外源基因表达产物的分离纯化

外源基因表达产物的分离纯化第一页，共九十八页，2022年，8月28日一、重组蛋白分离纯化方法选择的基本原则针对不同的产物表达形式采取不同的策略针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型多种分离纯化技术的联合运用合适分离纯化介质的选择分离纯化过程的规模化第二页，共九十八页，2022年，8月28日1.针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化

表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。第三页，共九十八页，2022年，8月28日2.针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型

等电点处于极端区域（pI≤5

或pI≥8）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲合层析

疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；

凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；第四页，共九十八页，2022年，8月28日3.多种分离纯化技术的联合运用在选择分离纯化方法时应遵循下列原则：应选择不同分离纯化机理的方法联合使用应首先选择能除去含量最多杂质的方法应尽量选择高效的分离方法应将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段第五页，共九十八页，2022年，8月28日4.合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Superose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：对目标蛋白具有较高的分离效率对目标蛋白不会造成变性化学性能和机械性能稳定，重复性好价格低廉第六页，共九十八页，2022年，8月28日Sephadex

是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联形成的三维网状凝胶颗粒Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经过两次交联后得到的第七页，共九十八页，2022年，8月28日5.分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。第八页，共九十八页，2022年，8月28日1.离子交换层析二、常用的分离方法离子交换层析的基本原理离子交换介质的基本性质离子交换层析的基本操作离子交换介质的选择原则第九页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换层析的基本原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以特定的含离子溶液为流动相，利用离子交换剂对待分离的各种离子结合力的差异，而将混合物进行分离的层析技术。第十页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换介质的基本性质离子交换剂亦称离子交换介质，通常是一种不溶性高分子化合物如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等；

离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子交换剂的基本性能离子或阴离子起交换作用不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的第十一页，共九十八页，2022年，8月28日

阴离子交换剂：强碱型和弱碱型离子交换剂的分类

阳离子交换剂：强酸型和弱酸型第十二页，共九十八页，2022年，8月28日阳离子交换剂

分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有－R－SO3H，中强酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH或－OH。

阳离子交换进行的反应如下：第十三页，共九十八页，2022年，8月28日阴离子交换剂

分为强碱型、中强碱型和弱碱型三类，含有四级铵盐[－N+(CH3)3]为强碱型，三级以下铵盐[－N(CH3)2]、[－NHCH3]、[－NH2]都属弱碱型；同时具有强碱和弱碱型基团的，为中强碱型。

阴离子交换树脂进行的反应如下：

第十四页，共九十八页，2022年，8月28日强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响，离子交换作用的pH范围宽弱离子交换剂的电离率受pH影响很大，离子交换作用的pH范围小弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子交换能力逐渐减弱第十五页，共九十八页，2022年，8月28日常用的离子交换剂离子交换树脂：最常见的离子交换树脂是含有酸性或碱性基团的人工合成的聚苯乙烯-二乙烯苯不溶性高分子化合物离子交换树脂的优点是：流速快，对小分子物质的交换容量大，因而适合用于氨基酸、核苷酸等小分子生化物质的分离纯化第十六页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换纤维素：

离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大

阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等维素）

阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤第十七页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换葡聚糖：离子交换葡聚糖是葡聚糖经环氧氯丙烷交联后形成的具有多孔三维空间网状结构并带有离子交换功能基团。Sephadex的优点如下：亲水性强、不会引起生物分子的变性和失活，母链对蛋白质、核酸及其它生物分子的非特异性吸附能力小电离基团在母体上取代程度高，交换容量大，装柱方便，流速快既有离子交换作用，又有分子筛效应因而Sephadex是一类广泛应用的色谱分离介质第十八页，共九十八页，2022年，8月28日

