不同细胞基质狂犬病疫苗的优缺点探讨-课件

不同细胞基质培养狂犬病疫苗优缺点探讨中国药品生物制品检定所董关木不同细胞基质培养狂犬病疫苗优缺点探讨中国药品生物制品检定所内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、二倍体细胞培养疫苗2、原代细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、原代细胞培养疫苗2、二倍体细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进RabiesvaccinesHistoryFenjeetal原代地鼠肾细胞疫苗Wiktoretal人二倍体细胞培养疫苗Kondoetal鸡胚细胞培养疫苗MontagnonetalVero传代细胞培养疫苗DavidSemple成年羊脑组织疫苗Fuenzalidaetal乳鼠脑组织疫苗Poweletal鸭胚疫苗1885191119551960196419651985RabiesvaccinesHistoryFenjee我国目前人用狂犬病疫苗

一、我国生产的狂犬病疫苗

1、地鼠肾原代细胞纯化疫苗aG株

2、Vero细胞纯化疫苗aG株

3、Vero细胞纯化疫苗CTN株

4、Vero细胞纯化疫苗PM株二、进口疫苗

1、法国Vero细胞纯化疫苗PM株

2、德国鸡胚细胞纯化疫苗Flury-LEP

中国药品生物制品检定所我国目前人用狂犬病疫苗一、我细胞培养疫苗的推进80年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国、欧洲和加拿大使用，各种疫苗的比率细胞培养疫苗7％羊脑疫苗占64％乳鼠脑疫苗占29％2004年WHO强烈推荐，停止使用脑组织疫苗，至今非洲、南美使用脑组织疫苗。中国1980年代已实现了细胞培养疫苗细胞培养疫苗的推进80年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、原代细胞培养疫苗2、二倍体细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进原代细胞

原代细胞最初来源于供体的正常组织细胞后在体外的首次培养的细胞，在适宜的培养条件下细胞可以基本不改变性状而获得可以连续传代的特性，但不能无限期分裂繁殖，为有限生命，没有肿瘤原性。原代细胞原代细胞最初来源于供体的正常原代细胞的种类和生产的疫苗

鸡胚细胞地鼠肾细胞原代狗肾细胞原代猴肾细胞原代兔肾细胞原代牛肾细胞狂犬病疫苗麻疹疫苗狂犬病疫苗、乙型脑炎、森林脑炎、肾综合征出血热狂犬病疫苗小儿麻痹疫苗风疹疫苗轮状病毒疫苗原代细胞的种类和生产的疫苗鸡胚细胞狂犬病疫苗地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗病毒株：aG株，须使用豚鼠脑毒种肾脏粉碎浓缩纯化制备成疫苗1、病毒株中国自行建立，是国际上最早的细胞疫苗之一。2、经历了淡苗、浓缩苗和目前的纯化疫苗三个阶段。3、病毒株传代过度，免疫原性少差，浓缩倍数高，4、生产用毒种为豚鼠脑，有潜在的脑组织引起的过敏反应,5、灭活剂为甲醛，疫苗中的残留可能引起注射部位疼痛。病毒灭活无菌取肾收获病毒地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗病毒株：肾脏粉碎浓缩纯化1、纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）病毒株：Flury-Lep胚胎粉碎接种方案:每次1ml5次注射原代鸡胚细胞培养，无致肿瘤潜在风险；使用SPF鸡胚，无特定病原体，细胞安全性好；SPF鸡蛋成本高，疫苗价格高；疫苗纯化降低了宿主细胞蛋白，但鸡蛋过敏者仍须慎重使用；病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高。剂量大，每剂量1ml。病毒浓缩纯化SPF鸡胚病毒收获病毒灭活纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）病毒株：胚胎粉碎接种方案:原原代细胞优点：

细胞的生物学形状基本与母体一致，染色体核型和

基因基本没有改变，没有致肿瘤的风险缺点：由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异；

动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性；需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则原代细胞培养的营养条件要求较高不能进行生物反应器现代化大规模培养外源致病微生物污染的风险较大原代细胞优点：二倍体细胞疫苗二倍体细胞具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖；无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。

