柠檬提取物清除亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的研究分析 生物技术专业

摘要用超声波-微波协同萃取法提取柠檬中的活性物质，根据对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法测定柠檬对亚硝酸盐的清除率。在温度、乙醇浓度、物料比和萃取时间等单因素实验基础上，探究提取液剂量、清除时间和清除温度对清除率的影响，确定柠檬清除亚硝酸盐的最佳条件，并此条件下对柠檬果肉和皮的清除率进行比较。最后将最佳方案应用于实际样品中。柠檬含水量为85.96%。在确定提取条件时发现，乙醇浓度对清除率影响最大，之后依次依为物料比、提取温度，最后是提取时间。当乙醇浓度为100%，物料比为1:3，提取温度为70℃，提取时间为60s时，最佳清除率达74.47%。在确定清除条件时发现，反应温度对清除率影响最大，其次为反应时间，提取液用量对其影响最小。当反应温度为50℃，反应时间为5min，提取液用量为7mL时，最佳清除率达91.35%。柠檬提取液对实际样品中亚硝酸盐的清除率最高可达85.52%，最低为64.56%。关键词：柠檬提取液；亚硝酸盐；清除率；亚硝胺AbstractSynergisticextractionimmersedinethanolusingultrasonicmicrowaveactiveingredientoflemon.Theremovalrateofnitritewasdeterminedbyspectrophotometricdeterminationofaminobenzenesulfonicacidandnaphthalene.Onthebasisofsinglefactorssuchastemperature,ethanolconcentration,materialratioandextractiontime,exploringtheeffectofextractdosage,clearancetimeandclearancetemperatureonclearancerate,determiningthebestconditionsforlemonremovalofnitriteandcomparingtheclearancerateoflemonpulpandskininthiscondition.Finally,thebestsolutionisappliedtotheactualsample.Thelemonwatercontentis85.96%.Whendeterminingtheextractionconditions,itwasfoundthattheconcentrationofethanolhadthegreatestinfluenceonclearancerate,followedbymaterialratio,extractiontemperature,andfinallyextractiontime.Whentheconcentrationofethanolwas100%,thematerialratioof1:3,extractiontemperaturewas70℃,60sforextractingtime,thebestclearanceratewas74.47%.Whendeterminingtheclearanceconditions,thereactiontemperaturehasthegreatestinfluenceonclearancerate,followedbythereactiontime,andtheextractamounthastheleastinfluenceonit.Whenthereactiontemperaturewas50℃,