斑马鱼在人类疾病及药物筛选模型构建中的应用

斑马鱼在人类疾病及药物筛选模型构建中的应用人类疾病及临床药物筛选大多采用鼠类动物来建模。目前，低等脊椎动物斑马鱼作为模式动物已获得极大的关注。斑马鱼具有多方面的优势：包括在基因和器官系统上与人类具有很高的同源性，强繁殖力，体外受精，基因易于操作以及整个成年早期身体透明等。本文就近10年来人类疾病及药物筛选中有关斑马鱼研究的四个领域展开讨论。这些领域分别是：①伤口愈合/修复；②胃肠道疾病;③微生物-宿主相互作用；④遗传性疾病和药物筛选。1创伤愈合/修复创伤愈合是各种损伤组织和器官的一种重要的生物反应。一系列引起上皮损伤和机体屏障破坏的因素激发了一种被称为“修复”的生物反应，它起着封锁损伤区域，防止其扩散以及重建机体内稳态的作用。这种“创伤愈合”反应既包括一些上皮细胞迁移到损伤区域，同时也有上皮细胞增殖来补充细胞池等两部分。认识到这种反应的细胞和分子机制或许就会给那些正遭受着像缺氧症、烧伤以及癌症等慢性炎性疾病的患者产生深厚的影响。斑马鱼身体透明，具有很强的成像特点使研究人员在基因操作时更加容易，从而使得这种动物成为研究针对各种损伤的创伤愈合反应的理想模型［1］。此外，斑马鱼所具有较强的肢体和心脏组织再生能力也使得它们成为一种探索再生分子机制的强大动物模型。最有名的斑马鱼损伤模型是仔鱼尾巴创伤模型，在此模型中仔鱼尾鳍的一段被切除了。研究人员利用这种转基因斑马鱼的损伤模型在中性粒细胞特有的过氧化物酶催化剂转录控制下表达的绿色荧光蛋白（EGFP）研究了最新的中性粒细胞趋化到损伤部位的机制［2］。一些研究人员还把编码过氧化氢酶的mRNA注射到斑马鱼胚胎发育过程的一个细胞阶段去推定活性氧化物H2O2在创伤愈合应答中的作用［3］。在斑马鱼体内，角质细胞产生H2O2来减少躯体感觉轴突的再生。与尾鳍模型相似，神经元的再生也同样需要过氧化氢酶基因的激活［4］。此外，即使在角质化细胞完好时，随着神经元的损伤H2O2的变化也能促进轴突再生［5］。这些成果可以扩展到对人类外伤性神经损伤以及其后的四肢功能丧失机制的认识。除了皮肤损伤研究外，斑马鱼还被用于心脏组织再生能力的研究。斑马鱼心脏组织损伤后的反应不同于哺乳动物，后者心脏组织损伤后不可以再生而是形成了疤痕，而斑马鱼在心室被切除了20%后，心脏组织2个月内就可以完全再生［6］。斑马鱼的这种避免疤痕形成的能力需要Mps1（一种有丝分裂关键酶）的激活［7］。此外，心脏再生包含了一系列损伤修复基因的上调，同时也可能有血小板衍生生长因子B信号的激活［8］。以斑马鱼为模型的心脏再生研究或许可以独辟蹊径，找到对缺血性心脏病患者产生深厚影响的独特方法。2胃肠道疾病斑马鱼的消化系统与哺乳动物极为相似，同样包含了一个肝脏、胰腺、胆囊以及一个具有吸收和分泌功能的线性分段的肠道［9-10］。肠上皮在肠道的全程中都发挥着作用且它还包含了许多同样也能在哺乳动物身上找到的上皮细胞，包括：吸收细胞、杯状细胞、内分泌细胞等［11-12］。有趣的是，一项还在进行中的基因诱变筛查研究产生了一些发生突变的斑马鱼，它们发生自发性的肠、胰、及肝上皮突变［13］。后来还发现这些突变了的斑马鱼在用了复方阿司匹林处理后，可以导致核。-连环蛋白的堆积以及增加了像cmyc和axin2这样的下游基因的表达［14］。而复方阿司匹林诱导人类［15-16］和大鼠［17］发生突变后肠息肉会大量增生，所以这种复方阿司匹林斑马鱼模型或许可以用在基因、药物筛选以及毒理学研究上。肝肿瘤基因谱分析显示，人类和斑马鱼之间有132个基因是明显重叠的［18］。这些基因包括那些涵盖。-环连蛋白、RSA蛋白激酶信号通路、以及控制细胞粘附和凋亡、在人类和斑马鱼身上都具有的肝特定代谢等过程的基因［19］。肝毒素硫代乙酰胺可引起斑马鱼肝细胞发生癌变。斑马鱼暴露在硫代乙酰胺的环境下12w左右，就可导致与肝细胞癌相关的病理改变［20］。人类肝细胞癌发病率日益增长与HCV感染日益增长密切相关，尤其是感染了具有致癌作用的HCV核心蛋白［21］，这也使得斑马鱼这个模型与人类的疾病密切相关。