植物生物反应器-课件

1第6章植物生物反应器1第6章植物生物反应器12第6章植物生物反应器第1节植物生物反应器概述第2节植物生物反应器的医药工程第3节植物生物反应器生产其他有机物第4节植物生物反应器的研制策略第5节存在问题和可能的解决方法2第6章植物生物反应器第1节植物生物反应器概述23第1节植物生物反应器概述生物反应器生物技术产品生产中的主体设备。生物反应器是可用来进行微生物或基因工程细胞发酵或利用酶进行生化反应者。机械搅拌式发酵槽应用最广。利用动物、植物本身作为反应器。3第1节植物生物反应器概述生物反应器34近年来，转基因植物作为生物反应器来表达外源蛋白(包括疫苗、抗体、药用蛋白)，即所谓的“分子农业(molecularfarming)”已成为植物基因工程领域内一个研究的生长点，具有极大的市场前景和商业价值。目前，已用于生物反应器的植物有烟草、拟南芥、大豆、小麦、水稻、玉米、油菜、马铃薯、西红柿等。本章将就这一领域的发展现状，存在的问题及前景进行简要综述。4近年来，转基因植物作为生物反应器来表达外源蛋白(包括疫苗、451.1植物生物反应器的概念说法1：植物生物反应器，就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官，以及整株植物为工厂来生产具有商业价值的生物制品包括疫苗、抗体、药用蛋白等等。51.1植物生物反应器的概念说法1：植物生物反应器，就是56说法2：植物生物反应器是指通过基因工程途径，以植物悬浮细胞培养或整株植物为“工厂”，大量生产药物、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类等有机化合物。6说法2：植物生物反应器是指通过基因工程途径，以植物悬浮细胞67广义上讲，植物生物反应器不仅仅指经基因工程改造的植物细胞、组织器官以及整株植物，也包括天然的植物，例如一些天然植物的次生代谢产物也具有重要的药用价值。7广义上讲，植物生物反应器不仅仅指经基因工程改造的植物细胞、78

1.2植物生物反应器的优点1.2.1植物是最经济的蛋白质生产系统

种植植物所需要的仅是阳光,来自土壤或肥料的矿质营养、水分。这一点明显优于微生物发酵和动物细胞的培养，因为微生物发酵需要昂贵的设备投入，而动物细胞的培养需要昂贵的生长培养基，而且要保持无菌的生产条件。81.2植物生物反应器的优点1.2.1植物是最经济的891.2.2植物可以大规模种植,而且产物贮藏在种子、果实、块茎中便于贮运例如，在室温条件下经过5个月储存的水稻种子中，scFv(singlechainFv)的含量和活性没有明显的损失。在4℃条件下，储存18个月的铃薯仍保留50%的有活性的抗体。91.2.2植物可以大规模种植,而且产物贮藏在种子、果实、910相关知识单链抗体(Single-chainFv，ScFv)是将抗体变异区(fragmentofvariableregion，Fv)中的重链变异区(variableregionofheavychain，VH)和轻链变异区(variableregionoflightchain，VL)以人为的连接子(linker)连接起来，是深具应用潜力的蛋白质工程产物。具有分子量小、组织穿透能力强及免疫原性低等特点，在疾病的诊断及治疗应用方面具有很大潜力。

10相关知识单链抗体(Single-chainFv，ScF10111.2.3植物具有完整的真核细胞表达系统表达产物能进行正确的折叠装配，及糖基化、磷酸化、酰胺化，从而具有与高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性。111.2.3植物具有完整的真核细胞表达系统表达产物能进11121.2.4植物生物反应器的表达产物具有无毒性和副作用,安全可靠,无残存DNA和潜在致病致癌性用动物细胞作为生物反应器,则有可能因为动物本身携带的致病原而对人的健康造成威胁。121.2.4植物生物反应器的表达产物具有无毒性和副作用1213由于植物具有上述优势,所以分子农业的设想在20世纪80年代末一经提出,就成为转基因植物领域的研究热点。目前,在植物生物反应器上已取得一定成绩,这主要表现在3个方面：一是在植物中表达抗体二是利用植物生产疫苗三是利用植物生产其他药用蛋白。13由于植物具有上述优势,所以分子农业的设想在20世纪80年1314第2节植物生物反应器应用研究2.1植物抗体2.2口服疫苗2.3其他药用蛋白14第2节植物生物反应器应用研究2.1植物抗体14152.1植物抗体抗体(antibody)是动物体液中的一系列球蛋白,称为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。它们可介导动物的体液免疫反应。将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物,在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段即植物抗体。152.1植物抗体抗体(antibody)是动物体液中的1516植物抗体最大的优点是使生产抗体更加方便和廉价。尤其在生产单克隆抗体方面,利用植物生产要比杂交瘤细胞低廉的多。据估计，在250m2的温室中利用苜蓿生产IgG的成本约为500~600美元/g，而利用杂交瘤细胞生产抗体的成本约为5000美元/g。16植物抗体最大的优点是使生产抗体更加方便和廉价。尤其在生产1617因此,利用植物生产抗体具有广阔的市场前景。目前,利用转基因植物表达的抗体包括完整的抗体分子、分泌型抗体IgA、IgG、单链可变区片段(scFv)、Fab片段、双特异性scFv片段以及嵌合型抗体等不同类型的抗体。17因此,利用植物生产抗体具有广阔的市场前景。目前,利用转基1718Ma等（2019）将鼠的单克隆抗体的J链、杂合的IgA-G重链、鼠的J链和兔的SC链、分别转化烟草，获得4个转基因株系，经后代连续的有性杂交，得到同时表达4个蛋白质链的转基因植株，这4种蛋白质链能组装成一个有功能的分泌型免疫球蛋白。18Ma等（2019）将鼠的单克隆抗体的J链、杂合的IgA-1819McCormick等（2019）利用烟草花叶病毒(TMV)为载体在烟草中瞬时表达了一种肿瘤起源的scFv，该抗体是淋巴瘤特异的疫苗，经过这种疫苗免疫的小鼠能够产生10Lg/ml以上的抗独特性抗体，能够抵制致死剂量的肿瘤。