植物基因工程育种课件

植物基因工程育种植物基因工程育种1抗虫转基因植物抗虫转基因植物2抗病转基因植物抗病转基因植物3其他抗逆转基因植物其他抗逆转基因植物4

玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。转基因玉米

玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品5利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质6转基因牵牛花

我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。转基因牵牛花

我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛7植物基因工程育种8世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，199转基因番茄

1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。

转基因番茄

10转基因甜椒

甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。转基因甜椒甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我11转基因油菜

油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。转基因油菜12转基因小麦

从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。

转基因小麦13植物基因工程发展现状植物基因工程发展现状14植物基因工程的概念植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。植物基因工程的概念植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，15转基因植物的应用前景和理论意义通过将目的基因导入农作物、园艺、能源或其他经济植物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子种淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的抗逆性等。转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。转基因植物的应用前景和理论意义通过将目的基因导入农作物、园艺16国际转基因作物发展现状在1996年2004年间，全球转基因植物的生产和利用超出了当初预料，基因作物主治面积增长了近48倍，从1996年的170万公顷增加到2004年的8100万公顷。再2004年全球转基因作物种植面积仍有66%在工业化国家，但发展中国家转基因作物的种植面积已逐年增加。国际转基因作物发展现状在1996年2004年间，全球转基因植17国内转基因作物发展现状在某些领域达到了国际先进水平。2004年全国转基因作物种植面积为370万公顷，成为继美国、阿根廷、加拿大、巴西之后的转基因种植第五大国。国内转基因作物发展现状在某些领域达到了国际先进水平。200418迄今为迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。迄今为迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个19植物基因工程育种20植物基因工程所用目的基因1.抗植物虫害基因2.抗植物病毒基因3.抗植物真菌病害基因4.抗植物细菌病害基因5.抗非生物胁迫基因6.提高作物产量、改良作物品质的基因7.改良植物其他性状和雄性不育的基因8.植物医药基因工程植物基因工程所用目的基因1.抗植物虫害基因21目的基因的分离与克隆方法1.基因芯片技术分离目的2.功能蛋白组技术分离目的基因3.定位克隆4.减法杂交5.mRNA差异显示技术6.利用PCR法获得基因，包括RT-PCR,锚定PCR,RACE等。7.人工合成短序列的目的基因目的基因的分离与克隆方法1.基因芯片技术分离目的22目的基因表达载体的构建目的基因表达载体的构建23基因工程的载体系统1、质粒载体2、噬菌体载体3、病毒载体基因工程的载体系统1、质粒载体24目的基因的转化方法

■原生质体介导法

■基因枪法

■根癌农杆菌介导法

目的基因的转化方法25一原生质体介导法概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法。主要方法:1)PEG介导的基因转化2)脂质体（liposome)介导的基因转化3)电激法4)激光导入法5)显微注射法一原生质体介导法概念：以原生质体为受体，借助于特261PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。

案例：转基因烟草1PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二272脂质体介导基因转化原理：利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体,通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高;操作繁琐;技术性高。

2脂质体介导基因转化原理：利用脂类化学物质包裹外源D283电激法介导基因转化

原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。特点：转化率高；操作简便；容易造成原生质体损伤。3电激法介导基因转化29４显微注射介导的基因转化

原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。优点：方法简单、转化率高；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；培养过程无需特殊选择系统。

４显微注射介导的基因转化

原理：利用显微注射仪将外源DNA直30５激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于各种动植物；对受体细胞生命活动影响小；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化．５激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米316.花粉管导入法6.花粉管导入法32基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电．