thereactiontimewas5min,theamountoftheextractwas7mL,theoptimalclearanceratewas91.35%.Theremovalrateofnitriteintheactualsamplewasupto85.52%,andthelowestwas64.56%.KeywordsLemonextractNitriteTheclearanceNitrosamine1绪论1.1柠檬1.1.1柠檬的种类柠檬的起源至今未知，但普遍认为是缅甸北部、印度南部和中国，其果实为浅黄色或黄色、椭圆形，味酸。柠檬的种类丰富，有尤力克、菲诺、维尔拉、印度大果、维拉法兰卡、里斯本、热那亚、北京柠檬、费米奈劳等，其中高酸的是菲诺和费米奈劳，低酸的为北京柠檬。其中我国的柠檬主要分布在长江以南地带，而因盛产柠檬被誉为“中国柠檬之乡”的是四川安岳。1.1.2柠檬的营养成分及价值柠檬富含维生素C、维生素B1、维生素B2、柠檬酸、苹果酸、柠檬希及钙、磷、铁等多种元素[1]。柠檬因其富含各种营养物质，并具有独特的风味，故兼具药用价值和食用价值。柠檬对于人体的血液循环以及钙质的吸收有相当大的帮助，其丰富的维他命C不但能够预防癌症、降低胆固醇、食物中毒，消除疲劳，增加免疫力，延缓老化，保持肌肤弹性，并且克服糖尿病、高血压、贫血、感冒、骨质疏松症，等[2]。如果缺少维他命C，细胞间胶状物也会减少，会使细胞组织变脆，并使其抵抗外力的能力变弱，从而患上坏血症。新鲜柠檬皮片还能有效的缓解胃外科术后患者头晕、恶心感,减轻患者痛苦[3]。在食物烹饪的过程中，柠檬常用作调味剂，增加食物的风味，促进食用者的食欲。柠檬还具有抗氧化活性，对冷鲜肉具有一定的保鲜效果[4]。1.1.3柠檬加工产品目前柠檬鲜果加工主要以生产柠檬干片和果汁饮料制造为主[5]。因柠檬能够防止皮肤色素沉着、延缓老化、降低胆固醇、保持肌肤弹性等功效，故较受大家欢迎，特别是年轻女性，为了方便大家食用，就产生了柠檬干片。柠檬干片中的营养成分虽不如鲜柠檬多，但将干柠檬片泡水，其功效也差不多，都能美白、防治心血管疾病和肾结石、提高免疫力、祛痰（其祛痰功效较橙和柑橘强）等。柠檬干片的制作工艺一般为烘干、自然风干、微波真空干燥等，前两种是目前市面上较常用的柠檬干燥法。柠檬果汁饮料具有其独特的清香，在市场上较受欢迎。柠檬果汁类似薄荷给人以醒脑的感觉，但其口感又是清爽的，非常独特。以梨-柠檬为例，其制作工艺为清洗、破碎、打浆取汁、澄清处理、加入柠檬、成分调剂、主发酵、陈酿、去浆澄清、杀菌、灌装、封盖、成品[7]。因其具有特殊的香味，甚至在香水和化妆品等行业也有所应用[6]。例如柠檬防晒乳液、柠檬洗面奶、柠檬香精油等。1.1.4柠檬的生理功能柠檬中含有较多的活性物质，且大多都有益于身体健康，所以柠檬又被称为益母果。柠檬精油能抗菌消炎杀菌，消除体内结石；黄酮类物质可消除体内多余自由基，预防癌症，改善心脑血管疾病；果酸具有减肥、抗凝血、解毒、解酒的功效；柠檬苦素可以抑制肿瘤、抗焦虑、降胆固醇、利尿、改善心脑血管循环、调节细胞色素沉淀、改善睡眠；膳食纤维能改善便秘，消除重金属中毒；VC有助于胶原蛋白的合成，抗氧化，抗坏血病。另外柠檬也是味中药，常用于和胃安胎、生津解暑、妊娠呕吐。柠檬具有减肥、降低胆固醇、调节细胞色素沉淀、抗氧化、改善心脑血管疾病等各种功能。“月盈则满，水满则溢”，柠檬虽好，过犹则不及，要做到合理利用，例如不能空腹吃柠檬，胃酸分泌过多和胃溃疡患者不宜吃柠檬，因柠檬含糖量不少，糖尿病患者不宜多吃。1.1.5柠檬的产业现状柠檬在中国是稀缺资源，仅在我国四川安岳盛产，其余大多靠进口，并且日常生活中，因其特有的酸味和苦味，人们用到柠檬的地方并不多。市面上的柠檬产品大多是柠檬干片和柠檬果汁饮料，而柠檬干片经过热烫烦躁等工艺后，其中不少营养成分都损失掉了，柠檬果汁饮料中的有效成分更是少之又少。