Zeitlin等（2019）将人抗单纯疱疹病毒(anti-herpessimplexvirus，HSV)的抗体在大豆中表达，其效果已在小鼠模型中得到证实，能够预防HSV-2的传播。19McCormick等（2019）利用烟草花叶病毒(TMV1920Ma等(2019)将引起龋齿的链球菌(Sreptpcpccusmutants)表面抗原的嵌合抗体IgA-G引入到烟草中，该抗体对抑制链球菌(Sreptpcpccusmutants)的作用与杂交瘤细胞产生的抗体一样。临床实验证实，该抗体可以有效清除人口腔内的变异链球菌(S.mutans)，并预防志愿者口腔产生龋齿。目前已被作为牙膏的一种成分，进入二期临床试验。20Ma等(2019)将引起龋齿的链球菌(Sreptpcpc2021Stoger（2000）等在水稻和小麦中成功表达了癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)的scFv抗体，CEA是一种肿瘤相关标记抗原，可以利用CEA的抗体进行癌症的治疗。CarcinoembryonicAntigen(CEA)Carcinoembryonicantigen(CEA)preparation.21Stoger（2000）等在水稻和小麦中成功表达了癌胚2122Hull等（2019）在烟草中表达了炭疽杆菌保护抗原特异性单克隆抗体,在活体内外均表现出毒素中和活性,这项研究表明用植物生产炭疽杆菌单克隆抗体可以成功地用于预防。22Hull等（2019）在烟草中表达了炭疽杆菌保护抗原特异2223在放大31207倍的高倍显微镜下，拍到了斯特恩炭疽杆菌的孢子。这些孢子可存活很多年，这使得炭疽杆菌能在休眠状态下存活。23在放大31207倍的高倍显微镜下，拍到了斯特恩炭疽杆菌的2324能生产狂犬病抗体的烟草24能生产狂犬病抗体的烟草2425植物不仅作为生物反应器生产抗体用于医药产业，而且植物抗体介导的免疫调节在植物抗病育种上也很值得研究。Fecker等(2000)将抗甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的外壳蛋白基因的scFv转化烟草，产生的scFv定位于细胞质中或通过末端的连接信号肽而分泌到质外体，结果发现转scFv的植株出现症状的时间明显迟于对照。25植物不仅作为生物反应器生产抗体用于医药产业，而且植物抗体2526另外，在植物细胞中表达具有催化或钝化酶和激素作用的抗体，从而对细胞代谢进行调节，这对于植物代谢机理的研究非常有用。26另外，在植物细胞中表达具有催化或钝化酶和激素作用的抗体，26272.2口服疫苗传染病严重威胁人类的生命和健康，一直以来人类获得免疫预防主要通过疫苗接种。但在发展中国家，昂贵的疫苗造成数百万人尤其是儿童依然死于传染病。目前利用植物作为生物反应器生产口服疫苗，极大降低了疫苗的生产成本，并且研究表明植物疫苗确实可以使人和动物产生相应的免疫应答，因此这一新技术将有助于疫苗的普及从而改善发展中国家人民的健康状况。272.2口服疫苗传染病严重威胁人类的生命和健康，一直以2728转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。转基因植物疫苗有两个研究方向:一种是利用植物生产大量的蛋白质抗原，经分离和提纯再制备成疫苗；另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。与注射疫苗相比,可食疫苗具有成本低,便于运输储存及使用方便等优点,因此成为基因工程疫苗的研究热点。28转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,2829目前，科学家正在进行植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗糖尿病疫苗以及利用植物生产加强免疫效应的辅助佐剂方面的研究。Tacket等（2000）将转诺沃克病毒外壳蛋白基因的马铃薯让20个志愿者服用，结果19个人产生特异性IgG，6个人产生特异性IgA，说明95%的人对诺沃克病毒产生了抵抗力。29目前，科学家正在进行植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗2930Shchelkunov等（2019）首次研究了一种能同时抗两种病毒的疫苗，将编码艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因导入番茄并得以表达。30Shchelkunov等（2019）首次研究了一种能同时3031Li等（2019）将霍乱毒素B亚基ctb基因融合到糖尿病自身抗原基因中，用来转化低烟碱烟草，对产物进行功能性分析后，发现该融合蛋白具有与天然CTB一样的生物活性及免疫活性，包括GM1神经节苷酯受体结合能力，表明CTB3/InsB3融合蛋白可通过诱导口服免疫耐受能力来预防和治疗自身免疫糖尿病。31Li等（2019）将霍乱毒素B亚基ctb基因融合到糖尿病3132迄今在植物中表达的疫苗有几十种，包括乙肝病毒表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HbsAg)，诺沃克病毒(Norwalkvirus)外壳蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)、霍乱毒素的A，B亚基(CT-A，B)、冠状病毒(Coronavirus)的免疫原糖蛋白S多肽、狂犬病毒糖蛋白、口蹄疫病毒(foot-andmouthdiseasevirus)抗原、水貂肠炎病毒抗原、犬细小病毒抗原。32迄今在植物中表达的疫苗有几十种，包括乙肝病毒表面抗原(h3233研究人员用于表达疫苗的植物多为烟草、马铃薯、西红柿，但这些植物作为口服疫苗都存在缺点，如烟草不能食用，马铃薯不易生食，而西红柿不易长期贮存。因此更宜于生产口服疫苗的是那些含有大量可溶性蛋白、耐贮运的种子植物，特别是水稻、小麦、玉米，其胚乳中含有丰富可溶性蛋白能够与种子其余部分分开，从而降低植物疫苗服用剂量。此外，植物必须高水平表达疫苗才能达到口服免疫的效果。v.youku/v_show/id_co00XMTcxNDA4MDQ=.html

