组织培养技术课件

植物组织培养技术

植物组织培养技术1

第一章绪论一、植物组织培养的概念

1.概念

植物组织培养（Planttissueculture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。

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2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。2.主要特征3二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。

1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（PlantCulture）：对幼苗和较大植株等的培养。（2）胚胎培养（EmbryoCulture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。（3）器官培养（OrganCulture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。（4）组织培养（TissueCulture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。（5）细胞培养（CellCulture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。（6）原生质体培养（ProtoplastCulture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。

二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型4矮牵牛茎尖离体培养培养矮牵牛茎尖离体培养培养5

牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony牡丹成熟胚的6微型月季茎段离体培养微型月季茎段离体培养7花烛叶片离体快速繁殖花烛叶片离体快速繁殖8大蒜根尖培养及植株再生大蒜根尖培养及植株再生9大蒜试管鳞茎诱导大蒜试管鳞茎诱导10人参细胞悬浮培养人参细胞悬浮培养11非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生12组织培养技术132、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。（2）体细胞胚胎发生（Somaticembryogenesis）：体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下．未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somaticembryo).

2、根据再生途径分为：14直接器官发生间接器官发生体细胞胚胎发生直接器官发生15贯叶金丝桃不定芽直接再生过程贯叶金丝桃不定芽直接再生过程16优化培养基无蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

无BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l无NAA非洲紫罗兰叶片培养优化培养基17优化培养基无蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

无BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l无NAA优化培养基18台湾百合离体培养台湾百合离体培养19大花蕙兰原球茎增殖与植株再生器官发生途径（原球茎的形成）：大花蕙兰原球茎增殖与植株再生器官发生途径（原球茎的形成）：20大蒜愈伤组织培养大蒜愈伤组织培养21日本牵牛花的离体培养日本牵牛花的离体培养22组织培养技术23禾本科牧草的体胚发生过程禾本科牧草的体胚发生过程24菊花体细胞胚胎发生及植株再生菊花体细胞胚胎发生及植株再生25大蒜体细胞胚胎发生过程大蒜体细胞胚胎发生过程26组织培养技术27组织培养技术28人工种子（Artificialseed，SyntheticSeed）：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。人工种子（Artificialseed，Synthet29组织培养技术303、根据培养基的类型分为:

（1）固体培养（Solidculture）:琼脂、卡拉胶等固化。（2）半液半固体培养(SemisolidCulture)：固液双层。（3）液体培养(LiquidCulture)：震荡、旋转或静置培养。3、根据培养基的类型分为:31液体培养的优点：A不使用凝固剂，节约生产成本B营养吸收充分；C操作过程简化。液体培养的优点：32固体培养：液体培养固体培养：液体培养33体胚液体培养体胚液体培养34

不同类型液体培养装置不同类型液体培养装置35液体培养体系液体培养体系36菠萝种苗液体培养系统菠萝种苗液体培养系统37丹参毛状根培养丹参毛状根培养38三、植物组织培养技术的理论基础植物细胞的全能性(Plantcellulartotipotency）从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。

三、植物组织培养技术的理论基础39组织培养技术40

分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。

细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、组织和细胞的不同而异。分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过程中，不同41四、植物组织培养技术的发展历史

1、早期探索阶段（1930年以前）

1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。1902年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。1904年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。1922年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。四、植物组织培养技术的发展历史422、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要作用。1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决定。1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）431952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。1955年，Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素—激动素，后来发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万倍。1957年，Skoog和Miller发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根和芽的发生。1958年，Maheshwari和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，Reinert和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽443、植物组织培养技术的发展（1960年以后）1960年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖；1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基（MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。1971年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要成分是Ti质粒。1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。3、植物组织培养技术的发展（1960年以后）451979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonalvariation）”这一术语。1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的DNA，表明可以用外源DNA对原生质体进行遗传转化。1982年，Zimmermann利用电刺激进行原生质体融合。1985年，Horsch等用土壤农杆菌对叶盘进行感染和转化，并得到再生的转化植株。1979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共46五、植物组织培养技术的应用1、优质种苗的快速无性繁殖：（1）无性繁殖作物及不易繁殖作物的快速繁殖园艺植物种苗工厂化生产五、植物组织培养技术的应用1、优质种苗的快速无性繁殖：园艺植47兰科植物生产兰科植物生产48ABECFG花烛属植物ABECFG花烛属植物49厥类植物厥类植物50盆栽及切花植物的繁殖盆栽及切花植物的繁殖51珍贵树种珍贵树种52无菌苗快速繁殖无菌苗快速繁殖53无菌苗驯化无菌苗驯化54组培苗驯化移栽组培苗驯化移栽55茎、芽和小植株的规模培养