所以需要我们抓住机遇，加大研发力度，开发更多柠檬深加工产品，推动我国柠檬产业发展，让更多的人了解到柠檬的功效，扩大柠檬消费市场。1.1.6柠檬中活性物质的提取方法柠檬主要包括精油、果酸、膳食纤维、黄酮类物质、柠檬苦素、VC等成分[8]。1.1.6.1压榨法压榨法主要是通过机械加压，压榨出果皮中的有效成分。原料经石灰水浸泡、漂洗后压榨、过滤，将得到的滤液静置，并再次过滤。此方法成本低，易保持原料原有的结构和功能，但分离较为困难，所得滤液中有效成分含量相对较低。1.1.6.2浸提法浸提法是利用原料中各种成分在溶剂中的不同溶解性，选用对所需提取活性成分溶解度大，对其他成分溶解度小的溶剂，而将所需有效成分从中浸提出来的方法。常用的溶剂可分为水、亲本性和亲脂性有机溶剂。用水浸提操作简单且可节约成本，但其提取率低且适用的样品较少。有机溶剂提取法虽提取率较高，但有的溶剂有毒，例如苯、甲醇、二氯乙烷等，且成本较高，操作繁琐。杨强[9]采用热水浸提法提银杏中非淀粉多糖，实验表明物料比为25mL/g、温度为90℃、时间为5h时银杏果多糖的提取率为2.76%。1.1.6.3超声波-微波萃取法超声波辅助提取法利用空化效应、机械效应及热效应加强胞内物质的释放、扩散及溶解[10]。超声波-微波萃取法具有提取时间短、提取率高，氧化损耗率低等优点。此外，还可降低经济成本。胡莉等[11]采用微波萃取法来优化花生秆中的SDF的提取工艺，发现柠檬酸质量分数为4%、料液比为1mg∶25mL、微波功率为480W、处理时间为30s为SDF的最优提取条件。1.1.6.4水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法适用于有效成分溶于水的原料，其具体方法为将原料与水混合，加热使其产生蒸汽，再经冷凝、油水分离等，提取出有效成分。彭静[12]等用水蒸气蒸馏法提取乳香挥发油，发现最佳提取工艺为:加水量3倍水、不浸泡、提4h。1.1.6.5超临界CO2法超临界CO2法是通过改变压力和温度，使其影响超临界流体的溶解能力，从而依次萃取极性、沸点、分子量不同的成分。超临界流体不仅具有也液体相似的良好溶剂化能力，又具有与气体一样的良好传质化能力[13]。苗笑雨[14]等采用超临界CO2萃取技术提取虎掌菌精油，发现萃取压力33MPa，萃取温度55℃，萃取时间145min为最佳工艺条件。1.2亚硝酸盐亚硝酸盐是无机化合物，主要包括呈白色或淡黄色粉末或颗粒状的亚硝酸钠，味微咸，遇水易溶，外观和味道都与食盐类似[15]。1.2.1亚硝酸盐的来源在我们的日常生活中，亚硝酸盐都普遍存在，例如食品，土壤，饮用水，环境中等都存在亚硝酸盐。一些植物体内也含有硝酸盐，不同的品种含量不同，这是由农作物栽培，使用含氮农药、含氮肥料造成的。食品中亚硝酸盐主要来自于肉类食品、蔬菜和水。肉类食品在加工过程中加入一定量的硝酸盐、亚硝酸盐即可改善风味，稳定色泽，抑制肉毒梭菌的生长繁殖，而至今都没有发现任何一种添加剂能够代替亚硝酸盐的这些功能。因此，亚硝酸盐使用量、残留量超标事件也时有发生。蔬菜中含有亚硝酸盐主要是在种植过程中过量施用硝态氮肥；酸菜等腌渍食品在腌渍过程中由于硝酸还原菌的作用，硝酸盐被还原成亚硝酸盐；隔夜熟菜、霉变蔬菜等。有些地区的饮用水中含有较多亚硝酸盐，用其烹调食物，并在不洁灶具中放置过久，硝酸盐极易被还原为亚硝酸盐。1.2.2亚硝酸盐的危害亚硝酸盐作为一种重要的前体物质，可与蛋白质作用产生高致癌的亚硝胺[16,17]，而亚硝胺是危害性极高的化合物之一[18]。亚硝酸盐是工业用盐,常见的亚硝酸盐有亚硝酸钠和亚硝酸钾,为白色或微黄色的结晶或颗粒粉末,无臭,味微咸涩稍苦,易潮解,易溶于水,是一种剧毒品。亚硝酸盐在建筑工地用于水泥防交流剂,锅炉水的软化剂,在食品业用于肉制品的发色剂,但在国家标准中,肉制品的亚硝酸盐含量是被限制使用的。