基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒33操作步骤（1）制备DNA微弹；

（2）准备靶外植体材料；

（3）DNA微弹轰击；

（4）培养轰击后的外植体．操作步骤（1）制备DNA微弹；34转化率影响因素 金属微粒金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.DNA沉淀辅助剂这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害.DNA纯度及浓度微弹速度植物材料内在因素转化率影响因素 金属微粒35根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型。在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根361Ti质粒的改造策略Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：（1）质粒过大，造作困难（2）大型的Ti质粒有多个酶切位点（3）植物激素类的影响（4）Ti质粒中存在不起作用的序列（5）Ti质粒的局限性1Ti质粒的改造策略37为了使Ti质粒变成操作简便且有效的外源基因转移载体,必须对野生型的Ti质粒进行改造.植物转基因有一元载体系统和二元载体系统,所以采取不同的改造策略.二元载体较一元载体的优点:构建比较方便;二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中.为了使Ti质粒变成操作简便且有效的外源基因转移载体,必须对野382根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理6个步骤：1）农杆菌对受体的影响（2）农杆菌附着到植物受体细胞（3）诱导启动毒性区基因表达（4）类似接合孔复合体的合成和装配（5）T-DNA的加工和转运（6）T-DNA的整合2根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理393。T-DNA转移的影响因素（1）农杆菌菌株（2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期（3）基因活化的诱导物（4）外植体的类型和生理状态（5）外植体的预培养（6）外植体的接种及共培养3。T-DNA转移的影响因素40基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较

(1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默表达。农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率较高。(2）基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制。农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。

（3）基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较41转基因操作的受体系统1、高频再生体系的建立愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞再生系统转基因操作的受体系统1、高频再生体系的建立422、抗生素敏感实验抑制细菌生长杀死非转化细胞3、农杆菌敏感实验2、抗生素敏感实验43转化细胞的培养和转基因植株的再生

恢复生长筛选培养植株再生转化细胞的培养和转基因植株的再生恢复生长44转化子细胞的筛选当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化，只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选择到转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。转化筛选细胞的方法主要有两种：一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（转化子细胞的筛选当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体45如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以46转基因植物的鉴定遗传鉴定表达鉴定表型分析鉴定利用报告基因Northern杂交Western杂交

直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。1）扩增目的片段；2）杂交信号鉴定。（Southern杂交）转基因植物的鉴定遗传鉴定利用报告基因直接鉴定DN47鉴定步骤：筛选鉴定（利用质粒上的选择标记）报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）遗传鉴定生长试验

DNA鉴定-southernRNA鉴定-northern蛋白质鉴定-western鉴定步骤：DNA鉴定-southern48一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的基因主要是一类编491、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成。新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。1、新霉素抗性基因（neor）502.庆大霉素抗性基因（gentr）该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。

该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。2.庆大霉素抗性基因（gentr）该基因编码一种乙酰转移酶，513.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素林酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta）,膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）52二、报告基因报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。二、报告基因报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断53理想报告基因的基本要求：1、受体细胞不粗在相应的内源等位基因的活性。2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。理想报告基因的基本要求：54目前最常用的报告基因有：ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素乙酰转移酶基因3.荧光素酶基因目前最常用的报告基因有：55

ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码ß-葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酸类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码ß-葡萄糖56氯霉素乙酰转移酶基因该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而使其失去活性。真核细胞中部含有氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源活性，因而该基因可作为真核细胞转化的选择基因及报告基因。氯霉素乙酰转移酶基因该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催573.荧光素酶基因该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧光素是荧光素酶催化的底物总成，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单，直接将被检的材料进入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测.3.荧光素酶基因该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧58转化体的鉴定和证实的必要性为了验证外源基因整合到染色体.我们采用PCR技术.Southern杂交技术.为了验证外源基因是否表达.我们采用RT-PCR技术.Northern杂交技术.Western杂交技术.转化体的鉴定和证实的必要性为了验证外源基因整合到59PCR检验外源基因的整和在转基因个体的检测中,通过设计外源基因两端的特异引物,采用PCR基因可以使外源基因得到大量扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特意扩增带的有无,从而判断外源基因是否整合到受体植物的基因组.优点:由于对模板DNA的要求少,适合与转基因体的早期检测.缺点:容易受到外界因素的干扰.PCR检验外源基因的整和在转基因个体的检测中,通过设计外60Southern杂交检测外源基因的整合原理:来源不同但具有互补序列的两条多核苷酸链通过Waston-Crick碱基配对原则形成稳定的结构.其中一条被标记成为探针,探针与互补的核苷酸序列杂交,通过放射自显影技术可以被检测出来.杂交方式:Southern斑点杂交Southern印记杂交(最常用)Southern原位杂交Southern杂交检测外源基因的整合原理:来源不同但具有互61R-T杂交检测外源基因的整合适用范围:外源基因在受体细胞是否转录的初步检测.原理:以转基因个体总RNA或mRNA为模板进行反转录,然后PCR扩增,如果可以获得特意的cRNA扩增条带,则表明外源基因实现了转录.优点:简单快速对mRNA抽提的数量和质量都要求不高.R-T杂交检测外源基因的整合适用范围:外源基因在受体细胞是否62Northern杂交检测外源基因的表达与Southern的不同是:固体膜上转移固定的是总RNA或mRNA.探针与膜上RNA形成RNA-DNA杂交双链.通过放射自显影的强度可以判断外源基因的表达水平.分类:斑点杂交(假阳性率高.不常用)印迹杂交(比较常用)Northern杂交检测外源基因的表达与Southern的63Western杂交检测外源基因表达的产物适用范围:检测外源基因在蛋白质水平上的表达.原理:从转基因材料中提取总蛋白或者目的蛋白,经SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳把蛋白质按分子大小分离,在转移到固体膜上,然后加入特异抗体.膜上的目的蛋白与一抗结合,再加入带标记的二抗,最后通过二抗上的标记物的性质进行检测.Western杂交检测外源基因表达的产物适用范围:检测外源基64植物遗传转化流程适宜外植体的选择及再生体系的建立抗生素筛选压的确定及农杆菌菌株的选择遗传转化操作

载体介导的转化方法DNA直接导入法种质系统法选择培养转基因植株鉴定获得再生植株转化质粒的构建转基因植株的繁殖与应用利用报告基因Southern杂交Northern杂交Western杂交植物遗传转化流程适宜外植体的选择及再生体系的建立抗生素筛选压65植物基因工程研究的应用一抗性基因工程二植物品质改良基因工程三植物杂种优势的利用四植物代谢工程植物基因工程研究的应用一抗性基因工程66一抗性基因工程研究最早、技术最为成熟、应用规模最大的植物转基因技术1.抗虫基因工程2.抗除草剂基因工程3.抗病基因工程4.抗逆基因工程一抗性基因工程67二植物代谢工程植物代谢工程的研究发展方向为正在开展的第二代植物基因工程。其中心是植物代谢工程.重点在于改良植物品质,增加营养,提高食物的医疗保健功能,或用做工业原料,增加农副产品的附加值.二植物代谢工程植物代谢工程的研究发展方向为正在开68三植物品质改良基因工程1蛋白质、碳水化合物和脂肪品质改良改良途径:⑴将编码广泛氨基酸组成或高含硫氨基酸的种子储藏蛋白基因导入植物;⑵将某些蛋白质亚基基因导入植物;⑶将与淀粉合成有关的基因导入植物;⑷将与脂类合成有关的基因导入植物.2果品的成熟品质改良果品的货架存放期直接影响商业价值,人们可以通过这个技术来改变果品成熟后的品质.3观赏园艺植物的品质改良三植物品质改良基因工程69

四植物杂种优势的利用关键:选育稳定遗传的雄性不育系及其保持系和恢复系传统育种:在自然群体中鉴定.基因工程方法:采用特异性启动子与RNA酶基因构建嵌合基因.四植物杂种优势的利用70五、基因工程的安全性（一）安全问题的考虑工程菌株的处理转基因植物的释放转基因产品的安全五、基因工程的安全性（一）安全问题的考虑711.转基因作物本身成为杂草；2.转基因作物使其亲缘野生种成为杂草或超级杂草；3.转基因作物可能产生新的病毒或疾病；4.转基因作物对非目标生物的危险；5.转基因作物作为外来种对新生境的入侵，使生物多样性受到威胁；6.转基因作物对生态系统及生态过程的影响；7.其它一些不可预计的风险。（二）转基因植物的风险1.转基因作物本身成为杂草；（二）转基因植物的风险72（三）生物安全的管理法国为对遗传修饰生物体(GMO)的评价和立法成立了两个专门委员会。第一个是遗传工程委员会，成立于1975年，任务集中于实验室的重组DNA的研究；1986年又成立了生物分子工程委员会，它的任务是评价遗传修饰生物体的大田试验、释放以及商品化过程的安全问题。（三）生物安全的管理法国为对遗传修饰生物体(GMO)的评价和73进入90年代特别是1992年联合国环境与发展大会的召开，更加促进了国际上对生物安全立法工作的重视，特别是大会由许多国家签署的两个纲领性文件《21世纪议程》和《生物多样性公约》均在有关条款中提到了生物技术安全问题。

