新型人工神经导管课件

新型人工神经导管修复周围神经缺损的临床应用王华松张伟才黄继锋蔡贤华付强黄一拯吴刚广州军区武汉总医院骨科解放军骨创伤救治中心广州军区骨科研究所湖北省骨创伤医学研究中心新型人工神经导管修复周围神经缺损的临床应用王华松张伟才黄继解剖特点骨折分型康复锻炼手术入路内固定方式选择临床应用解剖特点背景骨折分型动物实验典型病例研究计划Keywords解剖特点骨折分型康复锻炼手术入路内固定方式选择临床应用解剖特周围神经损伤和缺损的治疗是显微外科的难题之一，为解决自体神经来源有限、异体神经存在免疫源性等问题，众多学者致力于可替代移植物的开发。热点：组织工程化人工神经解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心Background周围神经损伤和缺损的治疗是显微外科的难题之一，为解决自体神经周围神经组织结构基底膜无髓神经有髓神经RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）基底膜的主要成分：纤维粘连蛋白

基膜粘层蛋白内皮粘连蛋白胶原含有RGD解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心轴突天然神经组织的组成及结构轴突髓鞘

纳米复合材料仿生设计

制备RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/复合神经导管（PRGD/PDLLA/β-TCP，PRGD）

周围神经组织结构基底膜无髓神经有髓神经RGD（精氨酸-甘氨酸解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心修复大鼠10mm坐骨神经缺损修复犬30mm腓总神经缺损AnimalExperiment解放军武汉总医院骨科修复大鼠10mm坐骨神经缺损修复犬30m解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心获得了湖北省食品药品监督管理局“医疗器械临床试验”的审批。符合CFDA第5号令《医疗器械临床试验规定》的临床试验的要求；通过伦理委员会讨论同意临床试用病例选择：上肢周围神经缺损长度≤2.5cm2011.12~2013.12在我院骨科开展了15例ClinicalApplication解放军武汉总医院骨科获得了湖北省食品药品监督管理局“医疗器械解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心

监测指标观察损伤神经支配区域触觉、痛觉和移动两点辨别觉（M-2PD）恢复情况检查损伤神经支配肌肉的萎缩、肌力恢复及完成运动情况。电生理检查观察神经传导功能情况采用高频超声观察导管内外神经生长情况，观察受损神经功能恢复情况

疗效分析英国医学研究会1954年颁布的标准评定，中华医学会手外科学会上肢周围神经功能评定试用标准采用描述性统计计算功能改善率（%）解放军武汉总医院骨科监测指标观察损伤神经支配区域触觉解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心神经陈旧性损伤（12例）

病例汇总（2011.12~2013.12）神经新鲜损伤（3例）其中桡神经损伤5例；尺神经损伤5例；正中神经损伤5例其中11例（共15例）术后功能不同程度恢复，未见不良反应解放军武汉总医院骨科神经陈旧性损伤（12例）病例汇总（2男性，49岁；致左肱骨中下段骨折合并左肘上桡神经完全断裂，左手垂腕畸形，左手诸指背伸活动受限诊断：左桡神经损伤处理：急诊行左肱骨中下段骨折切开复位接骨板内固定+桡神经探查修复术解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心Case1：桡神经损伤CaseReport男性，49岁；致左肱骨中下段骨折合并左肘上桡神经完全断裂，左术后2周左手垂腕畸形，伸腕伸指受限伤口一期愈合，无不良反应解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后2周左手垂腕畸形，伸腕伸指受限伤口一期愈合，无不良反应解术后6个月伸腕伸指功能部分恢复，感觉神经传导速度接近正常(48m/s)神经纤维由近端向远端沿管壁爬行生长，远端神经可探测到神经血流信号运动功能高频B超术后7.5个月伸腕伸指功能明显改善再生神经纤维由管壁向管腔中心生长，神经血流信号较丰富运动功能高频B超术后6个月伸腕伸指功能部分恢复，感觉神经传导速度接近正常(4伸腕伸指功能基本恢复，肌力达到4级，能对抗较大阻力做主动伸腕伸指活动；感觉神经传导速度44.6m/s，运动神经传导速度达到正常（65.8m/s）术后13个月再生神经束近、远端已桥接，神经血流信号丰富（纵截面）再生神经已充满整个管腔（横截面）神经再生良好，断端及再生神经未见膨大高频B超DP解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心伸腕伸指功能基本恢复，肌力达到4级，能对抗较大阻力做主动伸腕解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后23个月伸腕伸指功能恢复，活动自如探查示神经再生良好，无神经瘤形成；PRGD神经导管已完全降解、吸收；取周围组织行病理切片未见明显不良反应。评分：伸腕＞45°（4分）；肌力＞M3（4分）；伸拇TAM活动范围正常（优4分）；伸指TAM＞健侧的75%