33研究人员用于表达疫苗的植物多为烟草、马铃薯、西红柿，但这33342.3其他药用蛋白植物作为生物反应器除了可以生产抗体疫苗外，还可表达细胞因子、酶及其它药用蛋白和生物活性肽等。但是利用植物生产上述细胞因子、酶、药用蛋白和生物活性肽等需要下游纯化，只有它占总可溶性蛋白(Totalsolubleprotein，TSP)的1%以上才具有商业开发的价值。342.3其他药用蛋白植物作为生物反应器除了可以生产抗体3435Verwoerd等（2019）将黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即植酸酶)基因转入烟草，在成熟种子中植酸酶占总可溶性蛋白的1%。Witcher等（2019）利用转基因玉米生产重组的β-葡萄苷酸酶(GUS)，表达水平高达种子总可溶性蛋白的0.7%，且生物活性与天然的的GUS相同。植物性饲料中，约有70%的磷以植酸磷的形式存在。由于单胃动物消化道中缺乏分解植酸磷的植酸酶，故导致植物性饲料中总磷的消化利用率很低。植酸酶可水解植酸，提高植物性饲料中总磷的利用率。35Verwoerd等（2019）将黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即3536Hood等（2019）在转基因玉米中成功表达了重组抗生物素蛋白，其表达量占总可溶性蛋白的2%。与从鸡蛋清中提取的相比具有相同的功效而成本却大大降低了。现已成为Sigma-Aldrich的商品。Moloney（2019）等将人的亮氨酸脑啡肽基因导入油菜中，先以种子贮藏蛋白2S清蛋白的形式表达，再用胰蛋白酶水解，获得的脑啡肽产量达到220nmol/g种子，脑啡肽临床可作为止痛剂或镇定剂。36Hood等（2019）在转基因玉米中成功表达了重组抗生物3637此外，在转基因油菜种子油体中高效表达的水蛭素目前已经在加拿大投入商业生产，这是第一个用来商业开发的范例。37此外，在转基因油菜种子油体中高效表达的水蛭素目前已经在加3738水蛭素是水蛭（蚂蟥）的唾液腺分泌的一种酸性多肽，是目前已知的最强有力的凝血酶的天然抑制剂。对多种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，特别是对外科手术后及深栓治疗后的再栓塞有重要的预防和治疗效果。因此，水蛭素将成为新的抗凝血抗血栓形成的药物。38水蛭素是水蛭（蚂蟥）的唾液腺分泌的一种酸性多肽，是目前已3839Sijmous等人将人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)编码区与烟草的一个蛋白分泌信号肽序列的融合基因转入马铃薯，表达的融合蛋白占总可溶性蛋白的0.02%.39Sijmous等人将人血清白蛋白(humanserum3940此外在植物中表达的其它人源蛋白的含量也很低。例如B-干扰素的含量低于0.03%(鲜重)、促红细胞生长因子(EPO)占总可溶性蛋白的0.003%。人工合成的人表皮因子在烟草中的表达量仅达到总可溶性蛋白的0.001%，因此尚不具备开发价值，需通过进一步的研究来提高表达量。40此外在植物中表达的其它人源蛋白的含量也很低。例如B-干扰4041胰岛素41胰岛素4142424243第3节植物生物反应器生产其他有机物关于工农业用蛋白质在植物中表达的报道：首先进行商品化的两种转基因植物生产的蛋白分别是利用转基因玉米生产的鸡源抗生素（亲和素）和大肠杆菌来源的葡糖醛酸酶，它们都应用于分子生物学中作为诊断试剂盒。43第3节植物生物反应器生产其他有机物关于工农业用蛋白质在4344亲合素（Avidin）在诊断试剂中的应用十分广泛，它是蛋清中比较丰富的一种真核生物蛋白，在常规情况下可从蛋清中直接分离纯化。在转基因玉米中研究生产这种蛋白，以确定它是否能够与蛋清来源的鸡亲合素进行商业化竞争。将一个鸡亲合素蛋白的编码序列按照玉米偏爱的密码子进行优化，然后与大麦α-淀粉酶信号肽编码序列融合，并导入玉米染色体中表达。44亲合素（Avidin）在诊断试剂中的应用十分广泛，它是蛋4445每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素，据估计这种玉米来源的亲合素成本约比蛋清来源的亲合素低10倍。玉米亲合素具有与天然蛋白相同的生物活性，现在成为商品公开出售（见Sigma-Aldrichproduct#A8706）。45每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素，据估计这种玉4546利用转基因植物生产的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）也已经商品化。gus基因是报告基因（reportergene），是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，其来自于大肠杆菌，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶或β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS），能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。46利用转基因植物生产的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）也已经商品4647Zeigler等（2000）报道了细菌的纤维素酶在拟南芥中的表达，其表达量高达25%。