepracticaladvantageofsuchcompactandstableproteindomainisthattheyareresistanttoabroadrangeofmildlydenaturingconditions,makinglong-termstorageofantibodiesrelativelyeasy.Storagebuffersseldomneedtobesupplementedwithglycerolorotherstabilizingcompoundsthatarecommonlyaddedtohelpmaintaintheactivityofproteinspurifiedinthelab.”经常使用的抗体可以4c保存；长期保存可以置于-20C。“Workingsolutionsofantibodiesareconvenientlystoredat4c.Atthistemperaturetheyarestableformonthstoyearswithoutlossofactivity.Forlong-termstorage,antibodiescanbekeptconvenientlyat-20℃intheserum,tissueculturesupernatant,orasciticfluidinwhichtheyarecollected.Lowertemperatureswillnothurttheantibodyactivities,butthereisnosignificantadvantageinlower-temperaturestorage.”也有例外，不是所有抗体在4c都稳定，有些得在常温保存Theonlygroupofantibodiesthatshouldnotbestoredat4aretheso-calledcryoproteins,whicharesensitivetolow-temperaturestorage,wheretheyprecipitate.SomemouseantibodiesoftheIgG3subclassmayfitthesecharacteristics.Ifantibodiesprecipitateat4Covertime,theyshouldbekeptatroomtemperaturewithadditionofsodiumazide.”尽管抗体很稳定，还是要避免反复冻融，因为它可能造成抗体活力的丧失。原因是……“Antibodysolutionsshouldnotbefrozenandthawedrepeatedly,becausethiscanleadtodenaturationofantibodiesthatmayleadtounwantedprotein-proteinaggregation.Aggregationofantibodiescancausethelossofactivityduetostericinterferenceoftheantigencombiningsiteorbygeneratinginsolublematerialthatislostduringcentrifugationorfiltration.”抗体到底可以保存多长时间？什么？十年？“Antibodiesareremarkablystable.Iftightlysealedtoavoidevaporation,theycanbestoredat4Cformonthswithnolossofactivity.Antibodiesstoredat-20Chavebeenshowntokeeptheiractivityfordecades.这么强悍！那，抗体到底怕什么?Theonlyproblemcommonlyencounteredinstoringantibodiesiscontaminationofthesesolutionswithbacteriaorfungi.Thiscanbepreventedbyadditionofantimicrobialagents;forexample,byaddingsodiumazideto0.02%or,asanalternative,Merthiolateto0.01%.”何时需要添加叠氮化纳？什么时候又不能添加？“Althoughusefulandeffectiveformostsettings,sodiumazideisnotappropriateinsomeassays,becauseitblocksthecytochromeelectrontransportsystemandthereforeistoxictomostorganisms.Inaddition,theprimaryamineontheazidewouldattackthestabilityoftheantibody'sinteractionwithconjugateormatrixincouplingmethods.Ifsodiumazideisalreadypresentinasolution,itcanberemovedbydialysisorgelfiltration.”自己纯化的抗体，保存的时候要注意