由于亚硝酸盐的外观很像食盐,碱面,白糖和发酵粉,因此常被误食而引起中毒。亚硝酸盐作为国家允许的食品添加剂，其纯品一般应用于肉制品加工，但人体口服300-500mg亚硝酸盐就可引起食物中毒，超过3g就会引起死亡。因为亚硝酸盐可与血红蛋白结合形成高铁血红蛋白，使血液失去携氧功能，其典型的症状为口、唇、舌、指甲等青紫，严重的呼吸衰竭而死亡。亚硝酸盐还可与食品中的胺反应，生成N-亚硝胺，导致慢性蓄积性中毒，并可诱发多部位癌变。1.2.3亚硝酸盐的应用增加风味：亚硝酸盐通过稳定脂质组成、阻止离子的催化、抑制脂质过氧化物降解来增加肉制品的风味物质。发色作用：动物被宰杀后，因物无氧气供应，代谢在无氧条件下进行，从而致使肌肉处于酸性状态。亚硝酸盐在此条件下分解成亚硝基，与肉制品中肌红蛋白、血红蛋白形成亚硝肌红蛋白和亚硝基血红蛋白。进而影响肉制品的色泽。抗氧化作用：因肉及肉制品含有脂肪，极易在光、热氧气、微生物等环境作用下发生腐败变质，而亚硝酸盐能阻止脂质氧化，进而防止肉及肉制品腐败变质。抑菌作用：亚硝酸盐能抑制一定的金黄色葡萄球菌、肉毒梭状芽孢杆菌等致病菌的生长繁殖。李轶欣[19]等通过研究认为游离的亚硝酸盐能够抑制腌制品中细菌的生长。当使用10～40mg/kg亚硝酸盐时，能增加腌肉的风味和色泽[20]。传统腌渍肉存放的时间较长，更有利于肉毒梭菌的繁殖[21]。肉毒梭状芽孢杆菌性质稳定，在高温高压下才能被杀死。分布广泛，繁殖能力强，但游离的亚硝酸盐能阻断肉毒素生长。亚硝酸盐的使用量在10～40mg/kg时，就能使腌肉产生良好的色泽和风味[22]。1.2.4亚硝酸盐的控制措施亚硝酸盐有利有弊，虽然毒性大，但价格低廉、作用强，使其仍然被经常运用到。我们应该尽快找到能替代亚硝酸盐的物质，既能延长食品的保质期又对人体的危害降到最低。我们经常能在腌制品包装袋上看到含有亚硝酸盐的标记。如何有效控制亚硝酸盐的摄入，第一，不食用腐败变质的蔬菜，不食长期置于高温下的剩菜，不喝蒸锅剩水。第二，准确合理控制氮肥的用量，从源头上解决问题，在食用前进行恰当的清洗。第三，对于那些食品加工企业，制定相关条例，明确亚硝酸盐的使用量。第四，注意合理搭配，水果富含维生素C和维生素E以及茶叶都可以杀死亚硝酸盐还原菌，降低亚硝酸盐含量。第五，把控添加剂用量，加快研发寻找替代品。1.2.5亚硝酸盐的清除因亚硝酸盐应用范围很广泛，所以对此的研究也较多，大多为研究从天然物质中提取有效成分来清除存在的亚硝酸盐或阻断亚硝胺的合成。孙昕[21]等采用酶解法提取生姜中的姜辣素，研究发现在最佳工艺条件下，姜辣素粗提物对亚硝酸盐的清除效果可达99.32%。陶银华[22]等通过研究发现海棠果中香豆素类、黄酮类、口山酮类、萜类化合物对亚硝酸盐有一定清除作用。朱俊玲[23]等通过分光光度法研究发现番茄、生姜等蔬菜汁和柚子、菠萝等水果汁对亚硝酸盐有一定清除作用，且它们的混合汁清除率最低也可达80.14%。刘星[24]通过研究14中天然植物对亚硝酸盐的清除作用，发现多酚在清除过程中起到重要作用。1.3亚硝胺亚硝胺是一类含氮化学物质，具有强致癌性，且较稳定，不易分解。1.3.1亚硝胺的来源亚硝胺广泛存在于我们日常生活中，包括食物、酒精饮料、饮用水、香烟、化妆品[25]等，其对人体的危害主要分成两种途径，一是直接摄入，二是体内合成。平时我们摄入的有些食物是有一定亚硝胺的，特别是腌制食品和发酵食品，而且有些饮用水中也含有，常以消毒副产物的形式于水处理构筑物之中被检出亚硝胺类物质[26]。在食品生产加工过程中使用的包装材料和容器也会含有挥发性亚硝胺，这就是我们直接摄入亚硝胺的原因。胺盐和亚硝酸盐是生成亚硝胺的前体物质[27]，这些前体物质被摄入体内后，会在胃肠道中内源性合成亚硝胺。1.3.2亚硝胺的危害亚硝胺具有强致癌性，胃癌和食管癌与N-亚硝胺类化合物脱不了干系。