紫外-可见分光光度法课件

第四章紫外-可见分光光度法

(ultravioletvisiblespectrophotometers)历史悠久，应用最为广泛的一种光学分析法。利用被测物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。紫外可见分光光度法是在比色的基础上发展起来的。1第四章紫外-可见分光光度法

(ultravioletv第一节光的吸收定律一、郎伯-比尔（Lambert-Beer）定律1.透光度和吸光度当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被容器表面反射。2第一节光的吸收定律一、郎伯-比尔（Lambert-Bee设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则3设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It在分光光度分析中，通常将待测溶液和参比溶液分别置于同样材料和厚度的容器中，让强度为I0的单色光分别通过两个容器，再测量透射光强度。这样，反射光的强度基本相同，其影响可以互相抵消，则4在分光光度分析中，通常将待测溶液和参比溶液分别置于同样当一束单色光通过溶液后，由于吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。当光透过浓度为c，液层厚度为b的溶液时，由于一部分光被吸收，因此5当一束单色光通过溶液后，由于吸收了一部分光能，光的强度随着溶液浓度和液层厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射光的强度减小。透射光强度与入射光强度之比称为透光度（transmittance），用T表示：6随着溶液浓度和液层厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射

例如，入射光的强度为100，透射光的强度为35，则T=0.35或35%。

溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收程度愈小；相反，透光率愈小，对光的吸收程度愈大。7例如，入射光的强度为100，透射光的强度为35，则T实践证明，溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关。如果保持入射光不变，则溶液对光的吸收程度只与溶液浓度和液层厚度有关，即8实践证明，溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液为了方便起见：吸光度（absorbance）吸光系数液层厚度溶液浓度9为了方便起见：吸光度（absorbance）吸光系数液层厚度当a、c一定时，A∝bLambert’slaw当a、b一定时，A∝cBeer’slawLambert-Beer定律可表述为：在一定条件下，物质的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比，称为光吸收定律，是吸收光谱定量的依据。10当a、c一定时，A∝bLambert’slaw当a、bLambert-Beer定律是均匀、非散射介质对光吸收的基本定律，只有对入射光是单色光才完全适用。11Lambert-Beer定律是均匀、非散偏离比尔定律的因素主要原因归纳如下：

