海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件

研究生：杨冠科指导教师：丛丽娜教授海参钙离子通道基因的克隆与性质分析研究生：杨冠科海参钙离子通道基因的克隆与性质分析1海参钙离子通道简介论文的主要工作内容结论与展望②①③海参钙离子通道简介论文的主要工作内容结论与展望②①③2海参（SeaCucumber）海参（SeaCucumber）3海参自溶现象，困扰生产商多年养殖过程中遇到的诸多问题，持续出现传统的理论解释和研究方法不能满足生产和科研的需要。关键问题-------海洋的高盐浓度及高压环境盐离子浓度离子通道海参自溶现象，困扰生产商多年4离子通道（IonChannel）离子通道（IonChannel）5钙离子通道钙离子通道6本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道β亚基基因进行了研究用生物信息学手段对所得到的该基因全序列进行了性质分析本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道β亚基基因进行了研7论文的主要工作内容总RNA的提取利用设计的简并引物进行RT-PCR设计引物，进行3'RACEPCR设计引物，进行5'RACEPCR拼接全序列并进行生物信息学分析论文的主要工作内容总RNA的提取8总RNA的提取TRIzol法总RNA的提取TRIzol法9RT-PCR简并引物的设计

为了设计简并引物，我们比对了如下物种钙离子通道β亚基的氨基酸序列：

合浦珠母贝(Pinctadafucata,GenBankaccessionnumber:EF154452)

紫色球海胆（Strongylocentrotuspurpuratus,GenBankaccessionnumber:XM_785360）

锥实螺(Lymnaeastagnalis,GenBankaccessionnumber:AF484087)

人(Homosapiens,GenBankaccessionnumber:BC075049)

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,GenBankaccessionnumber:AF000198)

牛（BosTaurus,GenBankaccessionnumber:AF174417）

曼森血吸虫(Schistosomamansoni,GenBankaccessionnumber:AY277532)目的：扩增海参的钙离子通道β亚基的保守区RT-PCR简并引物的设计为了设计简并引物，我们比对10海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件11最终引物HS4-1:5′-ARYAATGAYTGGTGGAT-3′HS4-2:5′-GCYTTYTGCATCATRTCT-3′注：R=A/GY=C/T最终引物HS4-1:5′-ARYAATGAYTGGTGG12RT-PCR结果

RT-PCR结果13二次PCR结果二次PCR结果14RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落P15SjCaβ保守区测序结果443bpSjCaβ保守区测序结果443bp16SjCaβ保守区的BLASTXSjCaβ保守区的BLASTX17长度为443bp的产物5‘RACE实验3‘RACE实验拼接SjCaβ全序列长度为443bp的产物5‘RACE实验3‘RACE实验183′RACE引物设计3′RACEOuterPrimer:5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′HS4-1-GSP1(OuterPrimer):5′-TTCACCCTGGCTAACTCACG-3′3′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’HS4-1-GSP2(InnerPrimer):5′-GAATCGCTACGGAGAACGAAAAGTG-3′使用试剂盒：3′-FullRACECoreSetVer.2.0（TaKaRa）

3′RACE引物设计3′RACEOuterPrim193'RACEPCR结果

3’OuterPCR3’InnerPCR3'RACEPCR结果

3’OuterPCR3’Inn203’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图3’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落21SjCaβ3'RACE测序结果SjCaβ3'RACE测序结果22序列长为1019bp经过序列比对得到此序列的5′端与SjCaβ序列保守区的3′端有188个碱基重合，且有poly(A)尾初步判断3′端的扩增是成功的序列长为1019bp235′RACE引物设计5′RACEOuterPrimer:5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′HS4-1-GSP3(OuterPrimer):5′-AGGCGGTGTGTTATCAGATTGCT-3′5′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′HS4-1-GSP4(InnerPrimer):5′-GTGTCCCACTTTTCGTTCTCCGTAGC-3′使用试剂盒：5′-FullRACEKit（TaKaRa）