亚硝胺的代谢活化致癌过程[28]为：亚硝胺α位羟基化，在烷化剂（活性中间代谢产物）作用下，脱掉的甲基使鸟嘌呤烷基化，并与烷基的配位键结合，使DNA、RNA复制错误，从而导致肿瘤甚至癌症。1.3.3亚硝胺的阻断李佳栋[29]等通过制备桂皮、丁香和花椒提取液，对比其对风干肠中亚硝胺的阻断能力，发现阻断能力由强到弱的依次是桂皮、丁香和花椒。袁小敏[30]等通过确定小叶苦丁茶的最佳工艺，利用紫外分光光度计测定阻断率，发现叶苦丁茶对亚硝酸盐有良好的清除效果,对亚硝胺生成有良好的抑制作用。范瑞霞[31]等以超声波辅助法提取的葡萄果皮提取物为材,分光光度法测定其清除自由基、亚硝酸盐及阻断亚硝胺合成的能力，发现葡萄果皮提取液具有较强的抗氧化能力,可清除自由基及亚硝酸盐,阻断亚硝胺的合成。1.4测定方法1.4.1测定亚硝酸盐的方法食品中亚硝酸盐的测定方法有：快速测定管、快速检测仪、快速测定试剂盒，实验室定量测定法有离子色谱法和盐酸萘乙二胺法。具体步骤按照GB5009.33进行[32]。其计算公式为：--------------------------------------------------（1-1）X1:样品中亚硝酸钠含量，；A1:通过标曲求得试样中亚硝酸钠的含量，μg；m:样品质量，；V0:试样处理液总体积，；V1：测定用试样体积，。1.4.2测定亚硝胺的方法食品中测定亚硝胺的方法有5种：气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、气相色谱-热能分析仪联用法、高效液相色谱-质谱联用法、二次展开光解薄层层析法[33]。具体步骤按照GB5009.26进行[34]。1.5意义和内容1.5.1意义日常生活中亚硝酸盐可谓无处不在，因此亚硝酸盐的清除就至关重要。柠檬柠檬中含有很多有益身体健康的活性物质，利用柠檬来清除食品中的亚硝酸盐不仅可以增加食品的风味，还能有效阻断亚硝胺的合成，有助于人体饮食健康。1.5.2内容本课题以鲜柠檬为研究对象，研究其对亚硝酸盐起清除作用的生物活性物质，采用超声-微波协同萃取法提取柠檬中的有效成分，再利用对氨基苯磺酸-盐酸萘乙二胺分光光度法测定柠檬对亚硝酸盐的清除率。在温度、乙醇浓度、物料比和萃取时间等单因素实验基础上，探究提取液剂量、清除时间和清除温度对清除率的影响，确定柠檬清除亚硝酸盐的最佳条件，在此条件下对柠檬果肉和皮的清除率进行比较，并将最佳方案应用于实际样品中，为进一步了解鲜柠檬的性质和在工艺生产中更好的利用提供理论基础。通过对比柠檬对亚硝胺合成的阻断率，确定其最佳提取液用量和反应时间。2材料与方法2.1实验仪器和试样2.1.1试剂序号名称规格厂家四硼酸钠分析纯北京世纪拓鑫精细化工有限公司亚铁氰化钾分析纯湖南和诚医药化学品有限公司无水对氨基苯磺酸分析纯无锡市福晨化学试剂厂氢氧化钠粒张家港保税区豫东国际贸易有限公司盐酸分析纯兰溪市屹达化工试剂有限公司N-1-萘乙二胺盐酸盐分析纯无锡市福晨化学试剂厂7无水乙醇分析纯武汉市合中生化制造有限公司8乙酸锌分析纯天津金汇太亚化学试剂有限公司9亚硝酸钠分析纯无锡市福晨化学试剂厂10无水碳酸钠分析纯上海东懿化学试剂公司11二乙胺分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心2.1.2设备序号名称型号厂家电子天平XYEB江苏淮安翔宇电子有限公司恒温水浴锅HH-M4上海赫田科学仪器有限公司台式低速离心机DT5-1北京时代北利离心机有限公司4组织捣碎机FK-A金坛市晨阳电子仪器厂5超声微波协同萃取仪SL-SM300南京顺流仪器有限公司6可见分光光度计T6v南京菲勒仪器有限公司7洁净工作台SW-CJ-2G上海博迅实业有限公司医疗设备厂2.1.3材料牛肉棒市售乡吧佬香鸡块市售盐津桃肉市售酸辣海带香菇豆干市售2.2实验方法2.2.1测定柠檬中水分将扁形称量瓶，洗净，置于恒温干燥箱中0.5~1.0h，置于干燥器内冷却0.5h，称量，并重复至恒重。