1.待测组分的浓度过高

2.化学反应的影响

3.谱带宽度过大

4.pH值的影响

5.杂质的影响

6.光散射的影响12偏离比尔定律的因素主要原因归纳如下：122.吸收系数absorptivitya为吸收系数，是指在一定入射光波长下，单位浓度及单位液层厚度时的吸光度。即一般b的单位为cm，a的单位与c的单位有关。132.吸收系数absorptivitya为吸比吸光系数specificabsorptivity比吸光系数是指一定波长时，溶液浓度为1%（w/V），厚度为1cm的吸光度，用表示。14比吸光系数specificabsorptivity摩尔吸光系数molarabsorptivity摩尔吸光系数是指一定波长时，溶液浓度c为1mol/L，液层厚度b为1cm时的吸光度，用表示。15摩尔吸光系数molarabsorptivity和不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测吸光度计算得到。16和不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测吸解：例：称取1.00mg维生素B12(M=1355)，配成25.00ml水溶液，吸收池厚度为0.5cm，在361nm波长下测得吸光度为0.414，计算摩尔吸光系数。17解：例：称取1.00mg维生素B12(M=1355)，配成2例：用纯氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278nm，用1.00cm的吸收池，测得T=24.3%，求比吸光系数和摩尔吸光系数。18例：用纯氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278与物质的本性、溶剂和入射光的波长有关，即（1）物质不同，不同，是物质的特性常数。（2）溶剂不同，同一物质的不同，所以应注明溶剂。19与物质的本性、溶剂和入射光的波长有关，即（1）物质不同，（3）不同，同一物质的吸收系数也不同，所以吸收系数应注明波长；（4）入射光的纯度：单色光是经单色器色散成波长范围很窄的光。实际上，不管单色器的分辨率有多高，所谓的单色光仍然是有一定的宽度的。例如高锰酸钾溶液的吸收曲线。20（3）不同，同一物质的吸收系数也不同，所以吸收系数应如果在AB范围内，～1700，CD范围内～2300，EF范围～2500。因此，还应考虑单色光的纯度，即使用仪器的精确度（光强和色散元件的分辨率。21如果在AB范围内，～1700，CD范围内～2300第二节紫外—可见分光光度计紫外—可见分光光度计的类型很多，但其原理基本相似。一般由五部分构成，即光源、单色器、吸收池、检测器、指示器（信号显示装置）22第二节紫外—可见分光光度计紫外—可见分光光一、分光光度计的主要部件1.光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。钨及碘钨灯：340～2500nm，多用在可见光区；氢灯和氘灯：160～375nm，多用在紫外区。23一、分光光度计的主要部件1.光源对光源基本要求：足够光强、2.单色器单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出口狭缝组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。棱镜是利用不同波长的光具有不同的折射率而使复合光分开的。用玻璃和石英制成。242.单色器单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入光栅grating利用光的衍射和干涉作用使复合光分开。其特点是：色散波长范围宽，可用于紫外、可见、红外等光谱区，分辨率高，色散率基本上不随波长改变而改变，即均匀色散（色散近于线性）。现代仪器多用光栅作色栅元件。25光栅grating利用光的衍射和干涉作用使复合光缝狭缝狭是单色器的组成部分，对单色光的纯度起着非常重要的作用。狭缝有两种表示方法（1）用狭缝的实际宽度表示，以mm为单位，一般为0～2mm，（2）用通过出射狭缝的谱带宽度表示，以nm为单位，如2nm、1nm、0.5nm及0.2nm等。狭缝愈窄，光的单色性愈好，测得的吸收峰愈尖锐，但光强度减弱，测定灵敏度降低。26缝狭缝狭是单色器的组成部分，对单色光的纯度起着非常重要的作用转动棱镜或光栅，可使光谱移动，使不同波长单色光，从出射狭缝射出。27转动棱镜或光栅，可使光谱移动，使不同波长单色光，从出射狭缝射3.吸收池absorptioncell比色皿cuvette盛放样品溶液的容器，用玻璃或石英制成，两透光面互相平行，具有精确的光程。紫外区用石英、可见区用玻璃。盛放参比的吸收池和盛放样品的吸收池应匹配，即有相同的厚度与透光性。吸收池的光学面应垂直于光束方向。283.吸收池absorptioncell比色皿cuve使用时，应进行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，当被测物的量一定时，V越小（c越大），b越大，则A越大。改进吸收池的形状，使每单位光程所占的溶液体积尽可能小，即光程/体积比即可能大。29使用时，应进行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，当常规吸收池1cm，5ml1/5=0.2微型吸收池，光程/体积比大于0.2的为微型吸收池（microcell）b=4cm，V=2，4/2=230常规吸收池1cm，5ml1/5=0.2微型吸收池，光程4.检测器将光信号转变为电信号进行检测。光电管利用光电效应的原理。光电流通过负载电阻R，将电流变成电压信号，经放大器放大后，输给记录仪。314.检测器将光信号转变为电信号进行检测。光电管利用光电暗电流电极的热电子发射而产生的电流。暗电流愈小愈好。在分光光度计中，都设有补偿电路，消除暗电流。