进入90年代特别是1992年联合国环境与发展大会的召开，更加741993年，在原国家科学技术委员会领导下成立了国家生物遗传工程安全委员会，由来自卫生部、农业部、轻工业部的专家组成，负责医药、农业和轻工业部门的生物安全。

目前，在中国负责生物安全的部门有国家环保总局、科技部、农业部、卫生部、国家医药管理局、中国科学院和教育部等。

1993年，在原国家科学技术委员会领导下成立了国家生物遗传工751996年7月10日农业部颁布的《农业生物基因工程安全管理实施办法》是一部较完善、较好的“实施办法”。1996年7月10日农业部颁布的《农业生物基因工程安全管理实76农业转基因生物安全管理条例中华人民共和国国务院令第304号《农业转基因生物安全管理条例》已经2001年5月9日国务院第38次常务会议通过，现予公布，自公布之日起施行。

总理朱镕基

2001年5月23日农业转基因生物安全管理条例77植物基因工程育种植物基因工程育种78抗虫转基因植物抗虫转基因植物79抗病转基因植物抗病转基因植物80其他抗逆转基因植物其他抗逆转基因植物81

玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。转基因玉米

玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品82利用转基因改良植物的品质利用转基因改良植物的品质83转基因牵牛花

我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。转基因牵牛花

我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛84植物基因工程育种85世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1983年得以培植出来。世界上第一种基因移植作物是一种含有抗生素药类抗体的烟草，1986转基因番茄

1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。

转基因番茄

87转基因甜椒

甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗病毒的甜椒。转基因甜椒甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我88转基因油菜

油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40％左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好。转基因油菜89转基因小麦

从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种面包的营养价值高。

转基因小麦90植物基因工程发展现状植物基因工程发展现状91植物基因工程的概念植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化（根癌农杆菌Ti质粒介导法、基因枪法、原生质体介导法等），以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。植物基因工程的概念植物基因工程是以植物为受体的一种基因操作，92转基因植物的应用前景和理论意义通过将目的基因导入农作物、园艺、能源或其他经济植物中，改变它们的遗传特性，使植物免受病虫的危害，或获得抗除草剂的特性，或改变种子种淀粉、蛋白质的含量和组成、或改变花的形状和颜色，或改变植物的育性和不亲合性以及改变植物的抗逆性等。转基因植物可作为一种生物反应器，生产药用蛋白和植物次生代谢产物，或生产某些有机化合物。转基因植物为人们研究某一基因功能及其再生长发育中的作用提供了强有力的工具。转基因植物的应用前景和理论意义通过将目的基因导入农作物、园艺93国际转基因作物发展现状在1996年2004年间，全球转基因植物的生产和利用超出了当初预料，基因作物主治面积增长了近48倍，从1996年的170万公顷增加到2004年的8100万公顷。再2004年全球转基因作物种植面积仍有66%在工业化国家，但发展中国家转基因作物的种植面积已逐年增加。国际转基因作物发展现状在1996年2004年间，全球转基因植94国内转基因作物发展现状在某些领域达到了国际先进水平。2004年全国转基因作物种植面积为370万公顷，成为继美国、阿根廷、加拿大、巴西之后的转基因种植第五大国。国内转基因作物发展现状在某些领域达到了国际先进水平。200495迄今为迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个转基因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴桃、越橘、茄子、梨、苹果、葡萄等。迄今为迄今为止世界上共批准了12种作物、6大类性状的48个96植物基因工程育种97植物基因工程所用目的基因1.抗植物虫害基因2.抗植物病毒基因3.抗植物真菌病害基因4.抗植物细菌病害基因5.抗非生物胁迫基因6.提高作物产量、改良作物品质的基因7.改良植物其他性状和雄性不育的基因8.植物医药基因工程植物基因工程所用目的基因1.抗植物虫害基因98目的基因的分离与克隆方法1.基因芯片技术分离目的2.功能蛋白组技术分离目的基因3.定位克隆4.减法杂交5.mRNA差异显示技术6.利用PCR法获得基因，包括RT-PCR,锚定PCR,RACE等。7.人工合成短序列的目的基因目的基因的分离与克隆方法1.基因芯片技术分离目的99目的基因表达载体的构建目的基因表达载体的构建100基因工程的载体系统1、质粒载体2、噬菌体载体3、病毒载体基因工程的载体系统1、质粒载体101目的基因的转化方法