茎、芽和小植株的规模培养56经济植物快速繁殖经济植物快速繁殖57组织培养技术58组织培养技术59（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、甘蔗、马铃薯、大蒜等。（2）通过茎尖培养生产脱毒健康种苗：如草莓、香蕉、甘蔗、60virus-freetissue茎尖培养脱毒virus-free茎尖培养脱毒61脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养脱毒马铃薯种薯生物反应器液体培养622、用于植物遗传育种包括种质资源离体保存；花粉花药培养产生单倍体；胚乳培养产生三倍体；胚培养拯救杂种胚克服远缘杂交障碍；原生质体培养进行体细胞杂交；植物体细胞无性系变异诱导和筛选；用于植物基因转移操作等。2、用于植物遗传育种63种质资源的离体保存种质资源的离体保存64体细胞无性系变异筛选体细胞无性系变异筛选65花粉、花药培养产生单倍体植株花粉、花药培养产生单倍体植株66幼胚拯救克服远缘杂交障碍幼胚拯救克服远缘杂交障碍67用于基因工程技术创造植物新种质。用于基因工程技术创造植物新种质。683、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；3、大规模植物细胞、组织和器官培养生产次生代谢物质；69

根培养:正常根培养，毛状根培养根培养:正常根培养，毛状根培养704、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细胞与分子生物学等。4、用于植物生长发育理论研究，包括生理学、病理学、胚胎学和细71

植物胚胎发生理论研究植物72生长发育特性研究生长发育特性研究73

2005年9月6日2005年9月6日74

植物组织培养技术

植物组织培养技术75

第一章绪论一、植物组织培养的概念

1.概念

植物组织培养（Planttissueculture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。

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2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。2.主要特征77二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。

1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（PlantCulture）：对幼苗和较大植株等的培养。（2）胚胎培养（EmbryoCulture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。（3）器官培养（OrganCulture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。（4）组织培养（TissueCulture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。（5）细胞培养（CellCulture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。（6）原生质体培养（ProtoplastCulture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。

二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型78矮牵牛茎尖离体培养培养矮牵牛茎尖离体培养培养79

牡丹成熟胚的离体培养与快速繁殖Matureembryocultureandrapidpropagationoftreepeony牡丹成熟胚的80微型月季茎段离体培养微型月季茎段离体培养81花烛叶片离体快速繁殖花烛叶片离体快速繁殖82大蒜根尖培养及植株再生大蒜根尖培养及植株再生83大蒜试管鳞茎诱导大蒜试管鳞茎诱导84人参细胞悬浮培养人参细胞悬浮培养85非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生非洲紫罗兰原生质体分离、培养及植株再生86组织培养技术872、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。如茎尖培养。间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。如叶片培养。（2）体细胞胚胎发生（Somaticembryogenesis）：体胚发生途径是指二倍体或单倍体的体细胞在特定条件下．未经性细胞融合而通过与合子胚发生类似的途径发育出新个体的形态发生过程。经体胚发生形成类似合子胚的结构称为胚状体（embryoid）或体细胞胚(somaticembryo).

2、根据再生途径分为：88直接器官发生间接器官发生体细胞胚胎发生直接器官发生89贯叶金丝桃不定芽直接再生过程贯叶金丝桃不定芽直接再生过程90优化培养基无蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

无BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l无NAA非洲紫罗兰叶片培养优化培养基91优化培养基无蔗糖1%蔗糖5%蔗糖

无BAPBAP0.1mg/lBAP5.0mg/l无NAA优化培养基92台湾百合离体培养台湾百合离体培养93大花蕙兰原球茎增殖与植株再生器官发生途径（原球茎的形成）：大花蕙兰原球茎增殖与植株再生器官发生途径（原球茎的形成）：94大蒜愈伤组织培养大蒜愈伤组织培养95日本牵牛花的离体培养日本牵牛花的离体培养96组织培养技术97禾本科牧草的体胚发生过程禾本科牧草的体胚发生过程98菊花体细胞胚胎发生及植株再生菊花体细胞胚胎发生及植株再生99大蒜体细胞胚胎发生过程大蒜体细胞胚胎发生过程100组织培养技术101组织培养技术102人工种子（Artificialseed，SyntheticSeed）：是指植物离体培养产生的胚状体或不定芽被包裹在含有营养和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。作为繁殖材料。人工种子（Artificialseed，Synthet103组织培养技术1043、根据培养基的类型分为:

（1）固体培养（Solidculture）:琼脂、卡拉胶等固化。（2）半液半固体培养(SemisolidCulture)：固液双层。（3）液体培养(LiquidCulture)：震荡、旋转或静置培养。3、根据培养基的类型分为:105液体培养的优点：A不使用凝固剂，节约生产成本B营养吸收充分；C操作过程简化。液体培养的优点：106固体培养：液体培养固体培养：液体培养107体胚液体培养体胚液体培养108