（良3分）。总分15分，优解放军武汉总医院骨科术后23个月伸腕伸指功能恢复，活动自如探Case2：尺神经损伤男性，12岁，剪刀扎伤致左前臂中段尺神经损伤1个月（外院未行探查修复），查体示左尺神经支配区域触觉、痛觉完全消失，环小指内收外展障碍，爪形手畸形，Froment征（+），夹纸试验（+）诊断：左尺神经陈旧性损伤处理：行左尺神经探查修复术解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术前外观Case2：尺神经损伤男性，12岁，剪刀扎伤致左前臂中段尺术中照片解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术中照片解放军武汉总医院骨科术后15个月拇对小指功能基本恢复左手无明显爪形手畸形，运动神经传导速度有所恢复（29.0m/s），感觉神经未引出激发电位

解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心评分：感觉S3

（3分）；无爪形手畸形（4分）；屈指活动范围正常（TAM优4分）。总分11分，优

术后15个月拇对小指功能基本恢复左手无明显爪形手畸形，运动神Case3：正中神经损伤女性，54岁；外伤致左前臂中上段正中神经损伤，于外院行神经探查修复术后8个月，左手拇指对掌不能、外展受限，拇、示、中指感觉减退诊断：左正中神经神经鞘瘤处理：行左正中神经探查修复术解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心Case3：正中神经损伤女性，54岁；外伤致左前臂中上段正术后6个月左拇指对掌功能明显改善，可用拇指分别与余4指捏持笔在未施加外力及施加较大阻力下，左手主动屈腕均可达正常侧80%左右解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后6个月左拇指对掌功能明显改善，可用拇指分别与余4指捏持笔术后19个月左手拇指可分别与其余手指捏持硬币（较精细物体），动作执行流畅、连贯屈腕功能；肌电图显示神经传导速度有所恢复（运动29.80m/s；感觉34.50m/s）评分：感觉S3

（3分）；屈腕肌力M4（4分）；屈指TAM活动范围正常（优4分）；拇对掌基本正常（4分）。总分15分，优解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后19个月左手拇指可分别与其余手指捏持硬币（较精细物体），小结改善率达73.3%等同于同类产品有效促进神经再生未见明显不良反应理想的神经修复材料PRGD/PDLLA/β-TCP神经导管Keypoint小结改善率达73.3%PRGD/PDLLA/β-TCP解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心PRGD/PDLLA/β-TCP单通道神经导管改进方法引入神经生长因子复合种子细胞，以期提高受损神经的修复效果FurtherStudy解放军武汉总医院骨科PRGD/PDLLA/β-TCP单通道神解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心技术路线BMSCs体外分离培养、纯化

动物体内植入实验

大体观察、运动功能（SFI）神经电生理评价（肌电图）

BMSCs体外定向诱导分化及鉴定

组织学评价（光镜、电镜）

神经导管体内降解情况

实验数据统计学分析

解放军武汉总医院骨科技术路线BMSCs体外分离培养、纯化动ThankYou!

ThankYou!