常见的二倍体细胞：WI-38IMR-90MRC-52BSKMB-17

二倍体细胞代次的计算：

以细胞群体倍增为计算单位，当一瓶细胞长满达到一定数量时，

进行细胞传代使一瓶分种为二瓶，到该二瓶细胞长满分别达到

原来的细胞数量时为一代，如1：4传代即为二代。二倍体细胞疫苗二倍体细胞二倍体细胞疫苗缺点：

不能无限繁殖，培养条件要求高，疫苗生产时病毒产量较低，生产成本较高。目前不能大规模生物反应器培养优点：

为正常二倍体细胞，无肿瘤原性，可建立细胞库无外源因子污染，质量可高度控制，生产纯化时无须考虑细胞DNA

不用大量动物与人抗原性一致，过敏反应小，安全可靠。

二倍体细胞疫苗缺点：人二倍体细胞狂犬病疫苗(HDCV)过滤超率灭活纯化稳定–冻干细胞种子批MRC

5第16

代病毒株PM1503-3M终产品1

ml/剂优点

WHO推荐的狂犬病疫苗金标准

免疫原性高

PET体现的效价高

安全性高缺点

不可能大规模生产

病毒产量低

生产时间长

需要病毒抗原高度浓缩

复杂的时间控制使生产难度加大

价格昂贵人二倍体细胞狂犬病疫苗(HDCV)过滤细胞种子批病毒株终产传代细胞传代细胞称细胞系（XXXcellline)，最初来源与正常组织或肿瘤组织，在原代细胞培养成功的基础上进行传代培养，培养条件合适时可以连续传代，在某一传代过程中改变了原来的形态和性状，可以无限期传代，传代细胞系往往具有致肿瘤性用于疫苗生产和研发的传代细胞VeroBHKCHO等传代细胞传代细胞称细胞系（XXXcellline)，最初来对传代细胞的关注

年代管理机构细胞

1954

AF流行病学委员会猴肾细胞

1967

NIH

考虑使用人二倍体细胞

1978NIH考虑肿瘤细胞（如Namalwa细胞产干扰素）

1984NIH/FDADNA、病毒、转化蛋白等DNA10pg/剂

1986WHO专门研究小组DNA、病毒、转化蛋白等DNA100pg/剂

1996WHOECBSDNA10ng/剂

1999FDANIHWHOIABSDNA风险未能明确

2004

FDANIHWHOIABS表述统一一致

2006

WHO

开始修订WHO细胞基质的规程

对传代细胞的关注年代管理

优点：

传代细胞系，几乎可以取之不竭已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经建立，细胞质量可高度控制，该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；可用生物反应器大规模生产大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖疫苗生产是不要动物

缺点：

由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂）目前不适合活疫苗的生产

传代细胞用于疫苗生产的优缺点优点：传代细胞用于疫苗生产的优缺点

生物反应器大规模细胞悬浮培养生产疫苗细胞库中取种子细胞复苏从方瓶中扩增至转瓶扩增到微载体大罐接种病毒种子

aG株（中国）CTN株（中国）PV株（巴斯德）PM株（巴斯德）多次收获病毒液浓缩，灭活纯化成品疫苗DNA生物反应器大规模细胞悬浮培养生产疫苗细胞库中取种从方瓶中扩

病毒性灭活疫苗

关键点3-1生产工序和/或步骤细胞毒种处理动物，选取所用组织清洗组织，剪碎，用自然沉降法清洗加胰酶消化组织培养液分散成细胞培养液，牛血清，抗生素，调节pH分装转瓶培养预留5％或至少500ml作对照观察14天或至病毒液收获结束毒种检定无菌试验

浸泡洗换清除牛血清抗菌素培养收获病毒液

可多次病毒滴定无菌试验支原体不同灭活剂、灭活方法、程序浓缩灭活膜过滤，截留量大小、倍数灭活验证试验最敏感方法立即取样合并传代细胞扩增接种无牛血清培养液传代细胞工作库细胞复苏转下页病毒性灭活疫苗关键点3-1生产工

病毒性灭活疫苗

关键点3-2生产工序和/或步骤柱层析单柱、多柱区带离心其它方法纯化无菌试验抗原含量测定蛋白量测定牛清蛋白DNA配制人白蛋白防腐剂佐剂半成品成品抗生素

NO冻干液体鉴别试验外观化学pH

防腐剂水份佐剂效力试验热稳定试验无菌试验细菌内毒素或热源异常毒性等无菌试验分装当日分装完毕大罐可二天病毒性灭活疫苗关键点3-2生产工序和/Vero细胞疫苗质量标准：80年代美国FDA→10pg/剂欧盟、WHO→100pg/剂我国卫生部→100pg/剂

90年代后期WHO推荐为→10ng/剂

2000年版《中国生物制品规程》10ng/剂

2005年版《中国生物制品规程》100pg/剂检测灵敏度：1-10pg/ml2004年IABS大会的观点：肿瘤细胞的DNA可以在动物模型或人类引起肿瘤的发生，经多个研究小组的定量风险评并基于各种不同的设定为依据，得出的结论为：

即使生物制品中存在细胞基质DNA的肿瘤风险是非常低的。Vero细胞残余DNA的致瘤性中国药品生物制品检定所Vero细胞疫苗质量标准：80年代Vero美国FDA对Vero细胞用于疫苗研制的建议2002年5月20日发表对以Vero细胞为基质的病毒性疫苗研制者的信。CBER的意见认为Vero细胞作为病毒性疫苗的培养用细胞基质是可以行的/cber/ltr/vero031301.htm.

