细胞传代课件

实验总体安排一.细胞培养的基本技术实验前准备细胞传代细胞冻存与复苏细胞计数与接种孔板二.专题1.MTT实验2.细胞凋亡：JC-1检测线粒体膜电位3.免疫荧光技术：核蛋白（PCNA)的免疫荧光4.流式细胞仪的应用：细胞周期的检测5.电镜实验内容1.介绍实验准备2.细胞传代3.细胞冻存

目前多数的实验室还达不到用后即弃的条件，常要反复使用一些器皿，在组织细胞培养中器材的清洗、消毒灭菌仍是重要环节，而且工作量很大,是一项繁重而艰苦的工作,其主要目的是去除器皿上杂质及其对细胞生长有影响的物质及各种微生物。玻璃器皿的处理玻璃器皿用于培养细胞、细胞冻存、培养用液的存放等。提供细胞生长的玻璃表面不但要清洁干净，而且要带适当电荷。苛性碱清洗剂会使玻璃表面带的电荷不适于细胞附着，需以HCL或H2SO4中和。清洗玻璃器皿不仅要求干净透明、无油迹，且不能残留任何毒性物质。为了保证清洗的质量，一般玻璃器皿的处理分为六个步骤：浸泡、刷洗、浸酸、冲洗、包装、消毒灭菌。

浸泡：新的玻璃器皿首先用清水浸泡及简单刷洗以便去除玻璃器皿表面的灰尘和软化溶解附着物，新购的玻璃器皿表面常呈碱性，并带有许多干涸的灰尘和一些对细胞有毒的物质（如铅，砷等）。然后用5％稀盐酸溶液中浸泡过夜，中和其中的碱性物质。使用过的玻璃器皿常常附有大量的蛋白质，干涸后难以刷洗掉，因此用后就要立即浸入清水中，浸泡时应将器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。对已用过且有污染的器皿必须先消毒。刷洗：一般多用软毛刷和洗涤剂或洗衣粉进行洗涤，以去除器皿内外表面的杂质。浸酸：酸就是清洁液，由浓硫酸、重铬酸钾及蒸馏水桉一定比例配制而成。具有很强的氧化作用，去污能力很强，对玻璃器皿无腐蚀作用。经清洁液浸泡后，玻璃器皿残留的未刷洗掉的微量杂质可被完全清除。刷洗后的玻璃器皿需干燥后才能浸入酸中，浸泡的时间不应少于6小时，一般浸泡过夜。清洁液的配制和使用注意事项①选用耐酸塑料桶或不锈钢桶配制为宜。②先将重铬酸钾溶于水（用玻璃棒搅拌助溶，有时不能完全溶解）。③缓缓加入浓硫酸，切忌过急，否则将产热而发生危险(绝不可将重铬酸钾液倒入浓硫酸中)。④清洁液配好呈棕红色，待变绿色时表明失效。由于清洁液的腐蚀性极强，配制与应用时必须小心，并做好防护。包装：包装的目的是防止消毒灭菌后再次受到污染，所以经清洗烤干的器材应严格包装后再进行消毒灭菌处理。包装的材料常用包装纸，牛皮纸，棉布，铝饭盒，玻璃或金属吸管筒等。包装分为局部包装和全部包装。局部包装用于较大瓶皿，一般用牛皮纸将瓶口包扎好；而全部包装适用较小培养甁皿，吸管，注射器，金属器械和胶塞。（二）塑料器皿的处理组织培养常用的塑料器皿包括各种培养板、培养皿及培养瓶等。这些产品主要为进口的一次性物品，供应商提供给用户时已消毒灭菌并密封包装，打开包装即可使用。一些不是无菌包装的塑料器皿，如枪头、离心管等，只要包装消毒就可以使用了。如果要重复使用塑料器皿，可以按以下步骤处理:自来水充分浸泡→冲洗→2%Na0H浸泡过夜→自来水冲洗→2%~5%盐酸浸泡30min→自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干→紫外线照射30min(或先用75%酒精浸泡、擦拭，再用紫外线照射30min)。凡能耐热的塑料器皿，最好经101.3kPa高压灭菌。（三）胶塞等橡胶类处理新购置者先经自来水冲洗→2%NaOH煮沸15min→自来水冲洗→2%~5%HCl煮沸15min→自来水冲洗5次以上→蒸馏水冲洗5次以上→蒸馏水煮沸10min，然后烘干