光电管有两种：蓝敏光电管，为铯阴极，适用波长200～625；红敏管，银氧化铯，适用波长625～100032暗电流电极的热电子发射而产生的电流。暗电流愈小愈好

光电倍增管33光电倍增管33光二极管阵列检测器photo-diodearraydetector光电二极管阵列检测器是在晶体硅上紧密排列一系列光二极管，如HP8452A型，在190～820nm，由316个二极管，当光透过晶体硅时，二极管输出的电讯号强度与光强度成正比。每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝，两个二极管中心距离的波长范围，称为采样间隔，二极管愈多，分辨率愈高，每个二极管可在1/10s，每隔2nm测一次，同时并行采集数据，在1/10s时间内，可获全光谱。34光二极管阵列检测器photo-diodearray电荷偶合阵列检测器charge-coupleddevicearraydetector，CCD5.信号处理与显示装置光电管输出的信号很弱，经过放大后才能以某种方式将测量结果显示出来。信号处理包括一些数学运算。显示器可由电表、数字显示、荧光屏显示、结果打印、曲线扫描等。显示方式有T、A，有的还可以转换成浓度，ε等。35电荷偶合阵列检测器charge-coupleddevi二、紫外可见光度计仪器分光光度计分为单波长和双波长仪器。1.单波长分光光度计单光束双光束（空间分隔）双光束（时间分隔）特点：因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。36二、紫外可见光度计仪器36光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2.双波长分光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。SB1和SB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。37光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2.第三节分光光度法的定性和定量分析吸收曲线、max和max，不同的化合物可能有相同的max，但不可能max和max完全相同，测max，通常配高、中、低三种浓度，在max处测A，计算max，求平均值。38第三节分光光度法的定性和定量分析吸收曲线光谱定性，有一定的局限性，主要是分辨率不高，在得到相同的吸收光谱时，应考虑并非同一物质的可能性，而两种纯化合物的吸收光谱有明显差别时，可肯定两化合物不同。39光谱定性，有一定的局限性，主要是分辨率不高，在得到相同的吸收二、定量方法（一）单组分定量1.标准曲线法40二、定量方法（一）单组分定量1.标准曲线法40AcAxcx标准曲线41AcAxcx标准曲线41校准曲线、线性范围和测定限校准曲线也称校正曲线，是表示被测物质浓度或量与测定仪器响应信号值之间的定量关系曲线，包括工作曲线和标准曲线。42校准曲线、线性范围和测定限校准曲线也称校正曲校正曲线的绘制线性回归，即用最小二乘法求回归方程43校正曲线的绘制线性回归，即用最小二乘法求回归方程43使用校正曲线时需注意：至少5个点，一般5～10个点，并且应至少一个数量级范围。纵坐标上的最小刻度应与响应值的实际有效数字相适应。尽量使曲线的效率接近1。每次测定样品时应同时绘制标准曲线。44使用校正曲线时需注意：至少5个点，一般5～10个点，并且应至线性范围测定限上限、下限45线性范围测定限上限、下限45灵敏度和检出限灵敏度（Sensitivity）指该方法对单位浓度或量的被测物质的变化所引起的分析信号值的变化程度。常以标准曲线的效率衡量。46灵敏度和检出限灵敏度（Sensitivity）指该方法对检出限Limitofdetection指对某一特定方法，在给定的置信水平内，可以从试样中定性检出待测物质的最小浓度或量。对于不同的系统，计算方法不同，即使同一系统，方法不同，计算方法也不同。IUPAC规定：47检出限Limitofdetection对于光谱分析，可测量的最小分析信号xL为空白试验多次测量的平均值根据一定置信度确定的系数空白试验多次测量的标准差48对于光谱分析，可测量的最小分析信号xL为空白试验多次测量的平与相对应的浓度或量即为检出限L方法的灵敏度49与相对应的浓度或量即为检出限L方法的灵敏度492.标准比较法该法是标准曲线法的简化，即只配制一个浓度为cs的标准溶液，并测量其吸光度，求出吸收系数k，然后由Ax=kcx求出cx502.标准比较法该法是标准曲线法的简化，即只该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且cx与cs大致相当时，才可得到准确结果。51该法只有在测定浓度范围内遵守L-B定律，且c（二）多组分定量方法

由于吸光度具有加合性，因此可以在同一试样中测定多个组份。设试样中有两组份a和b，将其显色后，分别绘制吸收曲线，会出现如图所示的三种情况：52（二）多组分定量方法由于吸光度具有加合性，因53531.解方程组541.解方程组542.双波长法—等吸收点法552.双波长法—等吸收点法55测定b组分时，选择b组分的最大吸收波长作测定波长1，由b的峰顶向横坐标作垂线与a吸收曲线的一侧相交，从相交点作横坐标的平行线与a吸收曲线的另一侧相交，交点所对应的波长为参比波长2。在1和2处分别测量吸光度与，然后相减求。56测定b组分时，选择b组分的最大吸收波长作测定波长1，由b的在两波长处a组分的吸光度相等，b组分的吸光度差值与b组分的浓度呈正比。测组分a时，可用相同的方法选择b组分具有等吸收的两个波长，消去b的干扰，测定a组分的浓度。