47Zeigler等（2000）报道了细菌的纤维素酶在拟南芥4748动物血红蛋白灵芝和烟草48动物血红蛋白灵芝和烟草4849表2利用转基因植物表达的其他药用蛋白(2019年后)药用蛋白表达植物用途参考文献人酸性β-葡萄糖苷酶烟草治疗葡萄糖脑苷脂酶缺乏症Reggit，2019人血清蛋白水稻治疗低清蛋白血症和外伤性休克Uuangt,2019人乳铁蛋白水稻免疫系统调节,促细胞生长Nandit,2019胰升糖素样肽水稻治疗糖尿病Yasudat，201949表2利用转基因植物表达的其他药用蛋白(2019年后)药4950续表药用蛋白表达植物用途参考文献白细胞介素-12番茄抗肿瘤免疫和抗病毒免疫G-OrRgat,2019血栓调节素烟草治疗血栓Schinkelt，2019基本成纤维细胞生长因子大豆治疗心血管及神经变性疾病Dingt,2019人骨形态发生蛋白-2烟草促进骨愈合Suot1,201950续表药用蛋白表达植物用途参考文献白细胞介素-12番茄抗5051续表药用蛋白表达植物用途参考文献人α-L-艾杜糖苷酸酶烟草治疗人溶酶体贮存障碍Kermodet,2019人表皮生长因子烟草治疗创伤烧伤,溃疡及角膜外伤Bait，2019人成纤维细胞生长因子8b烟草癌症靶向治疗Potu]at,2019人α-1抗胰蛋白酶番茄治疗肺气肿,纤维囊泡症,肝癌Agaiwalt，2019人生长激素水稻治疗侏儒症,骨折,皮肤烧伤,出血性溃疡Kimt,201951续表药用蛋白表达植物用途参考文献人α-L-艾杜糖苷酸酶烟5152第4节植物生物反应器的研制策略植物基因工程生产药用蛋白的过程一般包括目的基因的克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞的组织培养和植株再生、转化植株栽培、目标产品的分离纯化及纯度鉴定等，其中载体表达系统主要有两种：稳定的整合表达系统和瞬时表达系统。52第4节植物生物反应器的研制策略植物基因工程生产药用蛋白52534.1转基因植物稳定整合表达系统外源基因导入宿主细胞并整合到宿主基因组中，且能够稳定表达目的蛋白的转基因植株称为稳定表达系统。利用农杆菌介导法或DNA直接转移法，把编码生物活性蛋白的外源基因或编码结构性抗原决定簇参与诱导保护性免疫应答的病原体DNA导入植物细胞，并整合到植物细胞染色体上。534.1转基因植物稳定整合表达系统外源基因导入宿主细胞5354整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，并在生长过程中表达生物活性蛋白和疫苗，同时把能表达异源性蛋白的性状遗传给子代，形成稳定的表达生物活性蛋白的植物品系。54整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，并在5455Ponstein等(2019)将来源于A.niger

植酸酶phy基因转移到油菜籽中，用种子特异性启动子CruA控制phyA，并在植酸酶成熟肽前加上十字花科信号肽序列，结果发现95％的油菜籽实中检测到了植酸酶的活性，此酶对胃蛋白酶具有抗性。55Ponstein等(2019)将来源于A.niger55564.2重组植物病毒瞬时表达系统瞬时表达系统是利用可在植物中自行复制的植物病毒为载体表达异源蛋白。植物病毒具有广寄主性，能够感染多种植物，且基因组小，易于进行遗传操作。以植物病毒为载体，将编码生物活性蛋白的基因或编码疫苗抗原决定簇基因插入植物病毒基因组中，并置于强启动子的控制下，然后用此重组病毒感染植物，外源基因即随病毒的复制而高水平表达（接种后1—2周），从已感染病毒的叶片中提取病毒蛋白，酶解后即可获得目标蛋白。564.2重组植物病毒瞬时表达系统瞬时表达系统是利用可在植5657一般病毒蛋白可以占到感染病毒叶片总蛋白含量的50%。外源蛋白产生的形式或是独立的多肽，或与病毒基因产物融合。大多数植物病毒可借助快速的机械接种感染植物，适合于大规模的商业化生产，利用这类方法有望获得高产量的药用蛋白，实现生产蛋白质的“绿色工厂”。57一般病毒蛋白可以占到感染病毒叶片总蛋白含量的50%。外源5758将构建好的外源性基因的病毒载体导入植物主要采用的是体外接种法。目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体，包括花椰菜花叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）和豇豆花叶病毒（CPMV）等，其中有150多种蛋白多肽在TMV载体中成功表达。例如：58将构建好的外源性基因的病毒载体导入植物主要采用的是体外接58594.2重组植物病毒瞬时表达系统双链DNA花椰菜病毒CaMV），能感染十字花科和少数非十字花科（如茄科）植物;单链RNA烟草花叶病毒（TMV），是一种复制量和外壳蛋白质表达量很高的病毒，具有寄主范围广、能在整体植物上快速扩散等特点，多年来，人们研究了利用TMV表达外源基因的多种策略，目前已有150多种蛋白多肽在TMV载体中成功表达。594.2重组植物病毒瞬时表达系统双链DNA花椰菜病毒Ca59604.2重组植物病毒瞬时表达系统此外还有单链DNA番茄金黄花叶双病毒(TGMV)、非州木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV)、大麦条文花叶病毒(BSMV)、番茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X病毒(PVX)、烟草蚀刻病毒(TEV)、李痘病毒(PPV)等。604.2重组植物病毒瞬时表达系统此外还有单链DNA番茄金60616.4.3两种系统的比较植物稳定整合表达体系重组植物病毒瞬时表达系统可通过有性或无性繁殖获得大量转基因后代，可大规模生产通过接种获得高产量蛋白表达,但不能遗传,不便大规模生产生产周期长，一般为1年；纯合转基因系要3~4年以上生产周期短，一般约1~4个月可表达大片段外源基因只能表达小肽和表面决定基表达量低，小于1%TSP表达量高，可达1%~5%TSP616.4.3两种系统的比较植物稳定整合表达体系重组植物6162第5节存在问题和可能的解决方法5.1外源蛋白表达的水平低这个问题普遍存在于转基因植物的研究中，对于植物疫苗来说，表达量必须达到较高水平，才能达到口服免疫的效果，而对于在植物中表达需要纯化的抗体以及药用蛋白时，只有当其超过总可溶性蛋白的1%，才具有商业开发价值。62第5节存在问题和可能的解决方法5.1外源蛋白表达的水6263为了进一步提高外源蛋白在植物细胞中的表达水平，人们设计了很多策略:(1)蛋白质的靶向定位。在高等植物叶绿体表达外源基因是一种可供选择的转基因体系。叶绿体环形基因在每个植物细胞中可达500~1000个，可显著提高外源基因的拷贝数，从而使基因表达产物成倍增加，甚至可达总可溶性蛋白的47%。63为了进一步提高外源蛋白在植物细胞中的表达水平，人们设计了6364(2)使用植物病毒作为表达载体，可大大提高外源基因的表达水平。(3)使用植物偏爱的密码子，植物中遗传密码子的使用频率与动物、微生物不同。适当地对外源基因的密码子进行替换能显著提高该基因在植物中的表达水平。