■原生质体介导法

■基因枪法

■根癌农杆菌介导法

目的基因的转化方法102一原生质体介导法概念：以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源ＤＮＡ直接导入植物细胞的方法。主要方法:1)PEG介导的基因转化2)脂质体（liposome)介导的基因转化3)电激法4)激光导入法5)显微注射法一原生质体介导法概念：以原生质体为受体，借助于特1031PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二醇（PEG）聚烯醇(细胞促融剂)等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整合到基因组中，完成遗传转化过程。

案例：转基因烟草1PEG介导的基因转化原理：利用化学试剂，如聚乙二1042脂质体介导基因转化原理：利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体,通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高;操作繁琐;技术性高。

2脂质体介导基因转化原理：利用脂类化学物质包裹外源D1053电激法介导基因转化

原理：利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔“，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。特点：转化率高；操作简便；容易造成原生质体损伤。3电激法介导基因转化106４显微注射介导的基因转化

原理：利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。优点：方法简单、转化率高；纯物理方法，适用于各种植物和材料，无局限性；对受体细胞无毒害，有利于转化细胞生长发育；培养过程无需特殊选择系统。

４显微注射介导的基因转化

原理：利用显微注射仪将外源DNA直107５激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；无宿主限制，适应于各种动植物；对受体细胞生命活动影响小；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化．５激光微束介导的基因转化原理：将激光引入光学显微镜聚焦成微米1086.花粉管导入法6.花粉管导入法109基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。动力类型：火药爆炸力；高压气体；高压放电．

基因枪法（微弹轰击法）工作原理：将外源DNA包被在微小的金粒110操作步骤（1）制备DNA微弹；

（2）准备靶外植体材料；

（3）DNA微弹轰击；

（4）培养轰击后的外植体．操作步骤（1）制备DNA微弹；111转化率影响因素 金属微粒金粉颗粒较钨粒性质优良,但是价格昂贵.DNA沉淀辅助剂这些化合物对DNA在微粒上的黏附有重要作用,但对植物受体细胞也产生一定的伤害.DNA纯度及浓度微弹速度植物材料内在因素转化率影响因素 金属微粒112根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根癌农杆菌诱导植物形成的根瘤中冠瘿碱的不同可将根癌农杆菌分为章鱼碱型、胭脂碱型和农杆碱型3种类型。在根癌农杆菌内有一个大的致瘤质粒，简称Ti质粒。根癌杆菌介导法根癌农杆菌广泛亲染双子叶植物和裸子植物。根据根1131Ti质粒的改造策略Ti质粒是植物基因工程的一种天然载体，但野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在着学多障碍：（1）质粒过大，造作困难（2）大型的Ti质粒有多个酶切位点（3）植物激素类的影响（4）Ti质粒中存在不起作用的序列（5）Ti质粒的局限性1Ti质粒的改造策略114为了使Ti质粒变成操作简便且有效的外源基因转移载体,必须对野生型的Ti质粒进行改造.植物转基因有一元载体系统和二元载体系统,所以采取不同的改造策略.二元载体较一元载体的优点:构建比较方便;二元载体不会带入大量的无用的多余的DNA序列.因为一元载体的T-DNA区中含中间载体,他们会随同外源基因一起被转入植物细胞中.为了使Ti质粒变成操作简便且有效的外源基因转移载体,必须对野1152根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理6个步骤：1）农杆菌对受体的影响（2）农杆菌附着到植物受体细胞（3）诱导启动毒性区基因表达（4）类似接合孔复合体的合成和装配（5）T-DNA的加工和转运（6）T-DNA的整合2根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理1163。T-DNA转移的影响因素（1）农杆菌菌株（2）农杆菌菌株高侵染活力的生长时期（3）基因活化的诱导物（4）外植体的类型和生理状态（5）外植体的预培养（6）外植体的接种及共培养3。T-DNA转移的影响因素117基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较