新型人工神经导管课件新型人工神经导管课件解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心1.细胞培养及纯化：无菌条件下分离8周龄雄性Wiatar大鼠双侧股骨和胫骨，完全培养基冲洗骨髓腔，冲洗液过滤、离心后接种到培养瓶；差速贴壁法进行体外扩增、纯化。P0接种7dP3五、BMSCs体外分离培养及定向诱导分化接种24hP0接种3d解放军武汉总医院骨科1.细胞培养及纯化：无菌条件下分离8周2.诱导方法：选取生长状态良好的P3细胞，24孔板中每孔接种1000个细胞；待细胞贴壁后（接种1d）进行体外诱导，并设立平行对照组3.诱导条件：终浓度20ng/ml表皮生长因子（EGF）和20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），每天加入两种生长因子，诱导8d后进行鉴定4.鉴定方法：常规固定、透膜、封闭后行免疫细胞化学鉴定。一抗（兔来源神经元特异性烯醇化酶NSE）+CY3标记羊抗兔二抗；一抗（鼠来源神经丝蛋白NF-M）+FITC标记羊抗小鼠IgG二抗；一抗（小鼠来源抗大鼠突触素蛋白SYP）+FITC标记羊抗小鼠IgG二抗。解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心2.诱导方法：选取生长状态良好的P3细胞，24孔板中每孔接诱导前诱导1d（胞质回缩）诱导5d（神经样细胞改变，伸出2个或多个突起）解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心诱导8d（细胞连接成网状）结果诱导前诱导1d（胞质回缩）诱导5d（神经样细胞改变，伸出2个解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心平行对照NSE+CY3SYP+FITCNF-M+FITC诱导8d后，NSE、NF-M、SYP阳性率表达分别为70.3±4.2、25.7±1.6、3.6±0.5解放军武汉总医院骨科平行对照NSE+CY3SYP+FITCN

1.细胞准备：选取生长状态良好的P3BMSCs，EGF与bFGF联合诱导8d，收集细胞，调整密度为107/ml，备用。同时准备同样密度的未诱导BMSCs移植的导管长16mm，内径3.0mm，壁厚0.2mm，低温环氧乙烷消毒备用。

解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心六、动物体内植入实验1.细胞准备：选取生长状态良好的P3BMSCs，EGF

2.

实验分组：成年雄性Wistar大鼠40只，体重180-200g，随机分为4组，每组10只左侧为实验侧，右侧为正常自身对照侧解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心A、PNGF导管组B、PNGF复合BMSCs组C、PNGF复合BMSC-NCs组D、自体神经移植组BCDA2.实验分组：成年雄性Wistar大鼠40只，体重1解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心3.手术方法

A组：0.8%戊巴比妥钠40mg/Kg腹腔注射麻醉后，固定四肢，备皮，术野消毒、铺巾，沿左大腿后外侧做纵行切口，充分暴露坐骨神经，距梨状肌下缘下造12mm坐骨神经缺损。显微镜下将两断端各植入导管内2mm，10-0无创线将神经外膜与管壁缝合3针固定

B、C组在导管固定后，分别于两侧向导管内注入上述两种细胞各10ul（即每根导管内注入细胞5×105个细胞）

D组（自体神经移植组）切除12mm坐骨神经作为移植段，将移植段神经逆行放置，缝合神经外膜

逐层缝合切口，分笼喂养。解放军武汉总医院骨科3.手术方法小腿三头肌湿重恢复率电生理小腿三头肌细胞截面积恢复率（HE染色）组织学评价坐骨神经功能指数大体与形态学观察实验动物HE染色亚甲蓝髓鞘染色图像分析4.监测指标解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心小腿三头肌湿重恢复率电生理小腿三头肌细胞截面积恢复率（HE染术后切口愈合良好，无异物反应术后2w出现不同程度红肿、溃疡解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心5.结果术后切口愈合良好，无异物反应术后2w出现不同程度红肿、溃疡解解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8*B、C、D组与A组比较，p＜0.0015.1.坐骨神经功能指数解放军武汉总医院骨科SFI=-38.3[(EPL-NPL)/解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心5.2.电生理#*B组与A组比较，p＜0.05；△D组与B组比较，p＜0.05；#C、D组与A组比较，p＜0.001MCV测定方法解放军武汉总医院骨科5.2.电生理#*B组与A组比较，p＜0解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心5.3.小腿三头肌湿重恢复率*B、C、D组与A组比较，p＜0.001；#D组与B组比较，p＜0.05解放军武汉总医院骨科5.3.小腿三头肌湿重恢复率*B、C、D5.4.肌细胞截面积恢复率A组B组C组D组正常*B、C、D组与A组比较，p＜0.0015.4.肌细胞截面积恢复率A组B组C组D组正常*B、C、D组解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心5.5.再生神经再生神经切片图示各组再生神经解放军武汉总医院骨科5.5.再生神经再生神经切片图示各组再生解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心再生神经组织学观察HE染色亚甲蓝染色A组B组C组D组解放军武汉总医院骨科再生神经组织学观察HE染色亚甲蓝染色A组解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心*B、C、D组与A组比较，p＜0.001*B、C、D组与A组比较，p＜0.001；#D组与B组比较p＜0.01*B、C、D组与A组比较，p＜0.001；#D组与B组比较p＜0.01*#