57在两波长处a组分的吸光度相等，第四节分析条件的选择仪器条件的选择

1.入射光波长的选择：

2.吸光度范围的选择：0.2~0.83.狭缝宽度的选择：

4.吸收池的选择：58第四节分析条件的选择仪器条件的选择58分析条件的选择显色条件的选择：

1.显色剂的用量

2.溶液值

3.显色温度

4.显色时间59分析条件的选择显色条件的选择：59分析条件的选择参比溶液的选择

1.溶剂参比溶液

2.试样参比溶液

3.试剂参比溶液

4.平行操作参比溶液60分析条件的选择参比溶液的选择60第四章紫外-可见分光光度法

(ultravioletvisiblespectrophotometers)历史悠久，应用最为广泛的一种光学分析法。利用被测物质对光的吸收特征和吸收强度，对物质进行定性、定量分析的一种分析方法。紫外可见分光光度法是在比色的基础上发展起来的。61第四章紫外-可见分光光度法

(ultravioletv第一节光的吸收定律一、郎伯-比尔（Lambert-Beer）定律1.透光度和吸光度当一束单色光通过溶液时，一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被容器表面反射。62第一节光的吸收定律一、郎伯-比尔（Lambert-Bee设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It，反射光强度为Ir，则63设入射光强度为I0，吸收光强度为Ia，透射光强度为It在分光光度分析中，通常将待测溶液和参比溶液分别置于同样材料和厚度的容器中，让强度为I0的单色光分别通过两个容器，再测量透射光强度。这样，反射光的强度基本相同，其影响可以互相抵消，则64在分光光度分析中，通常将待测溶液和参比溶液分别置于同样当一束单色光通过溶液后，由于吸收了一部分光能，光的强度就会减弱。当光透过浓度为c，液层厚度为b的溶液时，由于一部分光被吸收，因此65当一束单色光通过溶液后，由于吸收了一部分光能，光的强度随着溶液浓度和液层厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射光的强度减小。透射光强度与入射光强度之比称为透光度（transmittance），用T表示：66随着溶液浓度和液层厚度的增加，光被吸收的程度增加，透射

例如，入射光的强度为100，透射光的强度为35，则T=0.35或35%。

溶液的透光率愈大，表示它对光的吸收程度愈小；相反，透光率愈小，对光的吸收程度愈大。67例如，入射光的强度为100，透射光的强度为35，则T实践证明，溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液层厚度及入射光波长等因素有关。如果保持入射光不变，则溶液对光的吸收程度只与溶液浓度和液层厚度有关，即68实践证明，溶液对光的吸收程度与溶液浓度、液为了方便起见：吸光度（absorbance）吸光系数液层厚度溶液浓度69为了方便起见：吸光度（absorbance）吸光系数液层厚度当a、c一定时，A∝bLambert’slaw当a、b一定时，A∝cBeer’slawLambert-Beer定律可表述为：在一定条件下，物质的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比，称为光吸收定律，是吸收光谱定量的依据。70当a、c一定时，A∝bLambert’slaw当a、bLambert-Beer定律是均匀、非散射介质对光吸收的基本定律，只有对入射光是单色光才完全适用。71Lambert-Beer定律是均匀、非散偏离比尔定律的因素主要原因归纳如下：