(1)基因枪法——多拷贝整合概率高，外源基因默表达。农杆菌介导——低拷贝整合（多为单拷贝整合）转化效率较高。(2）基因枪法——纯物理转化，不存在物种的限制。农杆菌介导——存在宿主范围的局限性。

（3）基因枪法适于以细胞器为转化目标的转基因研究。基因枪法与根癌农杆菌介导发的比较118转基因操作的受体系统1、高频再生体系的建立愈伤组织再生系统直接分化再生系统原生质体再生系统胚状体再生系统生殖细胞再生系统转基因操作的受体系统1、高频再生体系的建立1192、抗生素敏感实验抑制细菌生长杀死非转化细胞3、农杆菌敏感实验2、抗生素敏感实验120转化细胞的培养和转基因植株的再生

恢复生长筛选培养植株再生转化细胞的培养和转基因植株的再生恢复生长121转化子细胞的筛选当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体中仅仅只有几个少数细胞获得转化，只有采取有效的转化方法，才能提高准确地选择到转化细胞。一般情况下，转化载体上除了带有目的基因外，大多还携带选择基因，以供转化细胞筛选使用。转化筛选细胞的方法主要有两种：一是根据选择基因的特点在筛选选择培养基中加入能抑制非转化细胞生长的有毒物质（转化子细胞的筛选当采用某种转基因方法处理外植体后，通常外植体122如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以解除培养基中有害物质对细胞生长的抑制作用，这样只有转化细胞才能生长繁殖；另一种方式是，受体细胞为营养缺陷型细胞，在选择性培养基中不能生殖，而选择培养基可以补偿这种缺陷，使转化细胞在选择性培养基上正常生长。如抗生素、除草剂等），选择基因通常为一种解毒基因，可以123转基因植物的鉴定遗传鉴定表达鉴定表型分析鉴定利用报告基因Northern杂交Western杂交

直接鉴定DNA分子是否整合到基因组上。1）扩增目的片段；2）杂交信号鉴定。（Southern杂交）转基因植物的鉴定遗传鉴定利用报告基因直接鉴定DN124鉴定步骤：筛选鉴定（利用质粒上的选择标记）报告基因鉴定（利用质粒上的报告基因）遗传鉴定生长试验

DNA鉴定-southernRNA鉴定-northern蛋白质鉴定-western鉴定步骤：DNA鉴定-southern125一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的基因主要是一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。最常用的有新霉素抗性基因（neor）、庆大霉素抗性基因（gentr）、潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）,以及膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）等。一、植物基因工程中的选择基因植物基因工程中的基因主要是一类编1261、新霉素抗性基因（neor）新霉素抗性基因是从大肠杆菌转座子Tn5中分离的，其对应失活的选择试剂为卡那霉素、新霉素和G418。卡那霉素、新霉素可通过与核糖体小亚基结合抑制蛋白质的合成，G418可通过抑制80S核糖体的功能而阻断真核细胞中的蛋白质合成。新霉素抗性基因可使选择试剂磷酸化而失效。1、新霉素抗性基因（neor）1272.庆大霉素抗性基因（gentr）该基因编码一种乙酰转移酶，属抗生素标记基因，它通过对庆大霉素的乙酰化而使其失活。