解放军武汉总医院骨科*B、C、D组与A组比较，p＜0.001七、结论1、PRGD/PDLLA/β-TCP复合型神经导管应用于临床修复上肢周围神经缺损15例，其中11例患者感觉与运动功能不同程度恢复，改善率达73.3%，疗效等同于同类产品的临床性能，能有效促进周围神经再生，未见不良反应，可作为周围神经损伤较理想的替代疗法。2、联合利用碱性成纤维生长因子和表皮生长因子可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞定向分化为神经样细胞，与PRGD/PDLLA/β-TCP/NGF复合可成功修复大鼠12mm坐骨神经缺损，修复效果与自体神经移植相近。解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心七、结论1、PRGD/PDLLA/β-TCP复合型神经导管应新型人工神经导管修复周围神经缺损的临床应用王华松张伟才黄继锋蔡贤华付强黄一拯吴刚广州军区武汉总医院骨科解放军骨创伤救治中心广州军区骨科研究所湖北省骨创伤医学研究中心新型人工神经导管修复周围神经缺损的临床应用王华松张伟才黄继解剖特点骨折分型康复锻炼手术入路内固定方式选择临床应用解剖特点背景骨折分型动物实验典型病例研究计划Keywords解剖特点骨折分型康复锻炼手术入路内固定方式选择临床应用解剖特周围神经损伤和缺损的治疗是显微外科的难题之一，为解决自体神经来源有限、异体神经存在免疫源性等问题，众多学者致力于可替代移植物的开发。热点：组织工程化人工神经解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心Background周围神经损伤和缺损的治疗是显微外科的难题之一，为解决自体神经周围神经组织结构基底膜无髓神经有髓神经RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）基底膜的主要成分：纤维粘连蛋白

基膜粘层蛋白内皮粘连蛋白胶原含有RGD解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心轴突天然神经组织的组成及结构轴突髓鞘

纳米复合材料仿生设计

制备RGD多肽接枝聚(乳酸-羟基乙酸-L-赖氨酸)/聚乳酸/β-磷酸三钙/复合神经导管（PRGD/PDLLA/β-TCP，PRGD）

周围神经组织结构基底膜无髓神经有髓神经RGD（精氨酸-甘氨酸解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心修复大鼠10mm坐骨神经缺损修复犬30mm腓总神经缺损AnimalExperiment解放军武汉总医院骨科修复大鼠10mm坐骨神经缺损修复犬30m解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心获得了湖北省食品药品监督管理局“医疗器械临床试验”的审批。符合CFDA第5号令《医疗器械临床试验规定》的临床试验的要求；通过伦理委员会讨论同意临床试用病例选择：上肢周围神经缺损长度≤2.5cm2011.12~2013.12在我院骨科开展了15例ClinicalApplication解放军武汉总医院骨科获得了湖北省食品药品监督管理局“医疗器械解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心

监测指标观察损伤神经支配区域触觉、痛觉和移动两点辨别觉（M-2PD）恢复情况检查损伤神经支配肌肉的萎缩、肌力恢复及完成运动情况。电生理检查观察神经传导功能情况采用高频超声观察导管内外神经生长情况，观察受损神经功能恢复情况

疗效分析英国医学研究会1954年颁布的标准评定，中华医学会手外科学会上肢周围神经功能评定试用标准采用描述性统计计算功能改善率（%）解放军武汉总医院骨科监测指标观察损伤神经支配区域触觉解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心神经陈旧性损伤（12例）