胰腺癌成为极常见的第四大肿瘤。这可能归结于有限的诊断工具以及有限的检查这种疾病的能力。胰腺外分泌细胞是95%以上胰腺癌的罪魁祸首。至今引起人类外分泌性胰腺癌增长的胰腺细胞群还是个未解之迷，但研究人员已开始用斑马鱼模型来探究这个重要的迷。研究人员利用转基因斑马鱼模型发现当正常的胰腺祖细胞分裂时，荧光标记的转基因模型鱼却阻止了细胞分裂，反而产生了许多未分裂的祖细胞。而这些祖细胞在经过3〜9个月左右就转化成了创胰腺癌。这些癌细胞同时也表达了大量的顽固性基因以及一些下游顽固性目标基因，这种胰腺癌细胞畸变信号传导方式也是人类胰腺癌的典型代表［21］。这个首次建立的致癌外分泌腺胰腺祖细胞斑马鱼模型或许会成为胰腺癌的细胞起源。除癌症模型之外，近几年来消化系统疾病中一个引起显著关注的领域是炎症性肠病（IBD）中斑马鱼造模的发展。在人类，IBD是易感宿主与他们的共生微生物之间相互作用失调的结果［22-23］。药理治疗中应用抗炎药、免疫抑制剂、以及疾病的外科手术治疗也起到一定的作用［24］。一些研究人员试着把这种结肠炎的半抗原恶唑酮模型用成年斑马鱼改进。Brugman等人的研究表明，用恶唑酮处理5h左右的斑马鱼模型肠上皮损伤和杯状细胞消耗可持续高达7d［25］。2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）可以用来研究急慢性肠炎。把具有3个受精期（dfp）的仔鱼暴露于TNBS环境中3〜5d可以构建结肠炎斑马鱼仔鱼模型［26］。研究人员发现了中性粒细胞浸润了整个斑马鱼体内，肠内高表达il1b，肠内脂质代谢反应发生了改变，杯状细胞增生以及肠道收缩等现象［27］。最近，有研究利用非甾体类抗炎药格拉菲宁建立了斑马鱼上皮细胞损伤模型［28］。3微生物-宿主相互作用应用斑马鱼去探究微生物-宿主相互作用的细胞和分子机制受到广泛的关注。研究包括人类的许多种疾病中，如炎症性肠病IBD，肥胖和糖尿病，肠性疾病的治愈，过敏性肠综合症等。斑马鱼可以成为革兰氏阳性及阴性菌、分支杆菌和多种病毒的宿主［29］。斑马鱼是一个研究细菌-宿主相互作用过程的理想模型。一系列比较恒定的探测检验点常常可以检测到细菌及它们相关的物质（像DNA，RNA等）和一些膜结构物（像肽聚糖，LPS-脂蛋白等）。研究最多的细菌相关物质是目前仍有争议的革兰阴性菌细胞壁中的LPS。在哺乳动物体内，TLR4可以检测到LPS，这与其共同受体MD2及CD-14密切相关［30］。与人类相似，高剂量的LPS对斑马鱼也是有毒害作用的［31］。许多研究应用共生的无菌斑马鱼证实了肠道碱性磷酸酶随着微生物的定居而有所下降［32］。另一个重要的TLR系统是TLR5，它具有监测出鞭毛蛋白和激活多种包含NF-kB的信号通路［33］。与哺乳动物相似，在斑马鱼体内监测出鞭毛蛋白（实验中是沙门菌属的衍生物）可以诱导出多种基质金属蛋白酶基因的表达以及一些像illb，il8，ifn和cxcl-C1c这样的炎症标记物［34］。除了TLRs之外，细胞间的感受器Nod1和Nod2是哺乳动物重要的体内信号系统。在斑马鱼胚胎感染模型中，Nod1或Nod2的损耗都会导致对沙门菌属易感性的增加［35］。斑马鱼模型这种能在一种针对各种细菌刺激的细胞类型的特殊形式使得它成为一个强大的解释复杂的宿主-微生物相互作用机制的系统。4遣传性疾病和药物筛选斑马鱼具有强大繁殖力、身体透明体的特点，尤其适合遗传筛选性的研究。可从正反向两个途径研究建立新的斑马鱼表现型模型来识别出与许多与人类疾病表现型相关的新基因。也可用一种省时省力的方式筛选斑马鱼疾病模型发现一些疾病抑制药物。至今，已有两个重要的途径在斑马鱼模型中进行正向基因筛选。第一途径是：用乙基亚硝基脲诱变剂（EUN）处理雄性斑马鱼，接着筛选出具有像肾囊肿或心力衰竭这样表现型的斑马鱼模型［36］。另一个突变途径是应用随机逆转录病毒插入［37］。扩张性心肌病（DCM）是心力衰竭病例中至少一半的病因。DCM常源自于因心肌梗塞或感染而引起的早期心脏损伤［38］。