常用的离子交换葡聚糖包括：阳离子交换剂

CM-SephadexC-25，CM-SephadexC-50阴离子交换剂 DEAE-SephadexA-25，DEAE-SephadexA-50

QAE-SephadexA-25，QAE-SephadexA-50

第十九页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换琼脂糖：

离子交换琼脂糖是携带DEAE或CM基团的SepharoseCL-6B尤其是介质受pH和离子强度的影响所引起的膨胀和收缩效应较小，因具有硬度大、性质稳定，流速好，分离能力强等优点此具有稳定的外形体积第二十页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换介质的选择原则一般而言：酸性物质用阴离子交换剂分离氨基酸、核苷酸、蛋白质等两性电解质，可根据其pI值及离子化碱性物质用阳离子交换剂分离曲线来选择第二十一页，共九十八页，2022年，8月28日12346789105pH+-蛋白质净电荷等电点吸附阴离子交换剂吸附阳离子交换剂pH<pI（+）pH=pI（0）pH>pI（-）对pI=5的某酸性蛋白质在pH的范围内，当蛋白质为阴离子时，应首选DEAE纤维素；在pH的范围内，当蛋白质为阳离子时，应首选CM纤维素第二十二页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换层析的基本操作(1)层析柱平衡平衡缓冲液的用量至少为柱体积的2倍平衡缓冲液的流速可略高于正常操作流速平衡终点以流出液的离子浓度、导电性、pH值与缓冲液一致为准，其中pH值最重要目的：保证待分离物质如蛋白质的稳定；使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合；使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。第二十三页，共九十八页，2022年，8月28日(2)样品进柱为了达到满意的分离效果，进样量一般为介质交换容量的10-20%为了避免进样溶液中的离子强度过高，样品浓度不宜太高交换容量：离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数第二十四页，共九十八页，2022年，8月28日离子交换层析的基本操作(3)样品洗脱恒定洗脱阶段洗脱梯度洗脱102030405060708090分子浓度离子强度pH值第二十五页，共九十八页，2022年，8月28日1.平衡阶段:离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4.解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既可重复使用12345原始缓冲溶液的反离子样品溶液梯度浓度第二十六页，共九十八页，2022年，8月28日时刻要记住：蛋白质是由氨基酸聚合形成的聚合物，所以蛋白质也存在等电点（pI），蛋白质在溶液中带电状况同氨基酸相同，取决于所处溶液的pH

值。当pI<pH时，蛋白质带净负电荷；而当

pI>pH时，蛋白质带净正电荷。举一例子：已知蛋白X等电点为7，设计实验利用阴离子交换树脂纯化。答案：建立阴离子交换柱，比如Q-Sepharose。用pH8.5的缓冲液平衡柱子，同时蛋白X溶解于pH8.5的缓冲液中，在此pH值下蛋白X带有负电，将含有蛋白X的混合液上样，然后用起始液冲洗，蛋白X会与此柱结合，然后盐梯度洗脱。第二十七页，共九十八页，2022年，8月28日2.凝胶层析凝胶层析的基本原理凝胶介质的基本性质凝胶层析的基本操作凝胶介质的选用原则第二十八页，共九十八页，2022年，8月28日凝胶层析的基本原理凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛。分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；鉴于上述原理，凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及分离纯化。第二十九页，共九十八页，2022年，8月28日凝胶过滤的作用机制第三十页，共九十八页，2022年，8月28日带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图第三十一页，共九十八页，2022年，8月28日凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠第三十二页，共九十八页，2022年，8月28日第三十三页，共九十八页，2022年，8月28日第三十四页，共九十八页，2022年，8月28日第三十五页，共九十八页，2022年，8月28日第三十六页，共九十八页，2022年，8月28日凝胶介质的基本性质葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100

葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温葡聚糖凝胶（Sephadex）葡聚糖凝胶G10＜700

葡聚糖凝胶G15＜1500

葡聚糖凝胶G251000-5000

葡聚糖凝胶G501000-30,000第三十七页，共九十八页，2022年，8月28日

琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（Sepharose2B、4B、6B）。琼脂糖凝胶

当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。第三十八页，共九十八页，2022年，8月28日

聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种聚丙烯酰胺凝胶第三十九页，共九十八页，2022年，8月28日凝胶介质的选用原则将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。

组别分离一般选用SephadexG-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用SephadexG-10、G-组别分离15、Bio-GelP-2或P-4第四十页，共九十八页，2022年，8月28日将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离

分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由分级分离于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。第四十一页，共九十八页，2022年，8月28日凝胶层析的基本操作平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速注意凝胶的断层和气泡层析柱平衡操作压控制平衡和洗脱时应维持流速恒定第四十二页，共九十八页，2022年，8月28日上柱样品溶液的体积根据分离要求来确定：进样体积进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%进行分级分离时，样品溶液的体积要小，使样品层尽可能窄，这样洗脱出的峰形好第四十三页，共九十八页，2022年，8月28日3.亲和层析亲和层析的基本概念亲和层析载体的性质与选择亲和层析配基的性质与选择亲和层析的基本操作第四十四页，共九十八页，2022年，8月28日亲和层析的基本概念

亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术，它有如下特点：纯化过程简单、迅速，且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差的生物大分子亲和层析的基本特点纯化倍数大，产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制第四十五页，共九十八页，2022年，8月28日抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA（cDNA、mRNA)酶与其底物、竞争性抑制剂、辅酶因子激素或药物与其受体具有特异性亲和作用的生物分子维生素于其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素第四十六页，共九十八页，2022年，8月28日亲和的一对分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂当含有混合组份的样品（流动相）通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才能被固定相吸附结亲和层析的基本原理合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来第四十七页，共九十八页，2022年，8月28日亲和层析（affiuitychromatography）