(4)使用增强子序列，利用组织特异性的启动子，优化先导序列，能够提高外源基因的表达水平。64(2)使用植物病毒作为表达载体，可大大提高外源基因的表达6465(5)使用核基质附着区MAR序列，可以使外源基因在染色质中形成独立的活跃转录单元，不受周围染色质结构的影响，从而提高外源基因的表达水平。(6)在拟南芥中生产arcelin，同时表达种子贮藏蛋白2S清蛋白的反义基因，结果使得arcelin的表达量占种子总蛋白地4%，利用这个策略有助于显著提高目标蛋白的表达量。65(5)使用核基质附着区MAR序列，可以使外源基因在染色质65665.2下游生产成本高尽管植物生产系统的上游生产成本比其它系统低，但如果产物需要提纯。则费用昂贵，因此在上游设计中应注意尽量简化下游的纯化成本。将外源蛋白多肽与植物油脂蛋白(oil-body)形成融合蛋白在植物中表达，油脂蛋白的亲脂性使之成为一种高效的多肽纯化系统。665.2下游生产成本高尽管植物生产系统的上游生产成本比6667利用GVGVP作为融合蛋白(GVGVP是一种人工合成基因编码的蛋白多聚体)，只要一步即可纯化，这一方法已成功运用于胰岛素的纯化。另外，有发展前景的是利用毛状根系统生产外源多肽，即利用转基因植物将目标蛋白从植物根系分泌到液体培养基中，这一系统已成功地生产Guy.s13单克隆抗体(预防龋齿)，产量可达2.4mg/L。此外，运用植物悬浮细胞培养系统也可减少下游的纯化成本。67利用GVGVP作为融合蛋白(GVGVP是一种人工合成基因67685.3安全性问题目前，转基因产品的安全性仍存在争议，尤其在口服疫苗方面，这一争议就更加尖锐。例如在转基因研究中用于筛选阳性克隆使用的选择标记基因多数为抗生素抗性基因，因此人们就会担心人食用这种转基因作物后也会产生抗生素抗性。685.3安全性问题目前，转基因产品的安全性仍存在争议，6869另外，在植物抗体的研究中，抗体上都连有多聚糖，由于动物源的抗体中多为唾液酸，这在植物中缺乏，而植物中富含木糖，这在动物不存在，因此人们怀疑不同的聚糖结构会对植物抗体的免疫原性和致敏性产生影响。这有待进一步的实验确证。同时，转基因植物具有潜在的破坏生态环境的可能性，因此，制定和完善转基因植物的安全和管理法规尤为重要。69另外，在植物抗体的研究中，抗体上都连有多聚糖，由于动物源6970展望尽管转植物生物反应器仍存在一些问题尚待解决，但利用植物表达系统已成功地表达了多种具有生理活性的外源多肽，而且有些已经进行了人体和动物的试验，其前景是可观的，随着人类基因组计划研究的不断深入，会发现有更多医疗价值的蛋白质，因此利用转基因植物将会成为最具潜力的生产系统来生产这些药物，为人类健康做出巨大的贡献。70展望尽管转植物生物反应器仍存在一些问题尚待解决，但利用7071第6章植物生物反应器1第6章植物生物反应器7172第6章植物生物反应器第1节植物生物反应器概述第2节植物生物反应器的医药工程第3节植物生物反应器生产其他有机物第4节植物生物反应器的研制策略第5节存在问题和可能的解决方法2第6章植物生物反应器第1节植物生物反应器概述7273第1节植物生物反应器概述生物反应器生物技术产品生产中的主体设备。生物反应器是可用来进行微生物或基因工程细胞发酵或利用酶进行生化反应者。机械搅拌式发酵槽应用最广。利用动物、植物本身作为反应器。3第1节植物生物反应器概述生物反应器7374近年来，转基因植物作为生物反应器来表达外源蛋白(包括疫苗、抗体、药用蛋白)，即所谓的“分子农业(molecularfarming)”已成为植物基因工程领域内一个研究的生长点，具有极大的市场前景和商业价值。目前，已用于生物反应器的植物有烟草、拟南芥、大豆、小麦、水稻、玉米、油菜、马铃薯、西红柿等。本章将就这一领域的发展现状，存在的问题及前景进行简要综述。4近年来，转基因植物作为生物反应器来表达外源蛋白(包括疫苗、74751.1植物生物反应器的概念说法1：植物生物反应器，就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官，以及整株植物为工厂来生产具有商业价值的生物制品包括疫苗、抗体、药用蛋白等等。51.1植物生物反应器的概念说法1：植物生物反应器，就是7576说法2：植物生物反应器是指通过基因工程途径，以植物悬浮细胞培养或整株植物为“工厂”，大量生产药物、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类等有机化合物。6说法2：植物生物反应器是指通过基因工程途径，以植物悬浮细胞7677广义上讲，植物生物反应器不仅仅指经基因工程改造的植物细胞、组织器官以及整株植物，也包括天然的植物，例如一些天然植物的次生代谢产物也具有重要的药用价值。7广义上讲，植物生物反应器不仅仅指经基因工程改造的植物细胞、7778

1.2植物生物反应器的优点1.2.1植物是最经济的蛋白质生产系统

种植植物所需要的仅是阳光,来自土壤或肥料的矿质营养、水分。这一点明显优于微生物发酵和动物细胞的培养，因为微生物发酵需要昂贵的设备投入，而动物细胞的培养需要昂贵的生长培养基，而且要保持无菌的生产条件。81.2植物生物反应器的优点1.2.1植物是最经济的78791.2.2植物可以大规模种植,而且产物贮藏在种子、果实、块茎中便于贮运例如，在室温条件下经过5个月储存的水稻种子中，scFv(singlechainFv)的含量和活性没有明显的损失。在4℃条件下，储存18个月的铃薯仍保留50%的有活性的抗体。91.2.2植物可以大规模种植,而且产物贮藏在种子、果实、7980相关知识单链抗体(Single-chainFv，ScFv)是将抗体变异区(fragmentofvariableregion，Fv)中的重链变异区(variableregionofheavychain，VH)和轻链变异区(variableregionoflightchain，VL)以人为的连接子(linker)连接起来，是深具应用潜力的蛋白质工程产物。具有分子量小、组织穿透能力强及免疫原性低等特点，在疾病的诊断及治疗应用方面具有很大潜力。