5′RACE引物设计5′RACEOuterPrim245'RACEPCR结果

5’InnerPCR5'RACEPCR结果

5’InnerPCR255’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图5’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落26SjCaβ5'RACE测序结果SjCaβ5'RACE测序结果27序列长为879bp经过序列比对得到此序列的3′端与SjCaβ序列保守区的5′端有281个碱基重合因此可初步判断5′端是扩增成功的序列长为879bp28把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβcDNA基因全长1867bp将该cDNA序列提交至GenBank（GenBankaccessionnumber:EU853658）把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβcDNA基因全长29SjCaβ的生物信息学分析利用NCBI的ORFFinder分析，SjCaβ全长cDNA中，5′非编码区（UTR）179bp，3′UTR74bp，开放阅读框（ORF）长度1614bp，编码537个氨基酸在3′端的非编码区中，距离poly(A)尾上游10个核苷酸的位置有推测的真核生物基因的多聚腺苷酸加尾信号（polyadenylationsignalsite）AATAAA的出现SjCaβ的分子量预测值为59.8kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13Dipro软件分析表明,在该氨基酸序列中共有3个半胱氨酸残基，其中Cys410和Cys428之间可能会形成一个二硫键

SjCaβ的生物信息学分析利用NCBI的ORFFinder30ProtScale程序运算的结果显示：SjCaβ的第370位异亮氨酸（Ile）疏水性最强，第501位组氨酸（His）亲水性最强，大部分氨基酸属于亲水性氨基酸（分数为负值），由此可以推测此蛋白可能为亲水性蛋白

ProtScale程序运算的结果显示：31海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件32海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件33SjCaβ包含有三个高度保守的功能区位于D4区的VDCCα亚基结合相关的BID区（Lys250~Phe290）位于D2区能够调节激酶活性的SH3功能区（Val99~Ser159）位于D4区调节VDCCβ亚基活性的GK功能区（Arg265~Trp439）SjCaβ包含有三个高度保守的功能区34D1D2D2D3D3D4D4D4D5D5BIDSH3功能区GK功能区几乎是整个D4区D1D2D2D3D3D4D4D4D5D5BIDSH3功能区G35SjCaβ内的活性位点

9个蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点ProteinkinaseC(PKC)phosphorylationsites9个酪蛋白激酶Ⅱ（CK2）磷酸化位点CaseinkinaseⅡ(CK2)phosphorylationsites2个cAMP依赖型蛋白激酶磷酸化位点cAMP-dependentproteinkinasephosphorylationsites

SjCaβ内的活性位点9个蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点36此图模拟SjCaβ部分氨基酸（Glu77~His443）构成的三级结构。用箭头指出了氨基酸残基Pro262，Pro266，Pro272和Tyr277在此三维结构中的位置（因其可能为β亚基与α1亚基重要的结合部位）。SjCaβ的SH3区和GK区均用白色表示。此图模拟SjCaβ部分氨基酸（Glu77~His443）构成37SjCaβ中GK区（Arg265~Trp439）的三级结构预测。图中BID区N端的序列用白色标出。此模型显示在这个重要的功能片段中是由一个中央β折叠和一个α螺旋组成。