不同类型液体培养装置不同类型液体培养装置109液体培养体系液体培养体系110菠萝种苗液体培养系统菠萝种苗液体培养系统111丹参毛状根培养丹参毛状根培养112三、植物组织培养技术的理论基础植物细胞的全能性(Plantcellulartotipotency）从理论上讲，植物体的每个生活细胞都具有该植物体的全部遗传信息，在特定的离体培养条件下，具有发育成完整植株的潜在能力。

三、植物组织培养技术的理论基础113组织培养技术114

分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过程中，不同部位的细胞形态结构和生理功能发生改变，形成不同组织或器官。脱分化也称去分化，是指离体条件下生长的细胞、组织或器官逐渐失去原来的结构和功能而恢复分生能力，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。再分化是由脱分化形成的愈伤组织重新分化出特定细胞、组织和器官的过程。

细胞全能性的表达：尽管理论上每个细胞都具有全能性，但实际表达难易程度却随植物种类、组织和细胞的不同而异。分化、脱分化与再分化：分化是指个体发育过程中，不同115四、植物组织培养技术的发展历史

1、早期探索阶段（1930年以前）

1893年，Schwann和Scheiden提出细胞学说及植物细胞全能性理论。1902年，德国植物生理学家Haberlandt第一次尝试采用植物组织培养技术对小野芝麻、风眼兰叶肉组织及万年青属植物的表皮细胞进行培养，但未能培养成活。1904年，Hanning首次对十字花科的萝卜和辣根的胚培养成功。1922年，Knudson将兰花种子在离体的条件下非共生萌发。同年，Knotte和Robbins对离体根尖进行了培养。Robbins还对豌豆、玉米及棉花的茎尖进行了培养，只形成一些缺绿的叶和根。1925年，Laibach利用胚培养技术对亚麻的种间杂种胚进行了培养，并于1929年利用亚麻的胚培养来克服杂交不亲和性。四、植物组织培养技术的发展历史1162、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）1933年，我国植物生理学家李继侗培养银杏胚胎，并发现银杏胚乳提取液可促进离体胚的生长。1937年，White发现B族维生素对离体根培养的重要性。并指出IAA对植物生长发育的控制起重要作用。1937,1938年，Gantheret在培养基中加入上述生长因子，使得柳树形成层诱导形成的愈伤组织连续生长。Nobecomt对烟草种间杂种茎段的形成层细胞培养也得到了类似的结果。1948年，Skoog等通过对烟草茎段和髓培养发现，不定芽和不定根的发生由生长素/腺嘌呤的比例决定。1950年，Ball从红杉愈伤组织培养中再生获得器官。2、植物组织培养技术的初步形成（1930-1960年）1171952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽花的脱毒植株，同年，首次应用微型嫁接技术。1953年，Tuleche首次从花粉培养中获得银杏的单倍体愈伤组织。1955年，Miller等发现了一种促进细胞分裂的植物激素—激动素，后来发现激动素可用来代替腺嘌呤促进芽的形成，而且其效力比后者高3万倍。1957年，Skoog和Miller发现改变细胞分裂素/生长素比例，可以控制根和芽的发生。1958年，Maheshwari和Rangaswamy从柑橘胚珠的珠心组织培养中再生获得体细胞胚；同年，Reinert和Steward分别从胡萝卜的愈伤组织和细胞培养中再生得到原胚，为以后的组织培养中器官发生和体细胞胚胎发生奠定了基础，也为植物细胞全能性理论提供了证据。1952年，Morel和Martin通过分生组织培养获得大丽1183、植物组织培养技术的发展（1960年以后）1960年，Morel利用兰花茎尖培养对兰花进行营养繁殖；1962年，Murashige和Skoog开发出最著名的Murashige和Skoog培养基（MS基本培养基），并被后来广泛采用的基本培养基。1964年，印度人Guha和Maheshwari利用曼陀罗花粉培养获得第一例单倍体植株。从而开辟了单倍体育种技术。1971年，Takebe等获得第一例原生质体培养的再生植株。1972年，Carlson等利用原生质体融合在两个烟草属中进行种间杂交。1974年，Murashige等利用细胞分裂素诱导茎尖侧芽分枝。Zaenen和Larebeke分别发现土壤农杆菌（Agribacterium）中的根瘤诱导的主要成分是Ti质粒。1978年，Melchers等进行了番茄和马铃薯的体细胞杂交。3、植物组织培养技术的发展（1960年以后）1191979年，Marton提出了利用植物原生质体和土壤农杆菌共培养的方法进行转化。1981年，Larkin和Scowcroft引入“体细胞无性系变异（Somaclonalvariation）”这一术语。1982年，Krens等的工作证明，原生质体可以摄入裸露的