纳他霉素发酵生产实验报告

纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测（广州大学生物工程系，广州510006）摘要：本实验利用褐黄孢链霉菌斜面菌种，先取约5个接种环的斜面菌种无菌接种到2瓶种子液体培养基中培养24小时，再分别在无菌条件下用移液枪吸取1mL种子培养基转接到6瓶发酵培养基，摇瓶发酵48小时后，连续3天吸取菌液进行镜检，菌液OD值测定，并利用500μg/mL的纳他霉素按照0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL加入量制定标准曲线；摇瓶发酵5天后，合并发酵液，离心获得菌泥，采用2倍菌泥体积的95%酒精，pH值在10~10.5搅拌溶解纳他霉素；离心保留上清液，上清液在Ph值在6.5，冰箱静置3h，纳他霉素在等电点析出；离心，保留产物；产物在55℃真空干燥2h，称重获得0.08g的纳他霉素。关键词：褐黄孢链霉菌；种子培养基；发酵培养基；等电点溶解；真空干燥引言：纳他霉素是一种多烯烃大环内酯类抗真菌剂，其分子是一种具有活性的环状四烯化合物，含3个以上的结晶水，其外观白色（或奶油色），为无色、无味的结晶粉末，分子式C33H47NO13，分子量为665.73。微溶于水、甲醇，溶于稀酸、冰醋酸及二甲苯甲酰胺，难溶于大部分有机溶剂。在pH值高于9或低于3时，其溶解度会有所提高。纳他霉素具有一定的抗热处理能力，在干燥状态下相对稳定，能耐受短暂高温（100℃）；但由于它具有环状化学结构、对紫外线较为敏感，故不宜与阳光接触。纳他霉素活性的稳定性受PH值、温度、光照强度和氧化剂及重金属的影响，所以产品应该避免与氧化物及硫氢化合物等接触[]。纳他霉素(Natamycin)是由一种纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatalensis)发酵产生的一种二十六元多烯大环内酯类抗生素,能有效地抑制和杀死霉菌及酵母菌,是一种安全、低毒、高效、广谱的抗真菌抗生素和天然的生物防腐剂[1]与其它抗菌产品相比,纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低,可广泛应用于由真菌引起的疾病.除此之外,纳他霉素的低溶解度,可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期,不影响风味和口感.目前,全球有30多个国家批准将纳他霉素用于乳制品、肉制品、果汁饮料、葡萄酒等的生产和保藏[2]。纳他霉素的需求量增加,市场前景巨大。纳他霉素主要由恰塔努加链霉菌(Streptomyceschattanovgensis)、纳塔尔链霉菌(Streptomycesnatu2lonso)和褐黄孢链霉菌(Streptomycesgilvosporeus)产生。在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源。纳他霉素在以葡萄糖最为碳源时产量最高[3]。因为葡萄糖能够渗入纳他霉素分子之中[3]。氮源类型对纳他霉素的产量有较大的影响。有资料表明，菌体细胞生长最好的氮源是酵母提取物，而纳他霉素产生的最佳氮源为牛肉浸出物[3]。1.实验材料与方法1.1材料：1.1.1发酵菌种：褐黄孢链霉菌1.1.2培养基：孢子斜面培养基：酵母提取粉4g/L，麦芽提取粉10g/L，葡萄糖4g/L，琼脂20g/L；pH7.0摇瓶种子培养基：葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH7.0摇瓶发酵培养基：大豆分离蛋白19.5g/L，麦芽糊精50g/L，酵母提取粉4g/L葡萄糖6g/L，pH7.01.1.3实验试剂：酵母提取粉，葡萄糖，琼脂，蛋白胨，氯化钠，大豆分离蛋白，麦芽糊精，酵母提取粉，乙醇，甲醇，20%NaOH，抗氧化剂BHA，1，2-丙二醇，纳他霉素标准品；1.1.4实验仪器：250mL三角瓶，摇床，生化培养箱，离心机，紫外分光光度计。