实验四蛋白酶活力的测定

关于实验四蛋白酶活力的测定第一页，共九页，2022年，8月28日一、实验目的掌握定量测定蛋白酶活性的方法，了解本实验的酶、底物和生成物的相关性，以及本反应的环境条件。进一步理解酶活力和比活力的概念巩固比色法测定物质含量的基础，掌握分光光度计使用方法，学习绘制标准曲线的方法第二页，共九页，2022年，8月28日二、实验原理1．胰蛋白酶是一种水解酶，将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。2．所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物，在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产生蓝色（钼蓝和钨蓝的混合物，680nm）。3．用分光光度计可以定量比较颜色深浅，测定酪氨酸生成量，根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高，生成的酪氨酸越多。4.蛋白酶活力单位定义：在40C，pH7.5的条件下，反应10min，以每min水解酪蛋白产生1g酪氨酸为1U。第三页，共九页，2022年，8月28日三、器材仪器和主要试剂

可见光分光光度计水浴锅Folin–酚试剂0.5%酪蛋白100g/mlTyr溶液三氯醋酸Na2CO3胰蛋白酶

第四页，共九页，2022年，8月28日四、实验操作1、酪氨酸标准曲线的制作管号123456样品、对照滤液（各2支试管）100g/mlTyr(ml)00.20.40.60.81.0每支管加1ml水（ml)1.00.80.60.40.20稀释后Tyr浓度（μg/ml）020406080100Na2CO3(ml)5555555Folin-酚试剂(ml)1111111迅速混合，于40℃放置15分钟

A680nm调0

A样、A对照以酪氨酸的浓度（μg/ml）为横坐标，A680nm为纵坐标，作出标准曲线。管号酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40℃水浴准确保温10分钟三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40℃水浴保温10分钟，过滤得滤液

样品管12----3-------对照管1----3------2第五页，共九页，2022年，8月28日2、蛋白酶活力的测定按下表操作，然后测定滤液中的酪氨酸含量。滤液各取1ml，进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml，40C保温15min)以标准曲线中的1号管调0，测定A样(样品液A680nm值)和A对(对照液A680nm值)；管号酶液（ml）酪蛋白（ml）三氯醋酸（ml）40℃水浴准确保温10分钟三氯醋酸（ml）酪蛋白（ml）40℃水浴保温10分钟，过滤得滤液。

1′

号(样品)12----3-------2′号(对照)1----3------2第六页，共九页，2022年，8月28日3.酶活力计算胰酶活力定义：

40℃，pH7.5，反应10min，每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸1微克为一个酶活力单位。计算：1g蛋白酶所具备的总活力单位为：(

A样-A对)×K×V/t×NA样：样品液光吸收值；A对：对照液光吸收值；K：标准曲线上A680nm为1时的酪氨酸微克数；t：酶促反应的时间（min），本实验t=10min；V：酶促反应管的总体积（ml数），本实验V=6；N：本次实验酶液的稀释倍数:6000第七页，共九页，2022年，8月28日五、思考题酶的试验为何设对照又要设空白?稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原因。计算公式中的v=6该如何理解本实验用什么方法终止酶促反应