10相关知识单链抗体(Single-chainFv，ScF80811.2.3植物具有完整的真核细胞表达系统表达产物能进行正确的折叠装配，及糖基化、磷酸化、酰胺化，从而具有与高等动物细胞表达的产物基本一致的免疫原性和生物活性。111.2.3植物具有完整的真核细胞表达系统表达产物能进81821.2.4植物生物反应器的表达产物具有无毒性和副作用,安全可靠,无残存DNA和潜在致病致癌性用动物细胞作为生物反应器,则有可能因为动物本身携带的致病原而对人的健康造成威胁。121.2.4植物生物反应器的表达产物具有无毒性和副作用8283由于植物具有上述优势,所以分子农业的设想在20世纪80年代末一经提出,就成为转基因植物领域的研究热点。目前,在植物生物反应器上已取得一定成绩,这主要表现在3个方面：一是在植物中表达抗体二是利用植物生产疫苗三是利用植物生产其他药用蛋白。13由于植物具有上述优势,所以分子农业的设想在20世纪80年8384第2节植物生物反应器应用研究2.1植物抗体2.2口服疫苗2.3其他药用蛋白14第2节植物生物反应器应用研究2.1植物抗体84852.1植物抗体抗体(antibody)是动物体液中的一系列球蛋白,称为免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。它们可介导动物的体液免疫反应。将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物,在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段即植物抗体。152.1植物抗体抗体(antibody)是动物体液中的8586植物抗体最大的优点是使生产抗体更加方便和廉价。尤其在生产单克隆抗体方面,利用植物生产要比杂交瘤细胞低廉的多。据估计，在250m2的温室中利用苜蓿生产IgG的成本约为500~600美元/g，而利用杂交瘤细胞生产抗体的成本约为5000美元/g。16植物抗体最大的优点是使生产抗体更加方便和廉价。尤其在生产8687因此,利用植物生产抗体具有广阔的市场前景。目前,利用转基因植物表达的抗体包括完整的抗体分子、分泌型抗体IgA、IgG、单链可变区片段(scFv)、Fab片段、双特异性scFv片段以及嵌合型抗体等不同类型的抗体。17因此,利用植物生产抗体具有广阔的市场前景。目前,利用转基8788Ma等（2019）将鼠的单克隆抗体的J链、杂合的IgA-G重链、鼠的J链和兔的SC链、分别转化烟草，获得4个转基因株系，经后代连续的有性杂交，得到同时表达4个蛋白质链的转基因植株，这4种蛋白质链能组装成一个有功能的分泌型免疫球蛋白。18Ma等（2019）将鼠的单克隆抗体的J链、杂合的IgA-8889McCormick等（2019）利用烟草花叶病毒(TMV)为载体在烟草中瞬时表达了一种肿瘤起源的scFv，该抗体是淋巴瘤特异的疫苗，经过这种疫苗免疫的小鼠能够产生10Lg/ml以上的抗独特性抗体，能够抵制致死剂量的肿瘤。Zeitlin等（2019）将人抗单纯疱疹病毒(anti-herpessimplexvirus，HSV)的抗体在大豆中表达，其效果已在小鼠模型中得到证实，能够预防HSV-2的传播。19McCormick等（2019）利用烟草花叶病毒(TMV8990Ma等(2019)将引起龋齿的链球菌(Sreptpcpccusmutants)表面抗原的嵌合抗体IgA-G引入到烟草中，该抗体对抑制链球菌(Sreptpcpccusmutants)的作用与杂交瘤细胞产生的抗体一样。临床实验证实，该抗体可以有效清除人口腔内的变异链球菌(S.mutans)，并预防志愿者口腔产生龋齿。目前已被作为牙膏的一种成分，进入二期临床试验。20Ma等(2019)将引起龋齿的链球菌(Sreptpcpc9091Stoger（2000）等在水稻和小麦中成功表达了癌胚抗原(carcino-embryonicantigen，CEA)的scFv抗体，CEA是一种肿瘤相关标记抗原，可以利用CEA的抗体进行癌症的治疗。CarcinoembryonicAntigen(CEA)Carcinoembryonicantigen(CEA)preparation.21Stoger（2000）等在水稻和小麦中成功表达了癌胚9192Hull等（2019）在烟草中表达了炭疽杆菌保护抗原特异性单克隆抗体,在活体内外均表现出毒素中和活性,这项研究表明用植物生产炭疽杆菌单克隆抗体可以成功地用于预防。22Hull等（2019）在烟草中表达了炭疽杆菌保护抗原特异9293在放大31207倍的高倍显微镜下，拍到了斯特恩炭疽杆菌的孢子。这些孢子可存活很多年，这使得炭疽杆菌能在休眠状态下存活。23在放大31207倍的高倍显微镜下，拍到了斯特恩炭疽杆菌的9394能生产狂犬病抗体的烟草24能生产狂犬病抗体的烟草9495植物不仅作为生物反应器生产抗体用于医药产业，而且植物抗体介导的免疫调节在植物抗病育种上也很值得研究。Fecker等(2000)将抗甜菜坏死黄脉病毒(BNYVV)的外壳蛋白基因的scFv转化烟草，产生的scFv定位于细胞质中或通过末端的连接信号肽而分泌到质外体，结果发现转scFv的植株出现症状的时间明显迟于对照。25植物不仅作为生物反应器生产抗体用于医药产业，而且植物抗体9596另外，在植物细胞中表达具有催化或钝化酶和激素作用的抗体，从而对细胞代谢进行调节，这对于植物代谢机理的研究非常有用。26另外，在植物细胞中表达具有催化或钝化酶和激素作用的抗体，96972.2口服疫苗传染病严重威胁人类的生命和健康，一直以来人类获得免疫预防主要通过疫苗接种。但在发展中国家，昂贵的疫苗造成数百万人尤其是儿童依然死于传染病。目前利用植物作为生物反应器生产口服疫苗，极大降低了疫苗的生产成本，并且研究表明植物疫苗确实可以使人和动物产生相应的免疫应答，因此这一新技术将有助于疫苗的普及从而改善发展中国家人民的健康状况。272.2口服疫苗传染病严重威胁人类的生命和健康，一直以9798转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。转基因植物疫苗有两个研究方向:一种是利用植物生产大量的蛋白质抗原，经分离和提纯再制备成疫苗；另一种是不需要分离和提纯，将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。与注射疫苗相比,可食疫苗具有成本低,便于运输储存及使用方便等优点,因此成为基因工程疫苗的研究热点。