1.2方法：1.2.1孢子的制备：按斜面孢子培养基配方准确配好培养基，121℃灭菌15min,摆斜面冷却后置于37℃培养1～2d，备用，用斜面转接管接种，25℃培养10d，待孢子长满后，放置冰箱5d以上再用。涂片观察孢子形态，并显微拍照。摇瓶种子制备：按摇瓶种子培养基配方准确配好培养基200mL，平分装在两个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。29℃，200r/min振荡培养24h，无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。1.2.3摇瓶发酵：按摇瓶发酵培养基配方准确配培养基600mL,平分装在6个三角锥瓶中，121℃灭菌25min。待培养基冷却后，取摇瓶种子1mL接种，29℃，200r/min振荡培养120～168h。每隔24h无菌取样，取1mL发酵液用于测量其303nm处OD值，另取少量涂片观察形态，并显微照相。303的测量方法：从接种后第48h开始，每隔24h从其中一瓶中取0.5mL发酵液，加入4.5mL的丙二醇，在摇床上震荡1h，12000r/min离心10min，取0.5mL上清液，再加4.5mL蒸馏水，摇匀，用紫外分光光度计在波长303nm处测定光密度。1.2.5标准曲线的制作：取50mg纳他霉素，溶于100mL丙二醇，得浓度为500ug/mL的纳他霉素原液。按表1制作曲线，横坐标为纳他霉素工作溶液浓度，纵坐标为OD303的值。（要求相关系数R2>0.99）产物浓度计算公式为：纳他霉素含量（mg/L）=X×100×n式中，X为将所测样品的浓度，100为样品处理时两次稀释倍数之积；表1纳他霉素标准曲线工作表管号123456工作溶液浓度/(ug/mL)01020304050纳他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/ml109.89.69.49.29OD30300.1370.2990.4170.5560.6691.2.5纳他霉素的分离纯化：合并全部发酵液，再12000r/min离心10min。离心前发酵液的体积与离心后上清液的体积之差即为湿菌泥的体积；加两倍湿菌泥体积的95%乙醇，20%氢氧化钠调pH10～10.5，边加边搅拌0.5h（注意一定要调过pH后再计时），以便纳他霉素充分溶解；然后再再12000r/min离心10min，保留上清液，将上清液用1mol/L盐酸调pH6.5，静置3h（冰箱），以便纳他霉素在等电点处沉淀析出；最后再12000r/min离心10min，保留沉淀（产物），将产物置于55℃真空干燥2h，称重。2.实验结果与分析2.1实验结果2.1.1标准曲线制作结果：因按表1中数据制作的标准曲线数值过大，故实验时，在6支工作溶液中各取1mL再加入4mL蒸馏水（此过程又稀释了5倍）进行OD值测定，故标准曲线结果如下表2所示：表2纳他霉素标准曲线数据管号123456工作溶液浓度/(ug/mL)01020304050纳他霉素原液/mL添加量00.20.40.60.81水/Ml109.89.69.49.29实际工作溶液浓度/(ug/mL)0246810OD30300.1370.2990.4170.5560.669以上表数据作出标准曲线，如图1所示：2.1.2发酵液检测结果：（如表3所示）表3定时测量OD值数据表培养时间/h487296144测得OD3030.0820.1030.1850.256纳他霉素浓度（ug/mL）1.0801.3922.6083.6622.1.3菌体镜检结果:(1)斜面菌镜检图片:图1×40斜面镜检图（孢子）图2×100斜面镜检图（菌丝）由图1可知：斜面的放线菌菌落呈放射状，表面干燥，有干粉。由于接种时只是刮去了表面孢子，故在较好的生长条件下，很多组的没有成功获得斜面。由图1和图2可知：在培养了一个星期后的斜面褐黄孢链霉菌的孢子繁殖，菌丝呈现断裂状。