将柠檬称重，切片，厚度约为5mm，置于称量瓶中于恒温箱中干燥2~4h后，取出，置于干燥器中冷却0.5h，取出，称重，再置于恒温箱中干燥1h，取出，置于干燥器中冷却0.5h，取出，称重，重复以上步骤，至前后两次质量相差不超过2mg，即为恒重，计算柠檬含水量。其计算公式为：含水量（%）=--------------------------------------------------（2-1）m1：称量瓶和柠檬的质量，gm2:称量瓶和柠檬干燥后的质量，gm3:称量瓶的质量，g2.2.2提取柠檬中有效成分将柠檬切块，剥离柠檬果皮和果肉，分别用组织捣碎机捣碎。根据物料比，取适量柠檬碎浆、果皮碎浆或果肉碎浆，用100%无水乙醇浸提，经超声波微波萃取后，用纱布将其过滤，将滤液移入离心管，4000r/min离心20min，取上清液备用。2.2.3测定亚硝酸盐清除率取六份1.00mL5μg/mL的NaNO2于标号为a1、a2、a3、b1、b2、b3的25mL容量瓶中，a1、a2、a3中加适量柠檬提取液，振荡均匀，静置反应10min，b1、b2、b3中不加提取液，之后a1、a2、a3、b1、b2、b3中都加入4g/L对氨基苯磺酸溶液1mL，振荡均匀，充分反应5分钟后再都加入2g/L盐酸萘乙二胺溶液0.5mL，反应15分钟，加100%乙醇溶液定容摇匀，最后再于538nm波长处用1cm石英比色皿测其吸光度，取其平均值，计算亚硝酸盐的清除率。其计算公式为：-----------------------------------------（2-2）Ai：加入柠檬提取液的吸光度A0：未加入柠檬提取液的吸光度因柠檬提取液本身颜色较浅，对清除率的影响不大，故没有测其吸光度。2.2.3测定亚硝胺阻断率取六份1.00mL5μg/mL的NaNO2于标号为a1、a2、a3、b1、b2、b3的25mL容量瓶中，a1、a2、a3中加适量柠檬提取液，再各加2mL1mmoL二乙胺溶液，以100%乙醇溶液定容，振荡摇匀，静置反应一定时间后，吸取1mL反应液于小烧杯中，加0.5mL0.5%碳酸钠溶液，在距液面15cm处用波长254nm紫外灯照射15min，加1.5mL1%对氨基苯磺酸，1.5mL0.1%盐酸奈乙二胺，0.5mL100%乙醇溶液，混匀静置15min。在525nm处测其吸光度，计算亚硝胺的阻断率。其计算公式为：--------------------------------（2-3）A0：未加柠檬提取液的吸光度Ai：加柠檬提取液的吸光度Ai’：柠檬提取液本身的吸光度。2.3绘制标准曲线用1mL移液管依次移取5μg/mL亚硝酸钠标准使用液0.00mL、0.20mL、0.40mL、0.60mL、0.08mL、1.00mL于标号为0、1、2、3、4、5的25mL容量瓶中（其中亚硝酸盐含量分别为0.0μg、1.0μg、2.0μg、3.0μg、4.0μg、5.0μg），分别加入1mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，混匀反应5min，加入0.5mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，反应15min，加100%乙醇溶液定容摇匀。于538nm波长处用1cm石英比色皿测其吸光度，以标号为0的容量瓶中溶液的吸光度为参比。以亚硝酸钠含量（μg）为横坐标，其对应的吸光度为纵坐标绘制标准曲线2.4确定最佳提取条件2.4.1物料比分别称取15g、10g、8g、6g、5g柠檬碎浆，按物料比1:2、1:3、1:4、1:5、1:6加入相应体积100%的乙醇溶液，震荡摇匀，于100W、48℃条件下用超声波微波协同萃取仪萃取60s提取有效成分，提取液用纱布过滤，转入离心管，4000r/min离心20min，取上清液备用。