血球计数板计数试验

环工综合实验血球计数板计数实验实验报告环境科学与工程学院实验中心实验题目血球计数板计数实验实验类别综合实验室实验时间实验环境温度：湿度：同组人数一、实验目的了解血球计数板的结构掌握利用血球计数板计微生物细菌数的原理和方法二、实验仪器及设备细菌及培养基：斜面仪器：血球计数板，显微镜。其它：蒸馏水，盖玻片，载玻片，无菌吸管，10mL、5mL移液管三、实验原理实验原理问答题：.血球计数板计数原理是什么？如何使用血球计数板对微生物尺寸大小进行测定？答：血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2,每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3,每个小方格的体积为1/4000mm3。使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。.血球计数板计算微生物数量的优缺点是什么？血球计数板与平板稀释法对细菌个数进行测定，结果往往差别很大。分析原因。答：⑴将细菌（或其他微生物）以染料（例如结晶紫）染色后，直接以显微镜观察的方式计数，再推算回细菌数，所得即为总菌数，即死菌、活菌一并计算。优点：简单、快速、重复性高。不足：不能区分死细胞和活细胞，应用范围较窄；一些小的细胞在显微镜下很难看到；样品中菌液浓度不能低于106个/mL；不能用于菌丝体或呈链状而不分散的微生物测定⑵血球计数板计量时所得到的结果为死菌与活菌的总数，而平板稀释法培养得到的为活菌数目，因此结果差异较大。四、实验步骤.稀释：取接种酵母菌的斜面一支，加入5ml无菌水，摇晃试管一分钟，使形成菌液；将菌液倒入洁净的150ml锥形瓶中，加结晶紫三滴，摇晃2分钟，再加入无菌水至50ml。.镜检计数室：在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗后才能进行计数。.加样品：将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的细口滴管将稀释的酿酒酵母菌液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。.显微镜计数：静止5分钟后，将血球计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有5—10个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的值来计算样品的含菌量。.清洗血球计数板：使用完毕后，将血球计数板在水笼头上用水柱冲洗，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。（注意：血球计数板计数室只能水冲，不得擦拭！）五、实验数据及观察结果血球计数板镜检结果：稀释倍数：5mLf50mL,10倍5个中格内分别有10、10、5、7、9个菌体六、数据处理及结论N=10+10+5+7+9=41 稀释倍数：10酵母菌浓度二N义25/5义10义106义稀释倍数=41X25/5X10X106X10=2.05X1010cfu/L七、思考题.有人想通过测量菌液浊度来计算细菌数量。他的想法可行吗？试分析。答：可行。使用细菌浊度计测量菌株悬液中细菌浓度，菌液的浓度可用麦克法伦特氏标准比浊法来测定：配制1%硫酸溶液及1%氯化钡溶液，按梯度配置混悬液，得到一系列标准比浊管，将洗下的细菌原液放入与比浊管相同的试管中并予以一定稀释。与标准比浊管相比较，视其浊度相当于比浊管的第几管，然后将比浊管相当菌数乘以稀释倍数即可得到每毫升中所含细菌的数量。.微生物学在环境工程学科的作用如何？请描述。（广泛、详细，不少于500字，并举例说明环境工程中微生物的应用）答：随着人们生活水平的提高，大家对生活环境的要求也日益严格，环境工程在各领域的相关研究工作正迅速得到重视，治理环境的手段多样化、高效化同时也需要更绿色化，因此我们越来越多地将目光放到了生物治理或仿生治理，以期达成低污染低能耗高效率的治理效果，此类降低或消除污染物的生产工艺能够高效净化环境污染，同时又能生产有用物质，在现代生活与工业生产中具有重大意义。这其中，微生物有其他物种不具备的优势，微生物物种最为丰富，代谢功能具有多样性，适应环境、进化的代谢途径也最快速。美国等发达国家的经验证明，突发环境事件发生后，通过应用微生物技术可以在较短的时间内使污染状况得到一定程度的治理。由于微生物有容易发生变异的特点，随着新污染物的产生和数量的增多，微生物的种类可随之相应增多，呈现出更加丰富的多样性。二十世纪七十年代以后许多在极端环境中生活的微生物引起了人们的极大关注。环境工程遇到的废水不少是极端条件下的，如稠油废水、焦化废水和化肥废水一般为70〜80℃的温度，味精废水的温度极低（2〜4℃）,pH极低，在2~3之间，盐度也高，还有矿山酸性废水、碱性废水、高盐有机废水等。实际上环境工程面临的此类废水越来越多，处理难度越来越大，因此，开发极端环境微生物资源处理废水有着广阔的前景。当今，城市生活污水、医院污水和各种有机工业废水（如屠宰、食品、乳品、印染、制药、煤气、焦化、化肥、造纸、采油工业稠油废水、石油提炼、石油化工、化纤、农药等）都在用生物方法处理，甚至有毒废水、城市有机固体废物和工业产品废物如废电池等都可用微生物方法处理。随着微生物学中各个分支学科相互渗透，尤其是分子生物学、分子遗传学的发展，促进了微生物分类学的完善，也促进微生物应用技术的进步，推动了生物工程的发展，在环境工程中也是如此，如固定化酶、固定化微生物细胞处理工业废水，筛选优势菌，筛选处理特种废水的菌种，甚至在探索用基因工程技术构建超级菌用于环境工程事业，这方面已有分解石油烃类的超级菌的实例（自然环境中有一种假单抱杆菌的细菌能够分解石油中的某一种成分。科学家用基因工程的方法，把能分解三种烃类的基因都转移到能分解另一种烃类的假单抱杆菌内，创造了能同时分解四种烃类的超级细菌）。微生物在很多领域已经有了应用的实例。例如微生物处理有机垃圾，该技术的基本原理是：利用微生物降解菌产生多种酶，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、壳素酶、纤维素酶、氧化酶、水解酶等，对分类后的有机垃圾（以厨余垃圾为主，包括果皮、菜叶、菜根、废纸、食品残渣、鸡鸭鱼肉废弃物、虾蟹壳、蛋壳、骨头和泔脚等）进行快速分解，从而使96%的有机垃圾转变为热能、二氧化碳、水及少量的NH3；有机垃圾经过有机垃圾微生物处理机处理后，大约4%的物质残留在生物基质里，残余物主要是有机垃圾被微生物分解后残存的无机矿物质、菌床基质以及微生物残体等。经有关研究机构对经过微生物处理设备处理后的有机生活垃圾残余物进行测试，结果表明，残余物的各项指标都有利于土壤的改良，其中有机质占为82.5%，总N、总P（P2O5）、总K（K2O）的分别占0.037%、0.966%、2.88%，肥效相当于有机肥。因此，有机垃圾经该设备处理后的残余物可就近消化，一般可直接回用于土壤改良或园林建设