《LettertoSponsorsUsingVeroCellsasaCellSubstrateforInvestigationalVaccines》

FDA美国FDA对Vero细胞用于疫苗研制的建议2002年5月20美国FDA的CBER对Vero用于疫苗研制的建议Vero细胞生产的产品须无完整的Vero细胞虽然WHO目前已接受注射用传代细胞产品DNA残余量不超过10ng/剂。CBER建议须继续关注产品中Vero细胞残余DNA的量。残余Vero细胞DNA的风险水平应按不同情况不同处理，要考虑疫苗的给药方法，如注射、粘膜或其他途径。

因此CBER建议：

要确定终产品中残余细胞DNA的量和DNA的大小，应该在疫苗终产品中描述每人用剂量中含残余DNA的量。由于使用了各种不同的处理方法（如DNA酶处理）细胞残余DNA的量和大小可进一步下降，要评价已加入的生产工艺或考虑要加入的生产工艺以其减少DNA，应注意由于改变工艺而引起潜在的产品质量的影响（如免疫原性）美国FDA的CBER对Vero用于疫苗研制的建议Vero细胞为何对DNA表示担忧

原因

1、细胞可能含有

1)致肿瘤基因

2)整合在细胞基因中的病毒基因

2、生产疫苗用的细胞基因会带入疫苗终产品中

3、产品中的DNA通过注射进入使用者体内导致的肿瘤病原体感染结果1、感染2、诱发肿瘤

1）肿瘤基因的表达

2）原癌基因的激活

3）肿瘤抑制基因的关闭（失去功能）3、突变基因的插入激活、抑制功能丧失、正负调节功能的破坏为何对DNA表示担忧关于原癌基因任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细胞致癌的风险更大，也是目前关注Vero细胞安全性的焦点。将完整的原癌基因切割，可能使其丧失致癌性。P53基因是位于17p13.1上，P53的突变与许多癌症相关它由393个氨基酸组成，核苷酸大于1200bp。乳腺癌基因(BreastCancerGene,BACA)目前至少发现2个位于17q21，BACA1，基因长度大于100kb

位于13q12.3，BACA2，基因长度大于70kb

白血病人9号染色体上的8.5kb的mRNA是突变基因。子宫颈癌病因95％由人乳头瘤病毒所致，已知E7基因是重要原因，E7基因由300多个核苷酸组成。关于原癌基因任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细细胞培养狂犬病疫苗质量标准

检定项目

质量标准

半成品配制前原液残余牛血清蛋白含量(ng/剂)≤50抗原含量(血凝,ELISA)

Vero细胞DNA残留100Pg/剂地鼠肾鸡胚细胞疫苗不作该项灭活试验脑内注射小鼠20只，观察14天，应全部健存蛋白含量测定≤120ug/剂

成品检定鉴别试验同效力试验，效力试验不合格时，鉴别试验不成立外观因为白色疏松体，复溶后应为澄明液体，无异物化学检定

PH值7.2–8.0水份（w/w）≤3.0%液体疫苗不作该项硫柳汞含量(mg/ml)≤0.10无菌试验应无细菌生长细菌内毒素≤100EU异常毒性试验

小鼠法小鼠应键在,体重增加

豚鼠法豚鼠应键在,体重增加效力实验应≥2.5IU/剂热稳定试验37℃14天后，效力试验应≥2.5IU/剂细胞培养狂犬病疫苗质量标准检定项目内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、原代细胞培养疫苗2、二倍体细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进疫苗的添加剂

人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂，使疫苗的效力稳定，尤其是液体疫苗。

目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法”经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经60℃10小时的专项病毒灭活。经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。人白蛋白:疫苗的添加剂人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂，使疫苗疫苗的添加剂

是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂，纯化过程中已基本去除，质量标准50ng/剂最担心疯牛病（传染性海绵状脑病、TSE）

WHO：人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或

其他制品的研讨会报告（1997.3）

ReportofaWHOConsultationonMedicinalandOtherProductsinRelationtoHumanandAnimalTransmissibleSpongiformEncephalitis

牛血清：疯牛病无血清培养基生产的细胞培养疫苗正在研发中疫苗的添加剂是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂疫苗的添加剂