按照方法2.2.3进行实验，绘图。2.4.2提取时间称取30g柠檬碎浆，按物料比1:3加相应体积100%的乙醇溶液，振荡摇匀，于100W、63℃条件下用超声波微波协同萃取仪分别萃取30s、60s、90s、120s、150s提取有效成分，提取液用纱布过滤，转入离心管，4000r/min离心20min，取上清液备用。按照方法2.2.3进行实验，绘图。2.4.3提取温度（因该溶液为乙醇溶液，故超声波微波协同萃取仪萃取时温度最多达到70℃）按照方法2.2.3进行实验，绘图。2.4.4乙醇浓度按照方法2.2.3进行实验，绘图2.4.5提取条件的正交选择物料比、提取时间、提取温度和乙醇浓度做正交实验。表2-1正交实验因素及水平表4567892.5确定最佳清除条件2.5.1提取液用量取八份1.00mL5μg/mL的NaNO2于标号为0、1、2、3、4、5、6、7的25mL容量瓶中，其中标号为0的25mL容量瓶不加柠檬提取液，标号为1~7的容量瓶用20mL移液管分别移取1mL、3mL、5mL、7mL、9mL、11mL、13mL柠檬提取液，且每份都做3个平行，振荡摇匀，静置反应10min，加1mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，振荡均匀，于室温下充分反应5分钟，加0.5mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，反应15min，加100%乙醇溶液定容摇匀，于538nm波长处用1cm石英比色皿测其吸光度。2.5.2反应时间取六份1.00mL5μg/mL的NaNO2于标号为0、1、2、3、4、5的25mL容量瓶中，其中标号为0的25mL容量瓶不加柠檬提取液，标号为1~5的容量瓶用20mL移液管分别移取7mL柠檬提取液，且每份都做3个平行，振荡摇匀，1~5号容量瓶分别静置反应5min、10min、15min、20min、25min，加1mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，振荡均匀，于室温下充分反应5分钟，加0.5mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，反应15min，加100%乙醇溶液定容摇匀，于538nm波长处用1cm石英比色皿测其吸光度。2.5.3反应温度2.5.4清除条件的正交将提取液用量、反应时间和反应温度做正交试验。表2-2正交实验因素及水平表2.5.5柠檬果皮和果肉的对比取三份1.00mL5μg/mL的NaNO2于标号为0、a、b的25mL容量瓶中，其中标号为0的25mL容量瓶不加提取液，标号为a、b的容量瓶用10mL移液管分别移取7mL柠檬果皮提取液和柠檬果肉提取液，且每份都做3个平行，振荡摇匀，于50℃水浴锅中静置反应5min，加1mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，振荡均匀，于室温下充分反应5分钟，加0.5mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，反应15min，加100%乙醇溶液定容摇匀，于538nm波长处用1cm石英比色皿测其吸光度。2.6实际样品2.6.1处理样品选择市售的宏香記牛肉棒、乡吧佬香鸡块、盐津桃肉和烧烤味香菇豆干为实际样品，分别标号为样品1、样品2、样品3和样品4。具体按照GB5009.33进行。2.6.2计算样品中亚硝酸盐含量用20mL移液管移取20mL的滤液于25mL容量瓶中，加1mL4g/L对氨基苯磺酸溶液，反应5min，加0.5mL2g/L盐酸萘乙二胺溶液，反应15min，用100%乙醇溶液定容，摇匀，于538nm波长处用1cm石英比色皿测其吸光度，计算样品中亚硝酸盐的含量。