病例汇总（2011.12~2013.12）神经新鲜损伤（3例）其中桡神经损伤5例；尺神经损伤5例；正中神经损伤5例其中11例（共15例）术后功能不同程度恢复，未见不良反应解放军武汉总医院骨科神经陈旧性损伤（12例）病例汇总（2男性，49岁；致左肱骨中下段骨折合并左肘上桡神经完全断裂，左手垂腕畸形，左手诸指背伸活动受限诊断：左桡神经损伤处理：急诊行左肱骨中下段骨折切开复位接骨板内固定+桡神经探查修复术解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心Case1：桡神经损伤CaseReport男性，49岁；致左肱骨中下段骨折合并左肘上桡神经完全断裂，左术后2周左手垂腕畸形，伸腕伸指受限伤口一期愈合，无不良反应解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后2周左手垂腕畸形，伸腕伸指受限伤口一期愈合，无不良反应解术后6个月伸腕伸指功能部分恢复，感觉神经传导速度接近正常(48m/s)神经纤维由近端向远端沿管壁爬行生长，远端神经可探测到神经血流信号运动功能高频B超术后7.5个月伸腕伸指功能明显改善再生神经纤维由管壁向管腔中心生长，神经血流信号较丰富运动功能高频B超术后6个月伸腕伸指功能部分恢复，感觉神经传导速度接近正常(4伸腕伸指功能基本恢复，肌力达到4级，能对抗较大阻力做主动伸腕伸指活动；感觉神经传导速度44.6m/s，运动神经传导速度达到正常（65.8m/s）术后13个月再生神经束近、远端已桥接，神经血流信号丰富（纵截面）再生神经已充满整个管腔（横截面）神经再生良好，断端及再生神经未见膨大高频B超DP解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心伸腕伸指功能基本恢复，肌力达到4级，能对抗较大阻力做主动伸腕解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后23个月伸腕伸指功能恢复，活动自如探查示神经再生良好，无神经瘤形成；PRGD神经导管已完全降解、吸收；取周围组织行病理切片未见明显不良反应。评分：伸腕＞45°（4分）；肌力＞M3（4分）；伸拇TAM活动范围正常（优4分）；伸指TAM＞健侧的75%

（良3分）。总分15分，优解放军武汉总医院骨科术后23个月伸腕伸指功能恢复，活动自如探Case2：尺神经损伤男性，12岁，剪刀扎伤致左前臂中段尺神经损伤1个月（外院未行探查修复），查体示左尺神经支配区域触觉、痛觉完全消失，环小指内收外展障碍，爪形手畸形，Froment征（+），夹纸试验（+）诊断：左尺神经陈旧性损伤处理：行左尺神经探查修复术解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术前外观Case2：尺神经损伤男性，12岁，剪刀扎伤致左前臂中段尺术中照片解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术中照片解放军武汉总医院骨科术后15个月拇对小指功能基本恢复左手无明显爪形手畸形，运动神经传导速度有所恢复（29.0m/s），感觉神经未引出激发电位

解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心评分：感觉S3

（3分）；无爪形手畸形（4分）；屈指活动范围正常（TAM优4分）。总分11分，优

术后15个月拇对小指功能基本恢复左手无明显爪形手畸形，运动神Case3：正中神经损伤女性，54岁；外伤致左前臂中上段正中神经损伤，于外院行神经探查修复术后8个月，左手拇指对掌不能、外展受限，拇、示、中指感觉减退诊断：左正中神经神经鞘瘤处理：行左正中神经探查修复术解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心Case3：正中神经损伤女性，54岁；外伤致左前臂中上段正术后6个月左拇指对掌功能明显改善，可用拇指分别与余4指捏持笔在未施加外力及施加较大阻力下，左手主动屈腕均可达正常侧80%左右解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后6个月左拇指对掌功能明显改善，可用拇指分别与余4指捏持笔术后19个月左手拇指可分别与其余手指捏持硬币（较精细物体），动作执行流畅、连贯屈腕功能；肌电图显示神经传导速度有所恢复（运动29.80m/s；感觉34.50m/s）评分：感觉S3

（3分）；屈腕肌力M4（4分）；屈指TAM活动范围正常（优4分）；拇对掌基本正常（4分）。总分15分，优解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心术后19个月左手拇指可分别与其余手指捏持硬币（较精细物体），小结改善率达73.3%等同于同类产品有效促进神经再生未见明显不良反应理想的神经修复材料PRGD/PDLLA/β-TCP神经导管Keypoint小结改善率达73.3%PRGD/PDLLA/β-TCP解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心PRGD/PDLLA/β-TCP单通道神经导管改进方法引入神经生长因子复合种子细胞，以期提高受损神经的修复效果FurtherStudy解放军武汉总医院骨科PRGD/PDLLA/β-TCP单通道神解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心技术路线BMSCs体外分离培养、纯化

动物体内植入实验

大体观察、运动功能（SFI）神经电生理评价（肌电图）

BMSCs体外定向诱导分化及鉴定

组织学评价（光镜、电镜）

神经导管体内降解情况

实验数据统计学分析

解放军武汉总医院骨科技术路线BMSCs体外分离培养、纯化动ThankYou!