WHO：牛组织及体液的传染性分类

I类高度感染脑脊髓（眼）

II类中度感染

脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大

肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑

膜、松果体、胎盘）

III类

低感染性

周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、

肺、胰腺

IV类无感染性

骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪

便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵

巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、初

乳、胆汁、骨骼、软骨组织、结缔组、

毛发、皮肤、尿液。疫苗的添加剂WHO：牛组织及体液的传染性分类疫苗的添加剂1、1980年-1996年在英国居住满3个月者

2、1980年-1990年在北欧的军事基地居住满

3个月或在南欧满6个月以上。

3、1980年-目前在法国居住满5年以上

4、自1980年以来接受过输血的人员。

5、自1980年-目前在欧洲居住满5年以上者。

以上人员不能献全血，但可以献血浆，因为白蛋白的制备过程能去掉海绵状脑病的致病因子；而英国、法国人两者均不能。

RevisedpreventivemeasurestoreducethepossibleriskoftransmissionofCreutzfeldt-Jakob(CJD)DiseaseandVariantCreutzfeldt-JakobDiseasebybloodandbloodproduct,FinalFDAguidancedocument,WWW./cber/gdlns/cjdvcjdq&a.htm人白蛋白疯牛病疫苗的添加剂1、1980年-1996年在英国

疫苗的添加剂

明胶：国际上趋势：疫苗中尽可能不用明胶冻干疫苗中冻干保护剂使用明胶：动物源性明胶猪源性明胶牛源性明胶

牛皮源性明胶

牛骨源性明胶

绝不能使用头骨和脊髓骨

产生抗明胶IgE抗体，出现较重且多的过敏反应疫苗的添加剂疫苗的添加剂

抗菌素：

在疫苗的生产阶段，有些抗菌素可使用如卡那酶素、新霉素等，在纯化过程中应尽可能去除。但不能加青酶素和ß-内酰胺类。

国外疫苗生产常用新霉素，而中国均使用卡那霉素、庆大霉素。临床上新霉素常用于外用，而卡那霉素、庆大霉素常用于肌肉和静脉注射。疫苗中使用新霉素引起过敏反应的风险要小于卡那、庆大霉素疫苗的添加剂抗菌素：防腐剂

硫柳汞(无机汞）：常用浓度0.01%，易溶于水。作用：对革兰氏阳性、阴性的球菌、杆菌的抑菌能力均很强。原理：重金属离子与菌体中酶蛋白的巯基（-SH）结合使酶失去活性，硫柳汞对菌体、病毒和血清蛋白的损害很弱。使用范围：目前我国的液体疫苗均添加硫柳汞作为防腐剂。其他防腐剂：氯仿、硝酸汞苯、石炭酸等但疫苗一般不使用。趋势：不使用防腐剂，在完全达到GMP要求的100级条件下生产不应有细

菌生长，只有多人份分装时不能一次用毕的疫苗才加防腐剂。

担忧：可能引起注射局部红肿等不良反应可能对6个月内婴儿产生体内蓄积（脑中）

WHO意见：含硫柳汞疫苗的危险并未得到证实，没有任何理由需要担忧含硫柳汞疫苗的安全性，因此也不必改变现有的免疫接种活动。/vaccine_safety/topics/thiomersal/questions/en/index.html

病毒性灭活疫苗

防腐剂病毒性灭活疫苗内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、二倍体细胞培养疫苗2、原代细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进

HenryWilde，Failuresofpost-exposurerabies

Prophylaxis,Vaccine,2007(25):7605-760972岁泰国老妪,颈部被犬咬伤,伤口处理及时正确,并注射了法国产马抗血清,剩余部分注射三角肌,PVRV0、3、7、14注射，14天时增加PCEC疫苗第20天发病死亡。泰国9岁男孩被犬咬伤鼻子和颈部，伤口处理及时正确并浸润注射法国ERIG，剩余部分注射大腿肌肉；0、3、7、14天三角肌注射印度产PCEC疫苗，30天时发病死亡；泰国7岁男孩，被犬咬伤手臂、腿、躯干和背部，伤口处理及时，将法国产ERIG按40IU/kg以1：1稀释后全部伤口注射，同时肌肉注射Verorab，三天后按皮内法注射疫苗，第20天发病死亡；南非57岁男性，被猫鼬咬伤手指和手腕，伤口及时正确处理，包括次氯酸消毒，HIRG伤口注射，剩余部分三角肌注射，HDCV疫苗免疫，但14天发病出现症状，30天死于狂犬病；菲律宾4岁女孩，被犬咬裂肩部和背部，伤口处理正确及时，法国ERIG1：2稀释注射全部伤口后等待数小时再缝合，Verorab疫苗免疫，第19天出现症状后死亡；南非4岁小男孩被犬咬伤左脸颊，伤口处理后150IU的HRIG浸润注射，按公斤体重计算后所得的免疫球蛋白的剩余部分三角肌注射，法国产HDCV0、3、7、14天肌注，第18天出现症状死亡；6岁菲律宾男孩，犬咬伤上唇，伤口得以正确处理，第二天伤口注射法国Favirab，剩余部分注三角肌，PVRV皮内法0.1ml2个点，第三天和第七天o.5ml全量三角肌注射，25天出现症状，29天死亡；南非19岁强壮军人，猫鼬咬伤手指后立即处理伤口，使用法国HRID1ml伤口注射，按20IU/KG计算的剩余部分三角肌注射，HDCV0、3、7、14天臀部肌肉注射，21天出现症状，28天注射最后一剂疫苗，第30天600ml高效价免疫血清静脉注射，第37天死亡。HenryWilde，Failures