2.6.3清除样品中亚硝酸盐将市售的宏香記牛肉棒、乡吧佬香鸡块、盐津桃肉和烧烤味香菇豆干作为样品，用组织粉碎机把样品搅碎至均匀，称取适量样品（其亚硝酸盐含量与正交优化中所使用的亚硝酸钠含量相同）于25mL容量瓶中，用10mL移液管移取7mL柠檬提取液，在20℃下反应40min，按照国标法进行。2.7确定阻断亚硝胺合成条件2.7.1提取液用量分别移取3mL、5mL、7mL、9mL、11mL柠檬提取液于25mL容量瓶中，再另准备一容量瓶，都加1mL5μg/mL亚硝酸钠，2mL1mmL二乙胺溶液，以100%乙醇溶液定容，振荡摇匀，静置反应5min，吸取1mL反应液于小烧杯中，加0.5mL0.5%碳酸钠溶液，在距液面15cm处用波长254nm紫外灯照射15min，加1.5mL1%对氨基苯磺酸，1.5mL0.1%盐酸奈乙二胺，0.5mL100%乙醇溶液，混匀静置15min。在525nm处测其吸光度，计算亚硝胺的阻断率。2.7.2反应时间移取7mL柠檬提取液于25mL容量瓶中，再另准备一容量瓶，都加1mL5μg/mL亚硝酸钠，2mL1mmL二乙胺溶液，以100%乙醇溶液定容，振荡摇匀，分别静置反应3min、5min、7min、9min，吸取1mL反应液于小烧杯中，加0.5mL0.5%碳酸钠溶液，在距液面15cm处用波长254nm紫外灯照射15min，加1.5mL1%对氨基苯磺酸，1.5mL0.1%盐酸奈乙二胺，0.5mL100%乙醇溶液，混匀静置15min。在525nm处测其吸光度，计算亚硝胺的阻断率。3结果与分析3.1测定柠檬中水分按照2.2.1中实验步骤处理，见表3-1表3-1柠檬含水量烧杯质量/g柠檬质量/g柠檬恒重/g98.9090143.894520.1986含水量（%）85.96提取液含水量（%/mL）21.493.2绘制标准曲线按照2.3中实验步骤处理，见图3-1。图3-1吸光度和亚硝酸盐含量的关系Y=0.0266X-0.0006，相关系数为0.9986是标准曲线的线性回归方程。3.3选择最佳提取条件3.3.1物料比按照2.4.1中实验步骤处理，见图3-2图3-2物料比与清除率的关系结论：当物料比为1:3时，清除率最高。当物料比超过1：3后清除率有下降趋势，其原因为物料比越大，提取液越浑浊，对溶液的吸光度影响越大。3.3.2提取时间按照2.4.2中实验步骤处理，见图3-3。图3-4提取时间与清除率的关系结论：选取60s为最佳提取时间。清除率随着提取时间的增多而提高，但提取时间对清除率的影响相对小，在60s时清除率提高相对较大，60s之后趋于平缓，故选取60s为最佳提取时间。3.3.3提取温度按照2.4.3中实验步骤处理，见图3-4。图3-3提取温度与清除率的关系结论：当提取温度为70℃时，清除率最佳。随着反应温度的增加，清除率越高，但因提取液为乙醇溶液，超声波微波协同萃取仪萃取时温度最多达到70℃，故选取最佳提取温度为70℃。3.3.4乙醇浓度按照2.4.4中实验步骤处理，见图3-5。图3-5乙醇浓度与清除率的关系结论：选择100%为最佳乙醇浓度。当用纯水作为提取剂时，提取液过于浑浊，导致无法测其吸光度，影响清除率的计算，故选取乙醇溶液作为提取剂。随着乙醇浓度的增加，清除率明显提高，当浓度达到100%时，清除率最好，所以选择100%乙醇溶液作为最佳提取剂。3.3.5提取条件的正交按表2-1，采取L9（34）正交，结果见表3-2。表3-2正交结果分析表清除率（%）51.2470.6764.6675.9753.0052.6566.4355.4872.79K162.1964.5553.1259.01K260.5459.7273.1463.2564.9063.3761.3665.374.364.8320.026.36因素主次CDBAC2D3B1A3分析极差可得最优为C2D3B1A3，因素主次CDBA。乙醇浓度对清除率影响最大，之后依次依为物料比、提取温