斑马鱼筛选模型发现大量的模型鱼具有心脏病变。有关研究已发现这些突变体中的两个sih和pickwickm171是通过心肌壁变薄及不完全的收缩引起心脏扩张的［39-40］。因这两个基因都是熟知的在人类DCM至关重要的作用，所以这些突变体斑马鱼模型是研究这种病理过程模型的补充。近来，利用反向基因途径已建立了哈钦森-吉尔夫德早衰症综合征（HGPS）的斑马鱼模型，此病是一种罕见的早衰综合征。在斑马鱼模型中，研究人员利用可控的功能丢失突变和吗啉代层蛋白及progerin组合物产生了能够活到成年的斑马鱼模型。这些模型涵盖了早期衰老的表型和分子信号，包括：脂肪代谢障碍、异常的肌肉组织以及颅面骨骼结构、细胞凋亡的增加和细胞周期的阻止［41］。这些表型与HGPS患者的临床表型极为一致，这也进一步验证了用反向基因途径去建立人类疾病的斑马鱼模型观念的可靠性。自医学研究之初，动物模型就一直被利用着。大多数人类疾病模型中，小鼠模型毋庸置疑是人类疾病模型中最受偏爱的且应用最广的动物模型。尽管应用小鼠模型获得了大量的知识，但是长的妊娠期和性成熟期以及高成本的饲养和繁殖费用都给这个模型的应用带来了很多重大的限制性。而且，小鼠实验多需要更多的劳动力且也不是很适合进行高通量药物筛选。这些限制性都促使发展另外一种在花费高的模型上研究开始之前就可用于提供内部基因或药物靶点信息研究的模型。透明的、斑马鱼仔鱼模型就有填补这个重要位置（即研究人类疾病，促使快速、生理有关的体内筛选）的潜能。随着斑马鱼和人类之间更多相关基因、解剖以及生理特点的发现，这种脊椎动物模型的相关性及应用就可成为小鼠模型系统的强有力的补充。参考文献：［1］A.Fire，S.Xu，M.K.Montgomery，etal.Potentandspeci?cgeneticinterferencebydouble-strandedRNAincaenorhabditiselegans［J］.Nature，1998，806-811.J.Yuan,S.Shaham,S.Ledoux,etal.TheC.eleganscelldeathgeneced-3encodesaproteinsimilartomammalianinterleukin-[/-convertingenzyme[J].Cell,1993,641-652.G.K.HanssonandK.Edfeldt.Tolltobepaidatthegatewaytothevesselwall[J].Arteriosclerosis,Thrombosis,andVascularBiology,2005：1085-1087.B.A.BarutandL.I.Zon.Realizingthepotentialofzebra?shasamodelforhumandisease[J].PhysiologicalGenomics,2000:49-51.J.T.Shin,J.R.Priest,I.Ovcharenko.Human-zebra?shnon-codingconservedelementsactinvivotoregulatetranscription[J].NucleicAcidsResearch,2005：5437-5445.C.B.Moens,T.M.Donn,E.R.Wolf-Saxon,andT.P.Ma.Reversegeneticsinzebra?shbyTILLIN[J].Brie?ngsinFunctionalGenomicsandProteomics,2008,454-459.R.M.White,A.Sessa,C.Burke.Transparentadultzebra?shasatoolforinvivotransplantationanalysis[J].CellStemCell,2008,183-189.G.J.Lieschke,A.C.Oates,M.O.Crow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