1.待测组分的浓度过高

2.化学反应的影响

3.谱带宽度过大

4.pH值的影响

5.杂质的影响

6.光散射的影响72偏离比尔定律的因素主要原因归纳如下：122.吸收系数absorptivitya为吸收系数，是指在一定入射光波长下，单位浓度及单位液层厚度时的吸光度。即一般b的单位为cm，a的单位与c的单位有关。732.吸收系数absorptivitya为吸比吸光系数specificabsorptivity比吸光系数是指一定波长时，溶液浓度为1%（w/V），厚度为1cm的吸光度，用表示。74比吸光系数specificabsorptivity摩尔吸光系数molarabsorptivity摩尔吸光系数是指一定波长时，溶液浓度c为1mol/L，液层厚度b为1cm时的吸光度，用表示。75摩尔吸光系数molarabsorptivity和不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测吸光度计算得到。76和不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测吸解：例：称取1.00mg维生素B12(M=1355)，配成25.00ml水溶液，吸收池厚度为0.5cm，在361nm波长下测得吸光度为0.414，计算摩尔吸光系数。77解：例：称取1.00mg维生素B12(M=1355)，配成2例：用纯氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278nm，用1.00cm的吸收池，测得T=24.3%，求比吸光系数和摩尔吸光系数。78例：用纯氯霉素配制100ml含2.00mg的溶液，在278与物质的本性、溶剂和入射光的波长有关，即（1）物质不同，不同，是物质的特性常数。（2）溶剂不同，同一物质的不同，所以应注明溶剂。79与物质的本性、溶剂和入射光的波长有关，即（1）物质不同，（3）不同，同一物质的吸收系数也不同，所以吸收系数应注明波长；（4）入射光的纯度：单色光是经单色器色散成波长范围很窄的光。实际上，不管单色器的分辨率有多高，所谓的单色光仍然是有一定的宽度的。例如高锰酸钾溶液的吸收曲线。80（3）不同，同一物质的吸收系数也不同，所以吸收系数应如果在AB范围内，～1700，CD范围内～2300，EF范围～2500。因此，还应考虑单色光的纯度，即使用仪器的精确度（光强和色散元件的分辨率。81如果在AB范围内，～1700，CD范围内～2300第二节紫外—可见分光光度计紫外—可见分光光度计的类型很多，但其原理基本相似。一般由五部分构成，即光源、单色器、吸收池、检测器、指示器（信号显示装置）82第二节紫外—可见分光光度计紫外—可见分光光一、分光光度计的主要部件1.光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长变化小。钨及碘钨灯：340～2500nm，多用在可见光区；氢灯和氘灯：160～375nm，多用在紫外区。83一、分光光度计的主要部件1.光源对光源基本要求：足够光强、2.单色器单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入射狭缝、准直镜、色散元件、聚焦元件和出口狭缝组成。常用的色散元件有棱镜和光栅。棱镜是利用不同波长的光具有不同的折射率而使复合光分开的。用玻璃和石英制成。842.单色器单色器的用途就是把混合光变成单色光，由入光栅grating利用光的衍射和干涉作用使复合光分开。其特点是：色散波长范围宽，可用于紫外、可见、红外等光谱区，分辨率高，色散率基本上不随波长改变而改变，即均匀色散（色散近于线性）。现代仪器多用光栅作色栅元件。85光栅grating利用光的衍射和干涉作用使复合光缝狭缝狭是单色器的组成部分，对单色光的纯度起着非常重要的作用。狭缝有两种表示方法（1）用狭缝的实际宽度表示，以mm为单位，一般为0～2mm，（2）用通过出射狭缝的谱带宽度表示，以nm为单位，如2nm、1nm、0.5nm及0.2nm等。狭缝愈窄，光的单色性愈好，测得的吸收峰愈尖锐，但光强度减弱，测定灵敏度降低。86缝狭缝狭是单色器的组成部分，对单色光的纯度起着非常重要的作用转动棱镜或光栅，可使光谱移动，使不同波长单色光，从出射狭缝射出。87转动棱镜或光栅，可使光谱移动，使不同波长单色光，从出射狭缝射3.吸收池absorptioncell比色皿cuvette盛放样品溶液的容器，用玻璃或石英制成，两透光面互相平行，具有精确的光程。紫外区用石英、可见区用玻璃。盛放参比的吸收池和盛放样品的吸收池应匹配，即有相同的厚度与透光性。吸收池的光学面应垂直于光束方向。883.吸收池absorptioncell比色皿cuve使用时，应进行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，当被测物的量一定时，V越小（c越大），b越大，则A越大。改进吸收池的形状，使每单位光程所占的溶液体积尽可能小，即光程/体积比即可能大。89使用时，应进行校正（小于0.5%）由L—Blaw可知，当常规吸收池1cm，5ml1/5=0.2微型吸收池，光程/体积比大于0.2的为微型吸收池（microcell）b=4cm，V=2，4/2=290常规吸收池1cm，5ml1/5=0.2微型吸收池，光程4.检测器将光信号转变为电信号进行检测。光电管利用光电效应的原理。光电流通过负载电阻R，将电流变成电压信号，经放大器放大后，输给记录仪。914.检测器将光信号转变为电信号进行检测。光电管利用光电暗电流电极的热电子发射而产生的电流。暗电流愈小愈好。在分光光度计中，都设有补偿电路，消除暗电流。

