ELISA试验操作中常见问题分析

ELISA实验操作中常见问题分析严峻溶血，以HRP为标记的ELISA测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。2、试剂的阻碍a.分子量大。合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。合成多肽抗原是按照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小；b.一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%;标记酶的活性及显色液的稳固比较差。使用质劣的试剂必定导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。?选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。?要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。最好选择刚出厂的试剂使用。不同厂家的试剂不能混用不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的咨询题。3、操作技术的阻碍⑴严格按照试剂讲明书进行操作。操作前将试剂在室温下平稳30〜60min。⑵加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按讲明步骤严格操纵操作时刻，防止孵育时刻人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗完全。(3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周边现象从而导致“花板”的显现。(4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择洁净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”的显现。(5)合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时刻长。(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。(7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用。(8)加样时保持显色剂不外流；A、B液应幸免接触金属器械。加终止液时应幸免产动气泡。(9)应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以上的措施能够使“花板”降至最低限度。从而提升检测的特异性。并得到更准确、可靠的实验结果。加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直截了当阻碍检测结果。由于吸嘴构造专门，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，幸免加在孔壁上部，并注意不可溅出。洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验的成败。ELSIA确实是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。能够讲在ELISA操作中，洗涤是最要紧的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严格按要求洗涤，不得马虎。保证洗板浸泡时刻为40秒左右，孔内液体被洗板机吸得越洁净洗涤成效更好，手工洗板.显色和比色TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，赶忙逐步减弱，至2小时后即可完全消退至无色。TMB的终止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶抑制剂均可使反应终止。这类终止剂尚能使蓝色坚持较长时刻（12-24小时）不褪，是目视判定的良好终止剂。此外，各类酸性终止液则会使蓝色转变成黄色，现在可用特定的波长（450nm）测读吸光值。酶标比色仪简称酶标仪，通常指专用于测读ELISA结果吸光度的光度计。酶标仪的要紧性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范畴、线性等等。优良的酶标仪的读数一样可精确到0.001,准确性为士1%,重复性达0.5%。酶标仪不应安置在阳光或强光照耀下，操作时室温宜在15-30C,使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳固。