基因工程的基本操作步骤

关于基因工程的基本操作步骤第一页，共二十九页，2022年，8月28日思考:利用大肠杆菌产生人胰岛素的大致培育过程?

基因工程的基本操作程序一、目的基因的获取二、基因表达载体的构建三、将目的基因导入受体细胞四、目的基因的检测与鉴定第二页，共二十九页，2022年，8月28日一、目的基因的获取主要是编码蛋白质的结构基因，也可以是一些具有调控作用的因子。现代获取方法：1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成初始目的基因的来源从生物中直接获取人工合成第三页，共二十九页，2022年，8月28日1、从基因文库中获取目的基因

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。第四页，共二十九页，2022年，8月28日提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库例：基因文库的构建方法之一第五页，共二十九页，2022年，8月28日某种生物的单链mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库反（逆）转录酶DNA聚合酶反转录法：cDNA的合成流程图解例：基因文库的构建方法之一第六页，共二十九页，2022年，8月28日基因组文库和cDNA文库的主要区别

文库类型cDNA文库

基因组文库

文库大小基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）

基因多少

物种间的基因交流小大无有无有某种生物的部分基因某种生物的全部基因可以部分基因可以第七页，共二十九页，2022年，8月28日怎样从基因文库中得到我们所需要的目的基因呢？第八页，共二十九页，2022年，8月28日2、利用PCR技术扩增目的基因

多聚酶链式反应，在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。可以在短时间内获得大量目的基因。第九页，共二十九页，2022年，8月28日循环变性退火延伸第十页，共二十九页，2022年，8月28日(二)利用PCR技术扩增目的基因第十一页，共二十九页，2022年，8月28日PCR技术扩增与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理原料条件不同点解旋方式场所酶结果碱基互补配对四种脱氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋解旋酶催化体外复制细胞核内热稳定的DNA聚合酶细胞内的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整个DNA分子第十二页，共二十九页，2022年，8月28日二.基因表达载体的构建-----------核心复制原点+启动子+目的基因+终止子+标志基因它们各自的作用是什么?第十三页，共二十九页，2022年，8月28日启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来第十四页，共二十九页，2022年，8月28日基因表达载体的构建过程质粒DNA分子限制酶处理两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种一个切口两个黏性末端第十五页，共二十九页，2022年，8月28日①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。注意第十六页，共二十九页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞转化常用的受体细胞：

有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。第十七页，共二十九页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化基因枪法花粉管通道法农杆菌转化法第十八页，共二十九页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术提纯基因表达载体体外显微注射入受精卵受精卵移植第十九页，共二十九页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞1.将目的基因导入植物细胞转化农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法2.将目的基因导入动物细胞显微注射技术3.将目的基因导入微生物细胞用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子第二十页，共二十九页，2022年，8月28日1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因(关键步骤)①.首先取出转基因生物的基因组DNA②.用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做探针③.使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明染色体已插入染色体DNA中（1）方法:DNA分子杂交（2）过程:四、目的基因的检测与鉴定第二十一页，共二十九页，2022年，8月28日归纳步骤第二十二页，共二十九页，2022年，8月28日（二）、鉴定（个体生物学水平）2、检测目的基因是否转录出了mRNA3、检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等①方法:分子杂交技术方法:抗原抗体杂交②过程:

用上述探针和转基因生物的mRNA杂交,若出现杂交带,表明目的基因转录出了mRNA第二十三页，共二十九页，2022年，8月28日四、目的基因的检测与鉴定检测—鉴定——①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原—抗体杂交第二十四页，共二十九页，2022年，8月28日基因工程的基本操作程序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、感受态细胞法DNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原—抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定第二十五页，共二十九页，2022年，8月28日巩固练习:1.人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗生素抗性基因,该抗性基因的主要作用是()A.提高受体细胞在自然环境中的耐药性B.有利于对目的基因是否导入进行检测C.增加质粒分子的分子量D.便于与外源基因连接2.在遗传工程技术中,限制性内切酶主要用于()A.目的基因的提取和导入B.目的基因的提取和检测C.目的基因与载体的结合和导入D.目的基因的提取与载体结合BD第二十六页，共二十九页，2022年，8月28日3.1976年,美国的科学家首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌,并获得了表达,此文中的表达是指该基因在大肠杆菌()A.能进行DNA复制B.能传递给细菌后代C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素C第二十七页，共二十九页，2022年，8月28日4.基因工程是在DNA分子水平上进行设