光电管有两种：蓝敏光电管，为铯阴极，适用波长200～625；红敏管，银氧化铯，适用波长625～100092暗电流电极的热电子发射而产生的电流。暗电流愈小愈好

光电倍增管93光电倍增管33光二极管阵列检测器photo-diodearraydetector光电二极管阵列检测器是在晶体硅上紧密排列一系列光二极管，如HP8452A型，在190～820nm，由316个二极管，当光透过晶体硅时，二极管输出的电讯号强度与光强度成正比。每一个二极管相当于一个单色仪的出口狭缝，两个二极管中心距离的波长范围，称为采样间隔，二极管愈多，分辨率愈高，每个二极管可在1/10s，每隔2nm测一次，同时并行采集数据，在1/10s时间内，可获全光谱。94光二极管阵列检测器photo-diodearray电荷偶合阵列检测器charge-coupleddevicearraydetector，CCD5.信号处理与显示装置光电管输出的信号很弱，经过放大后才能以某种方式将测量结果显示出来。信号处理包括一些数学运算。显示器可由电表、数字显示、荧光屏显示、结果打印、曲线扫描等。显示方式有T、A，有的还可以转换成浓度，ε等。95电荷偶合阵列检测器charge-coupleddevi二、紫外可见光度计仪器分光光度计分为单波长和双波长仪器。1.单波长分光光度计单光束双光束（空间分隔）双光束（时间分隔）特点：因光束几乎同时通过样品池和参比池，因此可消除光源不稳产生的误差。96二、紫外可见光度计仪器36光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2.双波长分光度计通过切光器使两束不同波长的光交替通过吸收池，测得吸光度差A。SB1和SB2分别为在1和2处的背景吸收，当1和2相近时，背景吸收近似相等。二式相减，得这表明，试样溶液浓度与两个波长处的吸光光差成正比。特点：可测多组份试样、混浊试样、而且可作成导数光谱、不需参比液(消除了由于参比池的不同和制备空白溶液等产生的误差)、克服了电源不稳而产生的误差，灵敏度高。97光源检测器单色器单色器切光器吸收池双波长分光光度计示意图2.第三节分光光度法的定性和定量分析吸收曲线、max和max，不同的化合物可能有相同的max，但不可能max和max完全相同，测max，通常配高、中、低三种浓度，在max处测A，计算max，求平均值。98第三节分光光度法的定性和定量分析吸收曲线光谱定性，有一定的局限性，主要是分辨率不高，在得到相同的吸收光谱时，应考虑并非同一物质的可能性，而两种纯化合物的吸收光谱有明显差别时，可肯定两化合物不同。99光谱定性，有一定的局限性，主要是分辨率不高，在得到相同的吸收二、定量方法（一）单组分定量1.标准曲线法100二、定量方法（一）单组分定量1.标准曲线法40AcAxcx标准曲线101AcAxcx标准曲线41校准曲线、线性范围和测定限校准曲线也称校正曲线，是表示被测物质浓度或量与测定仪器响应信号值之间的定量关系曲线，包括工作曲线和标准曲线。102校准曲线、线性范围和测定限校准曲线也称校正曲校正曲线的绘制线性回归，即用最小二乘法求回归方程103校正曲线的绘制线性回归，即用最小二乘法求回归方程43使用校正曲线时需注意：至少5个点，一般5～10个点，并且应至少一个数量级范围。纵坐标上的最小刻度应与响应值的实际有效数字相适应。尽量使曲线的效率接近1。每次测定样品时应同时绘制标准曲线。104使用校正曲线时需注意：至少5个点，一般5～10个点，并且应至线性范围测定限上限、下限105线性范围测定限上限、下限45灵敏度和检出限灵敏度（Sensitivity）指该方法对单位浓度或量的被测物质的变化所引起的分析信号值的变化程度。常以标准曲线的效率衡量。106灵敏度和检出限灵敏度（Sensitivity）指该方法对