SjCaβ中SH3区（Val99~Ser159）的三级结构预测SjCaβ中GK区（Arg265~Trp439）的三级结构预38讨论SjCaβ具有其他VDCCβ亚基共有的SH3区，GK区以及BID区其他物种BID区中高度保守的序列PSMRP在SjCaβ中变成了PTIRP-------这段保守序列中重要的氨基酸是PKC磷酸化位点SMR中的丝氨酸，而TIR中的苏氨酸也同样是PKC磷酸化位点，且二者都是中性氨基酸，因此推测这种变化并不会造成SjCaβ与其他物种的VDCCβ亚基在功能的差异。曼森血吸虫（Schistosomamansoni）、日本血吸虫（Schistosomajaponicum）和长枪乌贼（Loligobleekeri）等无脊椎动物亦有此现象。讨论SjCaβ具有其他VDCCβ亚基共有的SH3区，39结论首次从海参中克隆了电压依赖性钙离子通道β亚基基因的全长cDNA序列，并由此推测出相应的氨基酸序列。所获得基因的cDNA全长1867bp，包含一个开放阅读框1614bp，编码537个氨基酸。SjCaβ的分子量为59.8kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13。亲水性蛋白。结论首次从海参中克隆了电压依赖性钙离子通道β亚基基因的40SjCaβ具有其他VDCCβ亚基共有的SH3区，GK区以及BID区，虽在氨基酸上略有不同，但其功能却与其它的海洋棘皮动物比较相似。SjCaβ具有其他VDCCβ亚基共有的SH3区，GK区以及41致谢感谢丛丽娜教授、朱蓓薇教授、张宗申教授、侯英敏老师、王璐老师等老师的指导感谢鄢荣歆、王秀霞、郝明、赵文超、王雪霞、薛卫巍、田鹏玮、郭茵、边蕾、谢三群等同学的帮助最后还要感谢一直支持着我的亲朋好友！致谢感谢丛丽娜教授、朱蓓薇教授、张宗申教授、侯英敏老师42THANKYOU！THANKYOU！433’RACEPCR反应5’3’mRNAAAAA…TTTT…TTTT…AAAA…TTTT…5’3’3’adaptorouterprimerPCR反应双链DNA直接测序已知序列特异性引物Gsp1Gsp23’adaptorprimerinnerprimer3’RACEPCR反应5’3’mRNAAAAA…TTTT445’RACEPCR反应5’m7G-P-P-PAAA…3’5’m7G-P-P-PAAA…3’AAA…3’TAPHO-P5’adaptorRTAAA…3’5’5’Gsp1已知序列特异性引物

5’outerprimermRNAcDNARandom9mers5’RACEPCR反应5’m7G-P-P-PAAA…45使用5’RACE方法扩增5‘端序列3‘完整的RNA不完整的RNA3‘3‘PP去磷酸化酶（CIAP）去“帽子”酶（TAP）P5’RACEAdaptor使用5’RACE方法扩增5‘端序列3‘完整的RNA不46TAP(—)反应：检验去磷酸化的反应不彻底造成假阳性3‘完整的RNA不完整的RNA3‘3‘PP去磷酸化酶（CIAP）去“帽子”酶（TAP）5’RACEAdaptorTAP(—)反应：检验去磷酸化的反应不彻底造成假阳性3‘47M-MLV(—)反应：检测染色体DNA造成的假阳性3‘完整的RNA不完整的RNA3‘3‘PP反转录酶M-MLVP5’RACEAdaptorM-MLV(—)反应：检测染色体DNA造成的假阳性3‘48ProteinkinaseC（Ser/Thr-X-Lys/Arg）CaseinkinaseII（Ser/Thr-X-X-Asp/Glu）cAMP-dependentproteinkinase（Lys/Arg-Lys/Arg-X-X-Ser/Thr）ProteinkinaseC（Ser/Thr-X-49研究生：杨冠科指导教师：丛丽娜教授海参钙离子通道基因的克隆与性质分析研究生：杨冠科海参钙离子通道基因的克隆与性质分析50海参钙离子通道简介论文的主要工作内容结论与展望②①③海参钙离子通道简介论文的主要工作内容结论与展望②①③51海参（SeaCucumber）海参（SeaCucumber）52海参自溶现象，困扰生产商多年养殖过程中遇到的诸多问题，持续出现传统的理论解释和研究方法不能满足生产和科研的需要。关键问题-------海洋的高盐浓度及高压环境盐离子浓度离子通道海参自溶现象，困扰生产商多年53离子通道（IonChannel）离子通道（IonChannel）54钙离子通道钙离子通道55本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道β亚基基因进行了研究用生物信息学手段对所得到的该基因全序列进行了性质分析本文用分子生物学手段对海参体内的钙离子通道β亚基基因进行了研56论文的主要工作内容总RNA的提取利用设计的简并引物进行RT-PCR设计引物，进行3'RACEPCR设计引物，进行5'RACEPCR拼接全序列并进行生物信息学分析论文的主要工作内容总RNA的提取57总RNA的提取TRIzol法总RNA的提取TRIzol法58RT-PCR简并引物的设计