包装消毒。（四）金属器械的清洗新购进的金属器械常涂有防锈油，先用沾有汽油的纱布擦去油脂，再用水洗净，最后用酒精棉球擦拭，晾干。用过的金属器械应先以清水煮沸消毒，再擦拭干净。使用前包装好以101.3kPa高压15min。细胞传代

体外培养细胞分型离体培养细胞大多生长在甁皿等容器中，根据是否能贴附在支持物上生长，分为贴附型和悬浮型。细胞在体内、外的粘附方式：存在差异

体内：粘附是全方位,外形具有复杂的立体特征

体外：多数情况，细胞只有一个附着平面；外形一般与体内时明显不同按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型

2、上皮型细胞：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。3、游走细胞型：

呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。4、多型细胞型：

有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。

悬浮型：见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。体内细胞生长在动态平衡环境中，组织培养细胞的生存环境是甁皿等容器，生存空间和营养是有限的，当细胞增殖达到一定密度后，需要分离出一部分细胞和更新营养液，这一过程称传代（passage或subculture)。传代的频率与接种细胞数量、细胞生物特性以及营养液的性质等有关。细胞“一代”仅指从细胞接种到分离再培养的一段时间，它与细胞世代或倍增不同。在细胞的一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过三个阶段：1游离期：即细胞接种后在培养液中呈悬浮状态的阶段，也称悬浮期2.指数增长期：是细胞增殖旺盛的阶段，细胞分裂相多。3.停止期：细胞数量已达饱和密度，细胞停止增殖，也称平顶期。培养细胞传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞可直接吹打传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。细胞冻存和复苏

细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。细胞低温冷冻储存是培养室常规工作和通用技术。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。常用的低温保护剂是二甲基亚砜(DMSO)，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。冻存程序：1.标准的：降温速率-1～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。2.常规的：将装有细胞的冻存管放入4℃冰箱30min,-20℃冰箱30min，然后放入-70℃冰箱中过夜，最后移入液氮中。操作步骤选择生长良好的A549细胞一瓶，轻轻摇动培养瓶数次，悬浮起附着在细胞表面的碎片，然后连同培养液倒出。加入3mlD-Hanks轻轻晃动后去液体。加入胰蛋白酶5滴，翻转培养瓶，使消化液浸没细胞。(一般消化时间为1到5分钟，镜下观察发现细胞质回缩，胞体变圆)加入3mlD-Hanks液，轻轻吹打细胞生长面，使细胞脱离瓶壁后形成细胞悬液。吹打时动作要轻柔不要用力过猛。将细胞悬液移至15ml离心管中，1500rpm*5min离心。去上清，加入新鲜的完全培养液2ml轻轻吹打成悬液。吸取1ml细胞悬液到原来的培养瓶中，加入3ml新鲜的完全培养液，置培养箱中继续培养。在剩下的1ml细胞悬液加入100ul的DMSO，轻轻混匀后将细胞悬液移至冻存管中冻存。操作流程选择生长良好的A549细胞一瓶，去旧培养液，加入D-Hanks3ml洗一次，去液体。加入5滴胰蛋白酶消化1～5分钟（镜下观察掌握），加入3mlD-Hanks液制成细胞悬液将细胞悬液移入15ml离心管中离心（1000rpm5min)去上清液，加入新鲜的培养液2ml重悬细胞将1ml的细胞悬液加入原来的培养瓶中，再加入3ml的新鲜培养液，放入培养箱继续培养

在剩余的1ml细胞悬液中加入100ul的DMSO,混匀后转入冻存管中冻存（4℃30min-20℃30min-70℃过夜移入液氮内）细胞传代的注意事项

1.严格的无菌操作。2.胰蛋白酶要预温，温度37℃左右为宜℃。3.适度消化：消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。4.离心转速要合适，转速过低，不能有效分离细胞，离心速度过大，时间过长，会挤压细胞造成损伤甚至死亡。胰蛋白酶：主要作用是使细胞间的蛋白质水解，使细胞离散。它在Ph8.0温度37℃时，作用能力最强。使用浓度一般0.25%。