28转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合,9899目前，科学家正在进行植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗糖尿病疫苗以及利用植物生产加强免疫效应的辅助佐剂方面的研究。Tacket等（2000）将转诺沃克病毒外壳蛋白基因的马铃薯让20个志愿者服用，结果19个人产生特异性IgG，6个人产生特异性IgA，说明95%的人对诺沃克病毒产生了抵抗力。29目前，科学家正在进行植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗99100Shchelkunov等（2019）首次研究了一种能同时抗两种病毒的疫苗，将编码艾滋病病毒中致免疫的ENV、GAC抗原表位及乙肝表面抗原的嵌合基因导入番茄并得以表达。30Shchelkunov等（2019）首次研究了一种能同时100101Li等（2019）将霍乱毒素B亚基ctb基因融合到糖尿病自身抗原基因中，用来转化低烟碱烟草，对产物进行功能性分析后，发现该融合蛋白具有与天然CTB一样的生物活性及免疫活性，包括GM1神经节苷酯受体结合能力，表明CTB3/InsB3融合蛋白可通过诱导口服免疫耐受能力来预防和治疗自身免疫糖尿病。31Li等（2019）将霍乱毒素B亚基ctb基因融合到糖尿病101102迄今在植物中表达的疫苗有几十种，包括乙肝病毒表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen，HbsAg)，诺沃克病毒(Norwalkvirus)外壳蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)、霍乱毒素的A，B亚基(CT-A，B)、冠状病毒(Coronavirus)的免疫原糖蛋白S多肽、狂犬病毒糖蛋白、口蹄疫病毒(foot-andmouthdiseasevirus)抗原、水貂肠炎病毒抗原、犬细小病毒抗原。32迄今在植物中表达的疫苗有几十种，包括乙肝病毒表面抗原(h102103研究人员用于表达疫苗的植物多为烟草、马铃薯、西红柿，但这些植物作为口服疫苗都存在缺点，如烟草不能食用，马铃薯不易生食，而西红柿不易长期贮存。因此更宜于生产口服疫苗的是那些含有大量可溶性蛋白、耐贮运的种子植物，特别是水稻、小麦、玉米，其胚乳中含有丰富可溶性蛋白能够与种子其余部分分开，从而降低植物疫苗服用剂量。此外，植物必须高水平表达疫苗才能达到口服免疫的效果。v.youku/v_show/id_co00XMTcxNDA4MDQ=.html

33研究人员用于表达疫苗的植物多为烟草、马铃薯、西红柿，但这1031042.3其他药用蛋白植物作为生物反应器除了可以生产抗体疫苗外，还可表达细胞因子、酶及其它药用蛋白和生物活性肽等。但是利用植物生产上述细胞因子、酶、药用蛋白和生物活性肽等需要下游纯化，只有它占总可溶性蛋白(Totalsolubleprotein，TSP)的1%以上才具有商业开发的价值。342.3其他药用蛋白植物作为生物反应器除了可以生产抗体104105Verwoerd等（2019）将黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即植酸酶)基因转入烟草，在成熟种子中植酸酶占总可溶性蛋白的1%。Witcher等（2019）利用转基因玉米生产重组的β-葡萄苷酸酶(GUS)，表达水平高达种子总可溶性蛋白的0.7%，且生物活性与天然的的GUS相同。植物性饲料中，约有70%的磷以植酸磷的形式存在。由于单胃动物消化道中缺乏分解植酸磷的植酸酶，故导致植物性饲料中总磷的消化利用率很低。植酸酶可水解植酸，提高植物性饲料中总磷的利用率。35Verwoerd等（2019）将黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即105106Hood等（2019）在转基因玉米中成功表达了重组抗生物素蛋白，其表达量占总可溶性蛋白的2%。与从鸡蛋清中提取的相比具有相同的功效而成本却大大降低了。现已成为Sigma-Aldrich的商品。Moloney（2019）等将人的亮氨酸脑啡肽基因导入油菜中，先以种子贮藏蛋白2S清蛋白的形式表达，再用胰蛋白酶水解，获得的脑啡肽产量达到220nmol/g种子，脑啡肽临床可作为止痛剂或镇定剂。36Hood等（2019）在转基因玉米中成功表达了重组抗生物106107此外，在转基因油菜种子油体中高效表达的水蛭素目前已经在加拿大投入商业生产，这是第一个用来商业开发的范例。37此外，在转基因油菜种子油体中高效表达的水蛭素目前已经在加107108水蛭素是水蛭（蚂蟥）的唾液腺分泌的一种酸性多肽，是目前已知的最强有力的凝血酶的天然抑制剂。对多种血栓疾病如静脉血栓、弥散性血管内凝血、脑凝血、血栓静脉炎及冠状动脉血栓都有预防和治疗效果，特别是对外科手术后及深栓治疗后的再栓塞有重要的预防和治疗效果。因此，水蛭素将成为新的抗凝血抗血栓形成的药物。38水蛭素是水蛭（蚂蟥）的唾液腺分泌的一种酸性多肽，是目前已108109Sijmous等人将人血清白蛋白(humanserumalbumin，HSA)编码区与烟草的一个蛋白分泌信号肽序列的融合基因转入马铃薯，表达的融合蛋白占总可溶性蛋白的0.02%.39Sijmous等人将人血清白蛋白(humanserum109110此外在植物中表达的其它人源蛋白的含量也很低。例如B-干扰素的含量低于0.03%(鲜重)、促红细胞生长因子(EPO)占总可溶性蛋白的0.003%。人工合成的人表皮因子在烟草中的表达量仅达到总可溶性蛋白的0.001%，因此尚不具备开发价值，需通过进一步的研究来提高表达量。40此外在植物中表达的其它人源蛋白的含量也很低。例如B-干扰110111胰岛素41胰岛素11111242112113第3节植物生物反应器生产其他有机物关于工农业用蛋白质在植物中表达的报道：首先进行商品化的两种转基因植物生产的蛋白分别是利用转基因玉米生产的鸡源抗生素（亲和素）和大肠杆菌来源的葡糖醛酸酶，它们都应用于分子生物学中作为诊断试剂盒。43第3节植物生物反应器生产其他有机物关于工农业用蛋白质在113114亲合素（Avidin）在诊断试剂中的应用十分广泛，它是蛋清中比较丰富的一种真核生物蛋白，在常规情况下可从蛋清中直接分离纯化。在转基因玉米中研究生产这种蛋白，以确定它是否能够与蛋清来源的鸡亲合素进行商业化竞争。