测读A值时，要选用产物的敏锐吸取峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，第一次在最适波长（W1）,第二次在不敏锐波长（W2）,两次测定间不移动ELISA板的位置，最终测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可减少由容器上的划痕或指印等造成的光干扰。肉眼判定结果时，显色浅不易观看，阻碍结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。.HooK效应阻碍随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。阻碍检测结果，采纳同步稀释测定或使用线性范畴高的两对半定量法能够减HooK反应的发生。.干扰物质的阻碍有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，能够不同程度阻碍检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig(s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成假阳性，采纳56c30分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP(如孕妇)，在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深阻碍检测结果。.药物的阻碍高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，阻碍HBsAg的检出，因此一些HBsAg阳性患者注射乙肝免疫球蛋白后，HBsAg检测会呈阴性反应，导致乙肝两对半少见模式的显现，如我们常遇到乙肝大三阳的孕妇，为阻断乙肝母婴垂直传播时，在孕第8、9、10月常规注射200mg乙肝免疫球蛋白，不仅阻碍孕妇HBsAg的检出；而且其所生产的生新儿也常显现HBsAg阴性，HBeAg阳性和HBcAb阳性等少见模式、可能是乙肝免疫球蛋白属IgG抗体能通过胎盘进入胎儿体内与胎儿血液中的HBsAg结合形成复合物；则新生儿HBsAg检测呈阴性；用0.5M的盐酸处理标本1小时可提升出率。为预防乙肝，部分HBsAg阴性人群在接种乙肝疫苗后的1—2周内，血清中可检出HBsAg成份，形成一过性HBsAg阳性，这可能是乙肝疫苗要紧成分是HBsAg.,有方法能够把它检出；如电化学发光法，建议接种乙肝疫苗后1个月内不应作HBsAg检测。.抗原自身因素少数HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后绝大多数感染者外周血中可显现HBsAg,含量在5ng~600pg/ml之间。据文献报道，到目前为止在献血员中所发觉的HBsAg携带者最低含量为0.2ng/ml。含量高者可达2000wg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg测定为阴性，如暴发性乙型肝炎、HBV的S基因发生变异等。急性重症乙型肝炎，肝细胞中以合成HBcAg为主,专门少或不合成HBsAg,从而使外周血中无HBsAg。HBV的前S/S基因编码HBsAg,构成病毒外膜，按照所带亚型决定簇的不同分为adw、adr、ayw和ayr。a决定簇具有专门高的免疫原性，在HBV的自然感染或注射HBsAg疫苗可引起抗HBs应答。如S基因145密码子变异使得其原先的甘氨酸被精氨酸替代时，可致a决定簇的抗原性发生改变，使机体产生的抗体对变异株无作用，且可引起HBV感染患者血清中同时显现HBsAg和抗HBs。同时乙肝疫苗接种也不能有效预防此类变异病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的变异有自然变异和逃幸免疫变异，变异可发生在多个部位，而且几处突变可同时存在，这些变异有助于病毒携带状态的连续存在。近来，有研究表明，前S1区丢失突变（氨基酸58〜118）是引起HBsAg阴性的HBV感染的重要缘故，S启动子位于前S1,是合成HBsAg的调剂元件，前S1的丢失突变则会阻碍S启动子的功能，进而阻碍HBsAg的合成。专门结果描述缘故分析计策白板显色步骤终止后，酶标板所有孔均无颜色。阳性对比不显色。试剂已过效期，或不同试剂盒组分混用检查试剂的组分及批号，确认未过期以及所有组分均属对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。错加、漏加试剂底物、显色剂A严格按讲明书的步骤操作，加完试剂后可观看一下液面或B高度是否一致，以减少漏加现象。洗板及加样过程中，酶标受污染失活失去催化显色剂显色的能力确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗洁净。终止液误作洗涤液稀释或当底物缓冲液配制每次配制时都应看清标签标明物质。蒸储水有咨询题确认配制洗液的纯化水达到要求且未污染，与好蒸储水比较。显色弱、实验终止后，包括阳性对试剂盒超过期，超过有效期的产品可能会产生专门弱的信号；实验前检查试剂的组分及批号，确认试剂未过期。不要将试剂盒长时刻置于常温下，按使用规定储藏。