疫苗免疫失败的可能原因

上面报道的病例：进行伤口处理、免疫球蛋白和疫苗的及时正确注射。PEP失败的可能原因：

1、不易观察到的微小穿透性致伤，可能导致伤口没有得到冲洗、消毒和注射免疫球蛋白。

2、病人尚未被诊断出患有免疫功能下降性疾病或使用了免疫抑制性药物而没有报告。

3、手臂、手指和面部等神经组织分布丰富的部位被咬伤。

4、不同个体的白细胞A位点（HumanLeucocyteLocusA）所表现的基因型存在差异，HLA为B7和Dr2者接种狂犬病疫苗后产生抗体即早又高，而Dr3者抗体产生晚而且又低

结论：

这些病例的死亡提示，即使非常严密地作了PEP也可能得不到100％的到保护。疫苗免疫失败的可能原因上面小结我国目前上市的狂犬病疫苗有三种，全部为细胞培养疫苗，分别为原代地鼠肾细胞、原代鸡胚细胞和Vero传代细胞疫苗；三种疫苗的成品标准基本一样，但Vero细胞培养疫苗需要控制和检测细胞DNA；三种疫苗均存在优缺点，只要达到批准的标准，均安全有效，但均在进一步改进；疫苗中的各种添加成分将进一步较少，或尽可能去除；完整的PEP仍有个别病例不能保护。小结我国目前上市的狂犬病疫苗有三种，全部为细胞培养疫苗，分别.

谢谢.谢谢不同细胞基质培养狂犬病疫苗优缺点探讨中国药品生物制品检定所董关木不同细胞基质培养狂犬病疫苗优缺点探讨中国药品生物制品检定所内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、二倍体细胞培养疫苗2、原代细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、原代细胞培养疫苗2、二倍体细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进RabiesvaccinesHistoryFenjeetal原代地鼠肾细胞疫苗Wiktoretal人二倍体细胞培养疫苗Kondoetal鸡胚细胞培养疫苗MontagnonetalVero传代细胞培养疫苗DavidSemple成年羊脑组织疫苗Fuenzalidaetal乳鼠脑组织疫苗Poweletal鸭胚疫苗1885191119551960196419651985RabiesvaccinesHistoryFenjee我国目前人用狂犬病疫苗

一、我国生产的狂犬病疫苗

1、地鼠肾原代细胞纯化疫苗aG株

2、Vero细胞纯化疫苗aG株

3、Vero细胞纯化疫苗CTN株

4、Vero细胞纯化疫苗PM株二、进口疫苗

1、法国Vero细胞纯化疫苗PM株

2、德国鸡胚细胞纯化疫苗Flury-LEP

中国药品生物制品检定所我国目前人用狂犬病疫苗一、我细胞培养疫苗的推进80年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国、欧洲和加拿大使用，各种疫苗的比率细胞培养疫苗7％羊脑疫苗占64％乳鼠脑疫苗占29％2004年WHO强烈推荐，停止使用脑组织疫苗，至今非洲、南美使用脑组织疫苗。中国1980年代已实现了细胞培养疫苗细胞培养疫苗的推进80年代由于细胞培养疫苗价格昂贵，仅在美国内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、原代细胞培养疫苗2、二倍体细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进原代细胞

原代细胞最初来源于供体的正常组织细胞后在体外的首次培养的细胞，在适宜的培养条件下细胞可以基本不改变性状而获得可以连续传代的特性，但不能无限期分裂繁殖，为有限生命，没有肿瘤原性。原代细胞原代细胞最初来源于供体的正常原代细胞的种类和生产的疫苗

鸡胚细胞地鼠肾细胞原代狗肾细胞原代猴肾细胞原代兔肾细胞原代牛肾细胞狂犬病疫苗麻疹疫苗狂犬病疫苗、乙型脑炎、森林脑炎、肾综合征出血热狂犬病疫苗小儿麻痹疫苗风疹疫苗轮状病毒疫苗原代细胞的种类和生产的疫苗鸡胚细胞狂犬病疫苗地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗病毒株：aG株，须使用豚鼠脑毒种肾脏粉碎浓缩纯化制备成疫苗1、病毒株中国自行建立，是国际上最早的细胞疫苗之一。2、经历了淡苗、浓缩苗和目前的纯化疫苗三个阶段。3、病毒株传代过度，免疫原性少差，浓缩倍数高，4、生产用毒种为豚鼠脑，有潜在的脑组织引起的过敏反应,5、灭活剂为甲醛，疫苗中的残留可能引起注射部位疼痛。病毒灭活无菌取肾收获病毒地鼠肾原代细胞培养生产狂犬病疫苗病毒株：肾脏粉碎浓缩纯化1、纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）病毒株：Flury-Lep胚胎粉碎接种方案:每次1ml5次注射原代鸡胚细胞培养，无致肿瘤潜在风险；使用SPF鸡胚，无特定病原体，细胞安全性好；SPF鸡蛋成本高，疫苗价格高；疫苗纯化降低了宿主细胞蛋白，但鸡蛋过敏者仍须慎重使用；病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高。剂量大，每剂量1ml。病毒浓缩纯化SPF鸡胚病毒收获病毒灭活纯化鸡胚细胞疫苗（PCEC）病毒株：胚胎粉碎接种方案:原原代细胞优点：