将一个鸡亲合素蛋白的编码序列按照玉米偏爱的密码子进行优化，然后与大麦α-淀粉酶信号肽编码序列融合，并导入玉米染色体中表达。44亲合素（Avidin）在诊断试剂中的应用十分广泛，它是蛋114115每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素，据估计这种玉米来源的亲合素成本约比蛋清来源的亲合素低10倍。玉米亲合素具有与天然蛋白相同的生物活性，现在成为商品公开出售（见Sigma-Aldrichproduct#A8706）。45每公斤转基因玉米种子可产230mg的亲合素，据估计这种玉115116利用转基因植物生产的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）也已经商品化。gus基因是报告基因（reportergene），是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因，其来自于大肠杆菌，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶或β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS），能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计和组织化学法对GUS活性进行定量和空间定位分析，检测方法简单灵敏。46利用转基因植物生产的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）也已经商品116117Zeigler等（2000）报道了细菌的纤维素酶在拟南芥中的表达，其表达量高达25%。47Zeigler等（2000）报道了细菌的纤维素酶在拟南芥117118动物血红蛋白灵芝和烟草48动物血红蛋白灵芝和烟草118119表2利用转基因植物表达的其他药用蛋白(2019年后)药用蛋白表达植物用途参考文献人酸性β-葡萄糖苷酶烟草治疗葡萄糖脑苷脂酶缺乏症Reggit，2019人血清蛋白水稻治疗低清蛋白血症和外伤性休克Uuangt,2019人乳铁蛋白水稻免疫系统调节,促细胞生长Nandit,2019胰升糖素样肽水稻治疗糖尿病Yasudat，201949表2利用转基因植物表达的其他药用蛋白(2019年后)药119120续表药用蛋白表达植物用途参考文献白细胞介素-12番茄抗肿瘤免疫和抗病毒免疫G-OrRgat,2019血栓调节素烟草治疗血栓Schinkelt，2019基本成纤维细胞生长因子大豆治疗心血管及神经变性疾病Dingt,2019人骨形态发生蛋白-2烟草促进骨愈合Suot1,201950续表药用蛋白表达植物用途参考文献白细胞介素-12番茄抗120121续表药用蛋白表达植物用途参考文献人α-L-艾杜糖苷酸酶烟草治疗人溶酶体贮存障碍Kermodet,2019人表皮生长因子烟草治疗创伤烧伤,溃疡及角膜外伤Bait，2019人成纤维细胞生长因子8b烟草癌症靶向治疗Potu]at,2019人α-1抗胰蛋白酶番茄治疗肺气肿,纤维囊泡症,肝癌Agaiwalt，2019人生长激素水稻治疗侏儒症,骨折,皮肤烧伤,出血性溃疡Kimt,201951续表药用蛋白表达植物用途参考文献人α-L-艾杜糖苷酸酶烟121122第4节植物生物反应器的研制策略植物基因工程生产药用蛋白的过程一般包括目的基因的克隆、高效表达载体的构建、植物细胞的遗传转化、受体细胞的组织培养和植株再生、转化植株栽培、目标产品的分离纯化及纯度鉴定等，其中载体表达系统主要有两种：稳定的整合表达系统和瞬时表达系统。52第4节植物生物反应器的研制策略植物基因工程生产药用蛋白1221234.1转基因植物稳定整合表达系统外源基因导入宿主细胞并整合到宿主基因组中，且能够稳定表达目的蛋白的转基因植株称为稳定表达系统。利用农杆菌介导法或DNA直接转移法，把编码生物活性蛋白的外源基因或编码结构性抗原决定簇参与诱导保护性免疫应答的病原体DNA导入植物细胞，并整合到植物细胞染色体上。534.1转基因植物稳定整合表达系统外源基因导入宿主细胞123124整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，并在生长过程中表达生物活性蛋白和疫苗，同时把能表达异源性蛋白的性状遗传给子代，形成稳定的表达生物活性蛋白的植物品系。54整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，并在124125Ponstein等(2019)将来源于A.niger

植酸酶phy基因转移到油菜籽中，用种子特异性启动子CruA控制phyA，并在植酸酶成熟肽前加上十字花科信号肽序列，结果发现95％的油菜籽实中检测到了植酸酶的活性，此酶对胃蛋白酶具有抗性。55Ponstein等(2019)将来源于A.niger1251264.2重组植物病毒瞬时表达系统瞬时表达系统是利用可在植物中自行复制的植物病毒为载体表达异源蛋白。植物病毒具有广寄主性，能够感染多种植物，且基因组小，易于进行遗传操作。以植物病毒为载体，将编码生物活性蛋白的基因或编码疫苗抗原决定簇基因插入植物病毒基因组中，并置于强启动子的控制下，然后用此重组病毒感染植物，外源基因即随病毒的复制而高水平表达（接种后1—2周），从已感染病毒的叶片中提取病毒蛋白，酶解后即可获得目标蛋白。564.2重组植物病毒瞬时表达系统瞬时表达系统是利用可在植126127一般病毒蛋白可以占到感染病毒叶片总蛋白含量的50%。外源蛋白产生的形式或是独立的多肽，或与病毒基因产物融合。大多数植物病毒可借助快速的机械接种感染植物，适合于大规模的商业化生产，利用这类方法有望获得高产量的药用蛋白，实现生产蛋白质的“绿色工厂”。57一般病毒蛋白可以占到感染病毒叶片总蛋白含量的50%。外源127128将构建好的外源性基因的病毒载体导入植物主要采用的是体外接种法。目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体，包括花椰菜花叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）和豇豆花叶病毒（CPMV）等，其中有150多种蛋白多肽在TMV载体中成功表达。例如：58将构建好的外源性基因的病毒