灵敏度低比、质控在内的所有板孔颜色均较淡。试剂盒没有按规定进行储存，受高温阻碍；试剂、样品用前未平稳至室温从低温冰箱中取出的试剂及样品应置室温平稳20分钟左右。加入试剂的体积和时刻有误，移液器计量不准，吸嘴内水分太多或不清洁；确定所使用的试剂体积正确，加入时刻适当。校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合。移液不宜太快，排放应完全。洗板及加样过程中，酶标受污染失活而失去催化显色剂显色的能力；确认盛酶标的容器不含酶抑制剂如叠氮钠等，确认配制洗液的容器已洗洁净，确认配制洗液的纯化水达到要求且未受污染。孵育时刻及孵育温度未达到要求，反应板放入培养箱时注意温度并及时调整。孵育温度应操纵在37-38C,孵育时刻严格按照讲明书操作。保温期内不宜多开门，以免阻碍保温。洗板次数过多，或浓缩洗液稀释倍数不符合要求；洗涤冲击力太大。浸泡时刻太长；严格按讲明书要求稀释浓缩洗液及洗板，减小洗涤冲击力，按讲明书要求置留洗涤液时刻和洗涤次数。显色剂加量不足或顺序颠倒，或显色剂滴瓶垂直向下，持力平均，滴速不宜过快，先加混合后加入；显色剂A,后加显色剂B,不可将A、B液混合后加入。底物作用时刻不够；准确定时。蒸储水水质有咨询题；测定蒸储水配制试剂对酶免疫法的阻碍。实验终止后，阴阳性对比正常，质控正常，但临床标本感受显色较弱待测标本中可能不含强阳性标本，故结果可能是正常的如有怀疑，可复检标本加入叠氮钠作为防腐剂酶免实验中的标本禁用叠氮钠作为防腐剂，可选用proclin、硫柳汞等其他防腐剂阴阳性对比正常，但质控、未达要求的孵育温度及孵育时刻可检出强阳性标本，但质控或弱阳性标本受温度变化阻碍较大而被未检出。确认孵育的温度及孵育时刻达到要求。参考品或个别弱阳性标本未能检出。质控品或标本高温放置过久，或质控品或标本幸免反复冻融。标本在一周内使用的，可被反复冻融致待测物滴度下降，存于2-8C,如需长期储存，应置于-20C以下储存。而未能检出质控品应小量分装，并置于-20C以下储存。仪器设定不正确，滤光片不匹配。重新设定酶标仪的参数，专门是检查滤光片是否匹配。终止后，目测告果正常，但海标仪读值结果偏低终止后，整板结果显现均一的黄色或淡黄色；或阴阳性对比、质控正酶标仪参数设定不正确。重新设定酶标仪的参数，专门是检查滤光片是否匹配。灵敏度过高、板底高、整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成，如同时操作两对半试剂时，测HbsAb板用于测HBsAg等；实验前检查试剂的组分及批号，确认所有组分均属于对应的试剂盒。不同试剂盒或不同批号的试剂不能混用。酶标对吸头的污染以及对盛放幸免试剂组分间的交叉污染，确保吸头、容器的洁净。

高背景常，标本阴性标本OD值过高。显色剂容器的污染都易造成黄板现象；显色剂在光照条件下放置过久，实验前已变蓝显色剂A、B未使用前避光储存孵育温度过高或孵育时刻过长；孵育温度应操纵在37-38C,孵育时刻严格按照讲明书操作。未按要求洗板。专门是洗涤时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象严格按讲明书要求洗板。花板，一样是由于临床标本的收集、处理和储存方法不当造成放置时刻（自然放置1〜2h）及离心转速（3000r/min）、离心时刻（15min）应引起注意。样品离心不完全，反应孔内发生凝血或残留细胞成分；充分离心，3000rpm6分钟以上。加样时交叉污染；加标本时尽量幸免交叉污染。如盛标本的试管周围常有血痂，易脱落，应远离酶标板。显现随机性的花板、跳孔现象手工洗板造成的交叉污染手工洗板时前3次注洗液后应赶忙弃去，后几次再设定浸泡时刻，可减少交叉污染洗板机加液头堵塞导致加液不~满或吸液残留量较大，造成花板、跳孔疏通加液头，使洗板时每孔均注满洗液，吸液时残留量要小。拍板时交叉污染洗板完毕拍板时用合适的吸水纸巾，不要把无关物质拍进板孔，并尽量不要在同位置拍，以免交叉污染。假阳性现象是一个综合现象，可参考上文灵敏度过局、板底局、高背景”中的分析。那个地点只列举常见的缘故及计策。运算Cutoff值时使用的公式不正确，导致运算得出的CutOff值过低，从而导致显现假阳性CutOff值运算公式应严格参照所属产品的讲明书，应注意各个酶免产品的Cutoff值运算公式不尽相同。洗板时未能注满洗液或洗板次数、浸泡时刻不够，洗涤不充分，样品中有其他成分残留导致花板、跳孔，假阳性增多严格按讲明书要求洗板。调整洗板机时，应注意有时仪器标示的液量与实际液量并不相符，应按照实际情形调整至每孔注满。假阳性血清标本处理不当，如未除去细胞成分、纤维蛋白原及其它干扰物可显现孔底由变蓝的跳孔现象，此标本重复实验结果往往是阴性；放置时刻（自然放置1〜2h）及离心转速（3000r/min）、离心时刻（15min）应引起注意。厂家试剂质量的变化造成；国家标准要求提升灵敏度时，厂家试剂灵敏度也相应提升，假