为了设计简并引物，我们比对了如下物种钙离子通道β亚基的氨基酸序列：

合浦珠母贝(Pinctadafucata,GenBankaccessionnumber:EF154452)

紫色球海胆（Strongylocentrotuspurpuratus,GenBankaccessionnumber:XM_785360）

锥实螺(Lymnaeastagnalis,GenBankaccessionnumber:AF484087)

人(Homosapiens,GenBankaccessionnumber:BC075049)

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans,GenBankaccessionnumber:AF000198)

牛（BosTaurus,GenBankaccessionnumber:AF174417）

曼森血吸虫(Schistosomamansoni,GenBankaccessionnumber:AY277532)目的：扩增海参的钙离子通道β亚基的保守区RT-PCR简并引物的设计为了设计简并引物，我们比对59海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件60最终引物HS4-1:5′-ARYAATGAYTGGTGGAT-3′HS4-2:5′-GCYTTYTGCATCATRTCT-3′注：R=A/GY=C/T最终引物HS4-1:5′-ARYAATGAYTGGTGG61RT-PCR结果

RT-PCR结果62二次PCR结果二次PCR结果63RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图RT-PCR割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落P64SjCaβ保守区测序结果443bpSjCaβ保守区测序结果443bp65SjCaβ保守区的BLASTXSjCaβ保守区的BLASTX66长度为443bp的产物5‘RACE实验3‘RACE实验拼接SjCaβ全序列长度为443bp的产物5‘RACE实验3‘RACE实验673′RACE引物设计3′RACEOuterPrimer:5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′HS4-1-GSP1(OuterPrimer):5′-TTCACCCTGGCTAACTCACG-3′3′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3’HS4-1-GSP2(InnerPrimer):5′-GAATCGCTACGGAGAACGAAAAGTG-3′使用试剂盒：3′-FullRACECoreSetVer.2.0（TaKaRa）

3′RACE引物设计3′RACEOuterPrim683'RACEPCR结果

3’OuterPCR3’InnerPCR3'RACEPCR结果

3’OuterPCR3’Inn693’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图3’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落70SjCaβ3'RACE测序结果SjCaβ3'RACE测序结果71序列长为1019bp经过序列比对得到此序列的5′端与SjCaβ序列保守区的3′端有188个碱基重合，且有poly(A)尾初步判断3′端的扩增是成功的序列长为1019bp725′RACE引物设计5′RACEOuterPrimer:5′-CATGGCTACATGCTGACAGCCTA-3′HS4-1-GSP3(OuterPrimer):5′-AGGCGGTGTGTTATCAGATTGCT-3′5′RACEInnerPrimer:5′-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG-3′HS4-1-GSP4(InnerPrimer):5′-GTGTCCCACTTTTCGTTCTCCGTAGC-3′使用试剂盒：5′-FullRACEKit（TaKaRa）

5′RACE引物设计5′RACEOuterPrim735'RACEPCR结果

5’InnerPCR5'RACEPCR结果

5’InnerPCR745’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落PCR产物电泳图5’RACE割胶回收及菌落PCR结果割胶回收产物电泳图菌落75SjCaβ5'RACE测序结果SjCaβ5'RACE测序结果76序列长为879bp经过序列比对得到此序列的3′端与SjCaβ序列保守区的5′端有281个碱基重合因此可初步判断5′端是扩增成功的序列长为879bp77把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβcDNA基因全长1867bp将该cDNA序列提交至GenBank（GenBankaccessionnumber:EU853658）把上述三段序列拼接并校正后，得到SjCaβcDNA基因全长78SjCaβ的生物信息学分析利用NCBI的ORFFinder分析，SjCaβ全长cDNA中，5′非编码区（UTR）179bp，3′UTR74bp，开放阅读框（ORF）长度1614bp，编码537个氨基酸在3′端的非编码区中，距离poly(A)尾上游10个核苷酸的位置有推测的真核生物基因的多聚腺苷酸加尾信号（polyadenylationsignalsite）AATAAA的出现SjCaβ的分子量预测值为59.8kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13Dipro软件分析表明,在该氨基酸序列中共有3个半胱氨酸残基，其中Cys410和Cys428之间可能会形成一个二硫键