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新型人工神经导管课件新型人工神经导管课件解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心1.细胞培养及纯化：无菌条件下分离8周龄雄性Wiatar大鼠双侧股骨和胫骨，完全培养基冲洗骨髓腔，冲洗液过滤、离心后接种到培养瓶；差速贴壁法进行体外扩增、纯化。P0接种7dP3五、BMSCs体外分离培养及定向诱导分化接种24hP0接种3d解放军武汉总医院骨科1.细胞培养及纯化：无菌条件下分离8周2.诱导方法：选取生长状态良好的P3细胞，24孔板中每孔接种1000个细胞；待细胞贴壁后（接种1d）进行体外诱导，并设立平行对照组3.诱导条件：终浓度20ng/ml表皮生长因子（EGF）和20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），每天加入两种生长因子，诱导8d后进行鉴定4.鉴定方法：常规固定、透膜、封闭后行免疫细胞化学鉴定。一抗（兔来源神经元特异性烯醇化酶NSE）+CY3标记羊抗兔二抗；一抗（鼠来源神经丝蛋白NF-M）+FITC标记羊抗小鼠IgG二抗；一抗（小鼠来源抗大鼠突触素蛋白SYP）+FITC标记羊抗小鼠IgG二抗。解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心2.诱导方法：选取生长状态良好的P3细胞，24孔板中每孔接诱导前诱导1d（胞质回缩）诱导5d（神经样细胞改变，伸出2个或多个突起）解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心诱导8d（细胞连接成网状）结果诱导前诱导1d（胞质回缩）诱导5d（神经样细胞改变，伸出2个解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心平行对照NSE+CY3SYP+FITCNF-M+FITC诱导8d后，NSE、NF-M、SYP阳性率表达分别为70.3±4.2、25.7±1.6、3.6±0.5解放军武汉总医院骨科平行对照NSE+CY3SYP+FITCN

1.细胞准备：选取生长状态良好的P3BMSCs，EGF与bFGF联合诱导8d，收集细胞，调整密度为107/ml，备用。同时准备同样密度的未诱导BMSCs移植的导管长16mm，内径3.0mm，壁厚0.2mm，低温环氧乙烷消毒备用。

解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心六、动物体内植入实验1.细胞准备：选取生长状态良好的P3BMSCs，EGF

2.

实验分组：成年雄性Wistar大鼠40只，体重180-200g，随机分为4组，每组10只左侧为实验侧，右侧为正常自身对照侧解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心A、PNGF导管组B、PNGF复合BMSCs组C、PNGF复合BMSC-NCs组D、自体神经移植组BCDA2.实验分组：成年雄性Wistar大鼠40只，体重1解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心3.手术方法

A组：0.8%戊巴比妥钠40mg/Kg腹腔注射麻醉后，固定四肢，备皮，术野消毒、铺巾，沿左大腿后外侧做纵行切口，充分暴露坐骨神经，距梨状肌下缘下造12mm坐骨神经缺损。显微镜下将两断端各植入导管内2mm，10-0无创线将神经外膜与管壁缝合3针固定

B、C组在导管固定后，分别于两侧向导管内注入上述两种细胞各10ul（即每根导管内注入细胞5×105个细胞）

D组（自体神经移植组）切除12mm坐骨神经作为移植段，将移植段神经逆行放置，缝合神经外膜

逐层缝合切口，分笼喂养。解放军武汉总医院骨科3.手术方法小腿三头肌湿重恢复率电生理小腿三头肌细胞截面积恢复率（HE染色）组织学评价坐骨神经功能指数大体与形态学观察实验动物HE染色亚甲蓝髓鞘染色图像分析4.监测指标解放军武汉总医院骨科广州军区骨科研究所解放军骨创伤救治中心小腿三头