细胞的生物学形状基本与母体一致，染色体核型和

基因基本没有改变，没有致肿瘤的风险缺点：由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异；

动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性；需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则原代细胞培养的营养条件要求较高不能进行生物反应器现代化大规模培养外源致病微生物污染的风险较大原代细胞优点：二倍体细胞疫苗二倍体细胞具有正常二倍体（2n）染色体的数目，核型正常；在培养条件下，不能无限期的分裂繁殖；无肿瘤原性，保留原体内细胞特性。

常见的二倍体细胞：WI-38IMR-90MRC-52BSKMB-17

二倍体细胞代次的计算：

以细胞群体倍增为计算单位，当一瓶细胞长满达到一定数量时，

进行细胞传代使一瓶分种为二瓶，到该二瓶细胞长满分别达到

原来的细胞数量时为一代，如1：4传代即为二代。二倍体细胞疫苗二倍体细胞二倍体细胞疫苗缺点：

不能无限繁殖，培养条件要求高，疫苗生产时病毒产量较低，生产成本较高。目前不能大规模生物反应器培养优点：

为正常二倍体细胞，无肿瘤原性，可建立细胞库无外源因子污染，质量可高度控制，生产纯化时无须考虑细胞DNA

不用大量动物与人抗原性一致，过敏反应小，安全可靠。

二倍体细胞疫苗缺点：人二倍体细胞狂犬病疫苗(HDCV)过滤超率灭活纯化稳定–冻干细胞种子批MRC

5第16

代病毒株PM1503-3M终产品1

ml/剂优点

WHO推荐的狂犬病疫苗金标准

免疫原性高

PET体现的效价高

安全性高缺点

不可能大规模生产

病毒产量低

生产时间长

需要病毒抗原高度浓缩

复杂的时间控制使生产难度加大

价格昂贵人二倍体细胞狂犬病疫苗(HDCV)过滤细胞种子批病毒株终产传代细胞传代细胞称细胞系（XXXcellline)，最初来源与正常组织或肿瘤组织，在原代细胞培养成功的基础上进行传代培养，培养条件合适时可以连续传代，在某一传代过程中改变了原来的形态和性状，可以无限期传代，传代细胞系往往具有致肿瘤性用于疫苗生产和研发的传代细胞VeroBHKCHO等传代细胞传代细胞称细胞系（XXXcellline)，最初来对传代细胞的关注

年代管理机构细胞

1954

AF流行病学委员会猴肾细胞

1967

NIH

考虑使用人二倍体细胞

1978NIH考虑肿瘤细胞（如Namalwa细胞产干扰素）

1984NIH/FDADNA、病毒、转化蛋白等DNA10pg/剂

1986WHO专门研究小组DNA、病毒、转化蛋白等DNA100pg/剂

1996WHOECBSDNA10ng/剂

1999FDANIHWHOIABSDNA风险未能明确

2004

FDANIHWHOIABS表述统一一致

2006

WHO

开始修订WHO细胞基质的规程

对传代细胞的关注年代管理

优点：

传代细胞系，几乎可以取之不竭已经全面检定，其特性符合人用疫苗的生产，细胞库一经建立，细胞质量可高度控制，该细胞生长条件要求不高，容易培养繁殖；可用生物反应器大规模生产大多数病毒能在该细胞系中复制繁殖疫苗生产是不要动物

缺点：

由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准（10ng/剂）目前不适合活疫苗的生产

传代细胞用于疫苗生产的优缺点优点：传代细胞用于疫苗生产的优缺点

生物反应器大规模细胞悬浮培养生产疫苗细胞库中取种子细胞复苏从方瓶中扩增至转瓶扩增到微载体大罐接种病毒种子

aG株（中国）CTN株（中国）PV株（巴斯德）PM株（巴斯德）多次收获病毒液浓缩，灭活纯化成品疫苗DNA生物反应器大规模细胞悬浮培养生产疫苗细胞库中取种从方瓶中扩