应用分离纯化酶、抗原、抗体分离纯化核酸研究酶的结构与功能+待纯化分子配体a.理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂++杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理：基质纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、

sepharose、sephadex第四十八页，共九十八页，2022年，8月28日亲和层析原理示意图

蛋白质混合物配体与配体结合的蛋白质加入的可溶性配基专一性结合蛋白质没有结合的蛋白质非专一性结合蛋白质蛋白质浓度洗脱体积与配体专一性结合蛋白质加入配基基质第四十九页，共九十八页，2022年，8月28日亲和层析载体的性质与选择具有多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒，具有良好的流速亲和层析载体的选择具有惰性，尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团，在温和的条件下能与配基共价合偶联在偶联、吸附和洗脱时，有较好的物理化学稳定性第五十页，共九十八页，2022年，8月28日纤维素葡聚糖凝胶常用的亲和层析载体琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体

第五十一页，共九十八页，2022年，8月28日纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的，因为在解离配基复合物时所需的亲和层析配基的选择条件就要强烈，这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团，这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合，但可用于和载体相连，同时又不影响配基与生物分子之间的亲和力第五十二页，共九十八页，2022年，8月28日酸酐法N-取代羟基琥珀酰亚胺法配基的偶联叠氮化作用还原性烷基化合物（西夫碱）的形成第五十三页，共九十八页，2022年，8月28日亲和层析的基本操作通常采用改变pH、离子强度、离子种类或者温度等，降低其亲和力。非专一性洗脱化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化，而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物，使固定第五十四页，共九十八页，2022年，8月28日使用特异的配基作为洗脱剂溶液为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗专一性洗脱使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物脱目标产物第五十五页，共九十八页，2022年，8月28日亲和双方吸附能力很强，可以用专一的化学方法裂解配基与载特殊性洗脱体的连接键，获得的配基-蛋白络合物后，再除去配基。第五十六页，共九十八页，2022年，8月28日4.膜分离膜分离的基本原理分离膜的主要性能影响膜分离的因素第五十七页，共九十八页，2022年，8月28日膜分离的基本原理膜分离是利用膜的选择性，以膜的两侧存在一定量的能量差作为膜分离的基本定义推动力，由于溶液中各组分透过膜的迁移速率不同而实现的分离。依据滤膜孔径和物质粒子的大小而达到物质分离的目的第五十八页，共九十八页，2022年，8月28日分离效率高膜分离的特点不涉及相变，能耗低，运行成本低膜分离为单纯物理变化，无二次污染第五十九页，共九十八页，2022年，8月28日分离膜的选择通透性：是物质分离的第一机制膜分离过程的重要参数膜分离过程的推动力：静压力差、浓度差、电位差物质通过分离膜的速度：是物质分离的第二机制第六十页，共九十八页，2022年，8月28日根据分离膜膜内平均孔径、推动力和传递机制不同，膜分离可膜分离的主要类型反渗透（ReverseosmosisRO）透析（DialysisDS）分成下列几类：超滤（UitrfiltrationUF）微滤（MicrofitrationMF）电渗析（ElectrodialysisEI）第六十一页，共九十八页，2022年，8月28日透析半透膜袋蛋白质溶液透析液磁棒磁力搅拌器

透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：

玻璃纸（赛璐玢纸，cellophanepaper）

火绵纸（赛璐玎纸,celloidinpaper）

其他改型纤维素材料第六十二页，共九十八页，2022年，8月28日按照分子大小进行分离。分离取决于透析袋截留的分子量。透析液浓缩的蛋白混合样品透析袋开始透析处于平衡状态第六十三页，共九十八页，2022年，8月28日反渗透（ReverseosmosisRO）

反渗透其主要原理是在高于溶液渗透压的作用下，使其它物质溶解盐类、胶体、微生物、热源、有机物等，因而主要用于海水、不能透过半透膜，而将这些物质与水分离开来，有效地去除水中的苦咸水淡化和产纯水制备等方面第六十四页，共九十八页，2022年，8月28日超滤（UitrfiltrationUF）

超滤是一种根据高分子溶质之间或高分子与小分子溶质之间相相应的截留分子量范围从500到100万左右。对分子质量的差别进行分离的方法。筛分孔径范围1nm-0.1mm，第六十五页，共九十八页，2022年，8月28日超滤第六十六页，共九十八页，2022年，8月28日分离膜的基本性能