该选择系统目前也有一定的应用，例如矮牛、烟草和番茄。2.庆大霉素抗性基因（gentr）该基因编码一种乙酰转移酶，1283.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）潮霉素是一种很强的细胞抑制剂，对许多植物都有很强的毒性。潮霉素林酸转移酶可通过对潮霉素磷酸化而使其失活。4.膦丝菌素乙酰转移酶基因（bar）该基因是从吸水链霉菌中克隆的一种基因，其对应的选择试剂为膦丝菌素（basta）,膦丝菌素可抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而导致非转化细胞发生氨的致死性累积。3.潮霉素磷酸转移酶（HTP）基因（hpt）129二、报告基因报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是够成功地导入体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。它应用不依赖于外界选择压力的存在，这一点也是它与选择基因的区别之处。二、报告基因报告基因是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断130理想报告基因的基本要求：1、受体细胞不粗在相应的内源等位基因的活性。2、它的产物是唯一的，且不会损害受体细胞。3、具有快速、廉价、灵敏、定量和可重复性的检测特性。理想报告基因的基本要求：131目前最常用的报告基因有：ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）氯霉素乙酰转移酶基因3.荧光素酶基因目前最常用的报告基因有：132

ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码ß-葡萄糖苷酸酶,存在于某些细菌体内，该酶是一种水解酶，能催化许多ß-葡萄糖苷酸类物质的水解。绝大多数的植物细胞内不存在内源的GUS活性，许多细菌及真菌也缺乏内源GUS活性，因而gus基因被广泛应用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中，gus基因应用最多。ß-葡萄糖苷酸酶基因（gus）gus基因编码ß-葡萄糖133氯霉素乙酰转移酶基因该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催化乙酰基团从乙酰辅酶A转移到氯霉素分子上，导致氯霉素分子发生乙酰化作用，从而使其失去活性。真核细胞中部含有氯霉素乙酰转移酶基因，无该酶的内源活性，因而该基因可作为真核细胞转化的选择基因及报告基因。氯霉素乙酰转移酶基因该基因来自大肠杆菌转座子Tn9，它能够催1343.荧光素酶基因该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧光素是荧光素酶催化的底物总成，不同荧光素的化学结构有一定差异甚至完全不同。荧光素酶基因的活性检测非常简单，直接将被检的材料进入加有荧光素和ATP的缓冲液中，置于暗室用肉眼直接观察荧光，或覆盖X-光胶片曝光，也也用荧光光度计定量检测.3.荧光素酶基因该基因有很多种，它可以催化荧光素发出荧光。荧135转化体的鉴定和证实的必要性为了验证外源基因整合到染色体.我们采用PCR技术.Southern杂交技术.为了验证外源基因是否表达.我们采用RT-PCR技术.Northern杂交技术.Western杂交技术.转化体的鉴定和证实的必要性为了验证外源基因整合到136PCR检验外源基因的整和在转基因个体的检测中,通过设计外源基因两端的特异引物,采用PCR基因可以使外源基因得到大量扩增,然后通过琼脂糖凝胶电泳检测特意扩增带的有无,从而判断外源基因是否整合到受体植物的基因组.优点:由于对模板DNA的要求少,适合与转基因体的早期检测.缺点:容易受到外界因素的干扰.PCR检验外源基因的整和在转基因个体的检测中,通过设计外137Southern杂交检测外源基因的整合原理:来源不同但具有互补序列的两条多核苷酸链通过Waston-Crick碱基配对原则形成稳定的结构.其中一条被标记成为探针,探针与互补的核苷酸序列杂交,通过放射自显影技术可以被检测出来.杂交方式:Southern斑点杂交Southern印记杂交(最常用)Southern原位杂交Southern杂交检测外源基因的整合原理:来源不同但具有互138R-T杂交检测外源基因的整合适用范围:外源基因在受体细胞是否转录的初步检测.原理:以转基因个体总RNA或mRNA为模板进行反转录,然后PCR扩增,如果可以获得特意的cRNA扩增条带,则表明外源基因实现了转录.优点:简单快速对mRNA抽提的数量和质量都要求不高.R-T杂交检测外源基因的整合适用范围:外源基因在受体细胞是否139Northern杂交检测外源基因的表达与Southern的不同是:固体膜上转移固定的是总RNA或mRNA.探针与膜上RNA形成RNA-DNA杂交双链.通过放射自显影的强度可以判断外源