病毒性灭活疫苗

关键点3-1生产工序和/或步骤细胞毒种处理动物，选取所用组织清洗组织，剪碎，用自然沉降法清洗加胰酶消化组织培养液分散成细胞培养液，牛血清，抗生素，调节pH分装转瓶培养预留5％或至少500ml作对照观察14天或至病毒液收获结束毒种检定无菌试验

浸泡洗换清除牛血清抗菌素培养收获病毒液

可多次病毒滴定无菌试验支原体不同灭活剂、灭活方法、程序浓缩灭活膜过滤，截留量大小、倍数灭活验证试验最敏感方法立即取样合并传代细胞扩增接种无牛血清培养液传代细胞工作库细胞复苏转下页病毒性灭活疫苗关键点3-1生产工

病毒性灭活疫苗

关键点3-2生产工序和/或步骤柱层析单柱、多柱区带离心其它方法纯化无菌试验抗原含量测定蛋白量测定牛清蛋白DNA配制人白蛋白防腐剂佐剂半成品成品抗生素

NO冻干液体鉴别试验外观化学pH

防腐剂水份佐剂效力试验热稳定试验无菌试验细菌内毒素或热源异常毒性等无菌试验分装当日分装完毕大罐可二天病毒性灭活疫苗关键点3-2生产工序和/Vero细胞疫苗质量标准：80年代美国FDA→10pg/剂欧盟、WHO→100pg/剂我国卫生部→100pg/剂

90年代后期WHO推荐为→10ng/剂

2000年版《中国生物制品规程》10ng/剂

2005年版《中国生物制品规程》100pg/剂检测灵敏度：1-10pg/ml2004年IABS大会的观点：肿瘤细胞的DNA可以在动物模型或人类引起肿瘤的发生，经多个研究小组的定量风险评并基于各种不同的设定为依据，得出的结论为：

即使生物制品中存在细胞基质DNA的肿瘤风险是非常低的。Vero细胞残余DNA的致瘤性中国药品生物制品检定所Vero细胞疫苗质量标准：80年代Vero美国FDA对Vero细胞用于疫苗研制的建议2002年5月20日发表对以Vero细胞为基质的病毒性疫苗研制者的信。CBER的意见认为Vero细胞作为病毒性疫苗的培养用细胞基质是可以行的/cber/ltr/vero031301.htm.

《LettertoSponsorsUsingVeroCellsasaCellSubstrateforInvestigationalVaccines》

FDA美国FDA对Vero细胞用于疫苗研制的建议2002年5月20美国FDA的CBER对Vero用于疫苗研制的建议Vero细胞生产的产品须无完整的Vero细胞虽然WHO目前已接受注射用传代细胞产品DNA残余量不超过10ng/剂。CBER建议须继续关注产品中Vero细胞残余DNA的量。残余Vero细胞DNA的风险水平应按不同情况不同处理，要考虑疫苗的给药方法，如注射、粘膜或其他途径。

因此CBER建议：

要确定终产品中残余细胞DNA的量和DNA的大小，应该在疫苗终产品中描述每人用剂量中含残余DNA的量。由于使用了各种不同的处理方法（如DNA酶处理）细胞残余DNA的量和大小可进一步下降，要评价已加入的生产工艺或考虑要加入的生产工艺以其减少DNA，应注意由于改变工艺而引起潜在的产品质量的影响（如免疫原性）美国FDA的CBER对Vero用于疫苗研制的建议Vero细胞为何对DNA表示担忧

原因

1、细胞可能含有

1)致肿瘤基因

2)整合在细胞基因中的病毒基因

2、生产疫苗用的细胞基因会带入疫苗终产品中

3、产品中的DNA通过注射进入使用者体内导致的肿瘤病原体感染结果1、感染2、诱发肿瘤

1）肿瘤基因的表达

2）原癌基因的激活

3）肿瘤抑制基因的关闭（失去功能）3、突变基因的插入激活、抑制功能丧失、正负调节功能的破坏为何对DNA表示担忧关于原癌基因任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细胞致癌的风险更大，也是目前关注Vero细胞安全性的焦点。将完整的原癌基因切割，可能使其丧失致癌性。P53基因是位于17p13.1上，P53的突变与许多癌症相关它由393个氨基酸组成，核苷酸大于1200bp。乳腺癌基因(BreastCancerGene,BACA)目前至少发现2个位于17q21，BACA1，基因长度大于100kb

位于13q12.3，BACA2，基因长度大于70kb

白血病人9号染色体上的8.5kb的mRNA是突变基因。子宫颈癌病因95％由人乳头瘤病毒所致，已知E7基因是重要原因，E7基因由300多个核苷酸组成。关于原癌基因任何哺乳动物均存在原癌基因，尤其是染色体变异的细细胞培养狂犬病疫苗质量标准

检定项目

质量标准

半成品配制前原液残余牛血清蛋白含量(ng/剂)≤50抗原含量(血凝,ELISA)