可能由于挑取时折断。由图1可知：斜面的放线菌菌落呈放射状，表面干燥，有干粉。由于接种时只是刮去了表面孢子，故在较好的生长条件下，很多组的没有成功获得斜面。由图1和图2可知：在培养了一个星期后的斜面褐黄孢链霉菌的孢子繁殖，菌丝呈现断裂状。可能由于挑取时折断。(2)种子培养基中培养24h后菌体的镜检照片:图5×40种子菌检图图6×100种子菌镜检图图5：由斜面接种的菌种在种子培养基已经生长，菌液中遍布了生长初期的放线菌。图5：由斜面接种的菌种在种子培养基已经生长，菌液中遍布了生长初期的放线菌。图6：为100倍的镜检，图片上选取的是一小团菌丝球和一些较短的菌丝片段。培养时间较短，菌丝球较小，菌丝较短。(3)发酵48h镜检结果:图7×10发酵48h镜检图图8×40发酵48h镜检图图9×100发酵48h镜检图（局部）图7：密集的红色斑点和一些因为干燥时烧焦的斑点。图7：密集的红色斑点和一些因为干燥时烧焦的斑点。图8：菌丝球变得较多，较大，还有很多孢子，菌丝片段。图9；图8的放大图，存在一些小片段菌丝和较小的菌丝球以及一些较大的菌丝团。图9×40发酵48h镜检图（局部）(4)发酵72h镜检结果；图10：比48h的更加密集的红斑图10：比48h的更加密集的红斑图11：比48h的更加多的菌丝球，更多的菌丝图12：图11的局部放大图。大菌丝球和较小的菌丝团也一些断裂的菌丝并存。图10×10发酵72h镜检图图11×40发酵72h镜检图图12×40发酵72h镜检图（局部）(5)发酵96h镜检结果:图13×40发酵96h镜检图图14×40发酵96h镜检图（局部）图13：密集的大菌丝球，小菌丝球和菌丝片段图13：密集的大菌丝球，小菌丝球和菌丝片段图14：菌丝球更大，菌丝片段(6)发酵144h镜检结果:图15×10发酵144h镜检图图16×40发酵144h镜检图（局部）图15：较明显的红色斑点图15：较明显的红色斑点图16：菌丝球最大，菌丝明显，菌丝发散，有一些分开了的较小的菌丝球和孢子2.1.4纳他霉素分离纯化结果：如下表4所示:表4产物分离纯化结果发酵液总体积/mL离心后上清液体积/mL湿菌泥体积/mL产物干重/g535.0497.0380.082.2实验结果分析2.2.1由纳他霉素标准曲线可知：标准曲线的线性系数为0.9975，线性关系比较强。制备浓度梯度的纳他霉素的校准液操作比较规范，测定OD值过程比较规范。2.2.2随着发酵时间越长，纳他霉素的生产量逐渐增多。随着发酵液的消耗，褐黄孢链霉菌菌量不多增多。而纳他霉素的产生是非生长偶联型，故在发酵72h之前，纳他霉素产量变化较小；72h~144h的产量变化较大。2.2.3由褐黄孢链霉菌发酵过程镜检图可知：种子培养基的镜检菌丝球较少，小菌丝较多。随着发酵时间增长，发酵液中菌丝球不断增大，菌丝增多，孢子产生。褐黄孢链霉菌发酵为好氧发酵，在摇瓶发酵过程，菌体会形成菌丝球。随着菌体生长，菌丝球增大，生长后期，菌体变老，孢子增多。2.2.4合并发酵液后，发酵总体积减少了65Ml,应该是菌泥浓缩，菌体生长消耗产生。菌泥体积为38Ml,体积相比较其他组的适中，产物干重为0.08g，相对其他组较多。纳他霉素的产量与种龄，接种初始Ph,发酵温度以及接种量，装液量等相关。⑴根据参考文献：通过优化实验确定摇瓶培养条件为:初始pH值7.3,装液量30mL/300mL,接种量10%,种龄40~44h,温度28℃,转速200r/min,发酵120h后测定其发酵结果(见图6).结果表明纳他霉素产量在发酵120h时达到最大值3.72g/L;DCW在96h达到最大值29.1g/L。本实验初始pH值为7.0，装液量100/mL/300mL，接种量1%，种龄为24h，温度为28℃，发酵时间约144h，纳他霉素产量为0.08g/600Ml。⑵本实验的纳他霉素发酵没有达到最优，当然相对于其他组的产量约为中上。各组之间的实验操作差异主要在接种和培养基上。本实验培养基配置过程营养损失，pH调节等比较合适。接种量和种龄可能存在较少的差