SjCaβ的生物信息学分析利用NCBI的ORFFinder79ProtScale程序运算的结果显示：SjCaβ的第370位异亮氨酸（Ile）疏水性最强，第501位组氨酸（His）亲水性最强，大部分氨基酸属于亲水性氨基酸（分数为负值），由此可以推测此蛋白可能为亲水性蛋白

ProtScale程序运算的结果显示：80海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件81海参钙离子通道基因的克隆与性质分析课件82SjCaβ包含有三个高度保守的功能区位于D4区的VDCCα亚基结合相关的BID区（Lys250~Phe290）位于D2区能够调节激酶活性的SH3功能区（Val99~Ser159）位于D4区调节VDCCβ亚基活性的GK功能区（Arg265~Trp439）SjCaβ包含有三个高度保守的功能区83D1D2D2D3D3D4D4D4D5D5BIDSH3功能区GK功能区几乎是整个D4区D1D2D2D3D3D4D4D4D5D5BIDSH3功能区G84SjCaβ内的活性位点

9个蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点ProteinkinaseC(PKC)phosphorylationsites9个酪蛋白激酶Ⅱ（CK2）磷酸化位点CaseinkinaseⅡ(CK2)phosphorylationsites2个cAMP依赖型蛋白激酶磷酸化位点cAMP-dependentproteinkinasephosphorylationsites

SjCaβ内的活性位点9个蛋白激酶C（PKC）磷酸化位点85此图模拟SjCaβ部分氨基酸（Glu77~His443）构成的三级结构。用箭头指出了氨基酸残基Pro262，Pro266，Pro272和Tyr277在此三维结构中的位置（因其可能为β亚基与α1亚基重要的结合部位）。SjCaβ的SH3区和GK区均用白色表示。此图模拟SjCaβ部分氨基酸（Glu77~His443）构成86SjCaβ中GK区（Arg265~Trp439）的三级结构预测。图中BID区N端的序列用白色标出。此模型显示在这个重要的功能片段中是由一个中央β折叠和一个α螺旋组成。

SjCaβ中SH3区（Val99~Ser159）的三级结构预测SjCaβ中GK区（Arg265~Trp439）的三级结构预87讨论SjCaβ具有其他VDCCβ亚基共有的SH3区，GK区以及BID区其他物种BID区中高度保守的序列PSMRP在SjCaβ中变成了PTIRP-------这段保守序列中重要的氨基酸是PKC磷酸化位点SMR中的丝氨酸，而TIR中的苏氨酸也同样是PKC磷酸化位点，且二者都是中性氨基酸，因此推测这种变化并不会造成SjCaβ与其他物种的VDCCβ亚基在功能的差异。曼森血吸虫（Schistosomamansoni）、日本血吸虫（Schistosomajaponicum）和长枪乌贼（Loligobleekeri）等无脊椎动物亦有此现象。讨论SjCaβ具有其他VDCCβ亚基共有的SH3区，88结论首次从海参中克隆了电压依赖性钙离子通道β亚基基因的全长cDNA序列，并由此推测出相应的氨基酸序列。所获得基因的cDNA全长1867bp，包含一个开放阅读框1614bp，编码537个氨基酸。SjCaβ的分子量为59.8kD，理论等电点为8.77，分子式为C2583H4151N771O834S13。亲水性蛋白。结论首次从海参中克隆了电压依赖性钙离子通道β亚基基因的89SjCaβ具有其他