Vero细胞DNA残留100Pg/剂地鼠肾鸡胚细胞疫苗不作该项灭活试验脑内注射小鼠20只，观察14天，应全部健存蛋白含量测定≤120ug/剂

成品检定鉴别试验同效力试验，效力试验不合格时，鉴别试验不成立外观因为白色疏松体，复溶后应为澄明液体，无异物化学检定

PH值7.2–8.0水份（w/w）≤3.0%液体疫苗不作该项硫柳汞含量(mg/ml)≤0.10无菌试验应无细菌生长细菌内毒素≤100EU异常毒性试验

小鼠法小鼠应键在,体重增加

豚鼠法豚鼠应键在,体重增加效力实验应≥2.5IU/剂热稳定试验37℃14天后，效力试验应≥2.5IU/剂细胞培养狂犬病疫苗质量标准检定项目内容

一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进二、目前三种类型的细胞培养疫苗1、原代细胞培养疫苗2、二倍体细胞培养疫苗3、传代细胞培养疫苗三、疫苗中不同成分和添加剂应关注的问题

1、人白蛋白2、抗生素3、明胶4、牛血清5、防腐剂四、暴露后处理的失败案例内容一、狂犬病疫苗的历史和细胞培养疫苗的推进疫苗的添加剂

人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂，使疫苗的效力稳定，尤其是液体疫苗。

目前人白蛋白的生产工艺为“低温乙醇法”经不同浓度的乙醇反复沉淀所得，最终产品还须经60℃10小时的专项病毒灭活。经验证该产品有可靠的安全性，国内外至今尚无使用该产品而感染HIV、HBV、HCV等报道。人白蛋白:疫苗的添加剂人白蛋白是大多数疫苗中添加的保护剂，使疫苗疫苗的添加剂

是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂，纯化过程中已基本去除，质量标准50ng/剂最担心疯牛病（传染性海绵状脑病、TSE）

WHO：人及动物传染性海绵状脑病相关的医用或

其他制品的研讨会报告（1997.3）

ReportofaWHOConsultationonMedicinalandOtherProductsinRelationtoHumanandAnimalTransmissibleSpongiformEncephalitis

牛血清：疯牛病无血清培养基生产的细胞培养疫苗正在研发中疫苗的添加剂是细胞培养疫苗在细胞培养过程中必须的添加剂疫苗的添加剂

WHO：牛组织及体液的传染性分类

I类高度感染脑脊髓（眼）

II类中度感染

脾脏、扁逃体、淋巴结、回肠、近端大

肠、脑脊液、脑垂体、肾上腺、（硬脑

膜、松果体、胎盘）

III类

低感染性

周围神经、鼻黏膜、胸腺、骨髓、肝、

肺、胰腺

IV类无感染性

骨骼肌、心脏、乳腺、牛奶、血清、粪

便、肾脏、甲状腺、唾液腺、唾液、卵

巢、子宫、睾丸、附睾、胎儿组织、初

乳、胆汁、骨骼、软骨组织、结缔组、

毛发、皮肤、尿液。疫苗的添加剂WHO：牛组织及体液的传染性分类疫苗的添加剂1、1980年-1996年在英国居住满3个月者

2、1980年-1990年在北欧的军事基地居住满

3个月或在南欧满6个月以上。

3、1980年-目前在法国居住满5年以上

4、自1980年以来接受过输血的人员。

5、自1980年-目前在欧洲居住满5年以上者。

以上人员不能献全血，但可以献血浆，因为白蛋白的制备过程能去掉海绵状脑病的致病因子；而英国、法国人两者均不能。

RevisedpreventivemeasurestoreducethepossibleriskoftransmissionofCreutzfeldt-Jakob(CJD)DiseaseandVariantCreutzfeldt-JakobDiseasebybloodandbloodproduct,FinalFDAguidancedocument,WWW./cber/gdlns/cjdvcjdq&a.htm人白蛋白疯牛病疫苗的添加剂1、1980年-1996年在英国

疫苗的添加剂

明胶：国际上趋势：疫苗中尽可能不用明胶冻干疫苗中冻干保护剂使用明胶：动物源性明胶猪源性明胶牛源性明胶

牛皮源性明胶

牛骨源性明胶

绝不能使用头骨和脊髓骨

产生抗明胶IgE抗体，出现较重且多的过敏反应疫苗的添加剂疫苗的添加剂

抗菌素：

在疫苗的生产阶段，有些抗菌素可使用如卡那酶素、新霉素等，在纯化过程中应尽可能去除。但不能加青酶素和ß-内酰胺类。

国外疫苗生产常用新霉素，而中国均使用卡那霉素、庆大霉素。临床上新霉素常用于外用，而卡那霉素、庆大霉素常用于肌肉和静脉注射。疫苗中使用新霉素引起过敏反应的风险要小于卡那、庆大霉素疫苗的添加剂抗菌素：防腐剂