分离膜是膜分离技术的核心，分离膜的性能主要包括分离透过性、耐酸碱性、抗氧化性、抗微生物降解性、亲水性、疏水性、电性能和化学物理性能两部分。其中，化学物理性能主要涉及到耐热性能、毒性、机械强度等。膜的化学物理性能第六十七页，共九十八页，2022年，8月28日微滤膜 0.025-14mm反渗透膜 0.0001-0.001mm超滤膜 0.001-0.02mm纳米过滤膜 平均孔径2nm膜的分类按膜的孔径大小分类：第六十八页，共九十八页，2022年，8月28日对称性膜 膜截面上的孔道结构均匀不对称性膜 由表面活性层（超薄层）和惰性层（支撑层）构成按膜的结构分类： 传质阻力大，透过通量低，易污染、难清洗 传质阻力小，透过通量高，被广泛使用第六十九页，共九十八页，2022年，8月28日天然高分子膜醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素合成聚合物膜聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物按膜的材料分类：无机材料膜陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素第七十页，共九十八页，2022年，8月28日影响膜分离的因素影响膜分离效率的主要因素是膜的污染，其表现形式是：溶质在膜孔内吸附造成膜污染的主要原因是：蛋白质在不同pH条件下所带电荷对膜电荷的相互作用无机盐通过形成复合物、改变溶液离子强度等机制污染膜溶质在膜表面沉淀或结晶膜分离过程中体系的粘度增大会污染膜第七十一页，共九十八页，2022年，8月28日

三、基因重组蛋白包涵体的分离和复性第七十二页，共九十八页，2022年，8月28日外源基因在大肠杆菌中的表达形式位于细胞质细胞周质细胞外表达产物形式包涵体蛋白融合蛋白整合型外源蛋白分泌型外源蛋白第七十三页，共九十八页，2022年，8月28日细胞质中表达:

外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体。包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。第七十四页，共九十八页，2022年，8月28日包涵体表达形式的优点

在一定程度上保持表达产物的结构稳定

能够避免细胞内蛋白水解酶的作用，有利于目标蛋白的富集

简化外源基因表达产物的分离操作

包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来能够表达对大肠杆菌宿主有毒或有致死效应的目标蛋白。第七十五页，共九十八页，2022年，8月28日包涵体表达形式的缺点

以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过

有效的变性复性操作，才能得到有正确空间构象的目标蛋白。

体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过30%

复性处理工艺可使目标蛋白的制备成本上升。第七十六页，共九十八页，2022年，8月28日包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。第七十七页，共九十八页，2022年，8月28日包涵体加工流程离心去除细胞碎片（膜蛋白和脂类等）机械破碎法包涵体提取如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化经常面临的一个难题第七十八页，共九十八页，2022年，8月28日包涵体的洗涤为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀常用去污剂TritonX-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如2mol/L尿素或盐酸胍等，洗涤以除去脂类和膜蛋白。如：50mMTris-HCl，，2M尿素，1mMEDTA第七十九页，共九十八页，2022年，8月28日包涵体的溶解大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展对于含有S-S的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键→为将包涵体充分溶解，需加入还原剂（如二硫苏糖醇DTT、GSH、β－巯基乙醇β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，一般是50-100mMβ-ME或DTT（对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，因为含S-S的杂蛋白会影响包涵体的溶解）同时还应加入金属螯合剂，如EDTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子，防止已经处于还原状态的SH-与之发生氧化反应。包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链

第八十页，共九十八页，2022年，8月28日蛋白质复性机理蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：一是分子内的疏水相互作用→促使蛋白质正确折叠二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀→两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。→复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。伸展态U中间体I局部肽段先由氢键形成一些二级结构构象单元，如α螺旋、β折叠、β转角等聚集体A天然态N快慢第八十一页，共九十八页，2022年，8月28日一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右

第八十二页，共九十八页，2022年，8月28日复性常用方法1.稀释复性：直接加入水或复性缓冲液，缺点是体积增加较大，后续处理困难。第八十三页，共九十八页，2022年，8月28日

2.透析复性：好处是不增加体积，通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度，速度慢，不适合大规模操作。

3.超滤复性：选择合适载留分子量的膜，允许变性剂通过膜而蛋白质通不过。缺点是不适合样品量较少的情况，且有些蛋白可能在超滤过程中不可逆的变性（蛋白聚集于膜上）。第八十四页，共九十八页，2022年，8月28日4.色谱复性：兼具分离。4.1凝胶过滤复性：该法可以起到一定的抑制凝集作用，并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，对有些蛋白质的复性有利。第八十五页，共九十八页