病生课程调亡标准课件

apoptosis研究历史定义★与坏死的区别★生理意义概述概述apoptosis研究历史概述概述12

1842年Vogt在研究蝌蚪发育时，发现一种不同于细胞坏死的细胞死亡现象。1885年Flemming在研究卵巢滤泡时再一次发现了有不同于细胞坏死的细胞死亡现象，并指出这种细胞死亡是生物体生理机能的一部分。1887年Flemming将自己的发现的这种细胞死亡命名为染色质溶解死亡，并对死亡现象做了精彩的形态描述。1887年德国的科学家Graper在一篇关于线粒体论文中再次提到Flemming的发现。§1.概述

一、细胞凋亡的研究历史

21842年Vogt在研究蝌蚪发育时，发现一种不同于3

1965年发育生物学家Lockshin在研究蛾发育过程中首次提出程序化死亡（programmedcelldeath）概念。

1972年

Kerr首次提出细胞凋亡（apoptosis）的概念。

1973年

首次在细胞凋亡中发现DNA的降解。

1973～1987形态学描述和生物化学研究阶段。--至今细胞凋亡进入分子阶段的研究，在此间发现细胞凋亡的相关的调控基因；发现细胞凋亡的抑制剂；认识线粒体在凋亡中的重要作用；发现细胞凋亡的诱导因子；尤其近几年细胞凋亡进入临床应用阶段。§1.概述

31965年发育生物学家Lockshin在研究蛾发育过4

SydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAb.1927

(inUnionofSouthAfrica)H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USAb.1947JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdomb.1942

THE2002NOBELPRIZEWINNER4

5§1.概述二、细胞凋亡的概念

细胞凋亡（Apoptosis）——在一些体内外因素诱导下，细胞内的死亡程序被激活，而引发的有序的细胞死亡。又称为程序性细胞死亡（programmedcelldeath）；凋亡有其独特的形态学和生物化学改变。

1972年英国Aberdeen大学病理系Kerr教授和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的散在细胞死亡方式，联想到秋日落叶特征，命名为“apoptosis”。5§1.概述197三、凋亡与坏死的区别特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。§1.概述三、凋亡与坏死的区别特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释67细胞坏死细胞凋亡性质病理性，非特异性生理性或病理性，特异性诱导因素强烈刺激，随机、成片发生较弱刺激，非随机、散在发生形态变化

细胞肿胀、胞浆、核染色质等结构全面破坏、崩解

细胞皱缩、核固缩，染色质边集，胞膜和细胞器相对完整凋亡小体

无

由膜包绕分割细胞形成炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应细胞内含物不外溢，无局部炎症反应生化特点

被动过程，无新蛋白合成，不耗能

主动过程，有新蛋白合成，耗能，内源性核酸内切酶活化DNA电泳弥散性降解，片段长短不一核酸内切酶水解DNA呈片段化（180-200bp倍数片段），呈梯形电泳带基因调控

无有凋亡相关基因参与凋亡与坏死的差异比较7细胞坏死细胞凋亡性质病理性，非特异性生理性或病理性，特异四、细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能

所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。概述四、细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长概述8病生课程调亡标准课件9病生课程调亡标准课件10细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能

所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。apoptosis概述细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长apoptosis概11apoptosis生化改变凋亡过程与调控凋亡时细胞的主要变化形态学改变apoptosis生化改变凋亡过程与调控凋亡时细胞的主要变化1213一、细胞凋亡的主要特征

（一）形态学改变

1.细胞固缩（condensation,shrinkage）

细胞表面微绒毛消失，与周围细胞脱离；胞质浓缩，胞膜空泡化，细胞体积缩小、出现固缩；13一、细胞凋亡的主要特征14

2.核边集（margination）：核染色质高度浓缩，融合成团并向核膜下聚集，呈新月形或环形分布，也可呈马蹄、镰刀等形状排列；或向中心集中（即中聚形成黑洞样）。新月状八字形花瓣状环状球状黑洞样142.核边集（margination）：新月状15TransmissionalElectronMicroscopy对照凋亡凋亡

坏死15TransmissionalElectronMicr16

3.出芽（budding）及形成凋亡小体（apoptoticbody）：骨架与胞浆膜脱耦联，包膜向外不规则膨出，包裹线粒体等细胞器、空泡化的胞浆及裂解的高浓度核物质，最终脱落形成多个外有膜包裹、内有不能外溢内涵物的凋亡小体，其大小不一，圆形或椭圆型或不规则型。163.出芽（budding）及形成凋亡小体（apop释放GF（PDGF、FGF、TGF-β、EGF）肿瘤细胞分泌FasL─→淋巴细胞凋亡─→肿瘤细2、干预凋亡信号转导来调控凋亡，治疗疾病而Bcl-Xs（促凋亡）。发育异常先天性消化道、胆道、肛门狭CNSAlsheimer病、Parkinson病、DNA严重受损后，P53大量表达，诱导细胞凋亡（二）生化改变Bcl-X基因可翻译出2种蛋白二、自身免疫性疾病特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活性单核C粘附、移行内膜下内皮下胶原暴露MassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USACaspase如何杀死细胞？子）相互作用─→激活Caspases9─→激活Caspases巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞5）细胞因子受感染的Mφ释放TNF增多又称为程序性细胞死亡（programmedcelldeath）；细胞表面微绒毛消失，与周围细胞脱离；Caspase12─→内质网应激途径的凋亡②轻度缺血以细胞凋亡为主，重度以坏死为主；17

4.识别并被吞噬清除：

专职吞噬细胞（如单核巨噬细胞）或邻近固有的组织细胞（如上皮细胞、内皮细胞、肿瘤细胞）或自然脱落离开生物体，不伴有局部炎症反应。释放GF（PDGF、FGF、TGF-β、EGF）17418细胞凋亡的形态学改变18细胞凋亡的形态学改变191920

（二）生化改变

1.DNA片段化：凋亡诱因—→激活凋亡蛋白酶（Caspase）—→激活内源性核酸内切酶

—→裂解DNA，形成180-200bp整数倍的寡核苷酸片段—→电泳呈梯形条带（ladderpattern)。20（二）生化改变21

（二）生化改变

DNA

Ladderfrom21（二）生化改变DNALadderfr22

（二）生化改变

2.内源性核酸内切酶

Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶，Zn2+抑制其活性。

正常细胞中，CAD

（Caspase激活的DNA酶）与ICAD（Caspase激活的DNA酶抑制物）结合而无活性。

Caspase裂解ICAD使CAD游离而活化─→分解DNA使其片段化。22（二）生化改变正常细胞中，CAD（Cas23

（二）生化改变

3.凋亡蛋白酶（Caspase蛋白家族）（Cysteine-containingaspartate-specificproteinase）结构含半胱氨酸，可在天冬氨酸（Asp）残基后切断肽链的蛋白酶家族，其相应基因用CASP

表示。

1、酶原结构（Procaspase)：含N末端结构域、20Kd大亚基和10Kd小亚基。23（二）生化改变242、酶原活化：

Caspase酶原

水解

N-端前肽亚基之间切断

大、小亚基分离组成活性四聚体242、酶原活化：25

3、Caspase的分类：（1）凋亡启动酶：Caspase2、8、9、10

前体部分含与其它接头蛋白结合的特异区，分别与凋亡启动酶、死亡受体的死亡区结合。

253、Caspase的分类：26死亡诱导信号复合物26死亡诱导信号复合物膀胱癌34280软组织肉瘤31不确定感染HIV的CD4＋细胞逐步融合成合胞体或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后即可发生凋亡解体。㈣控制凋亡相关酶学机制②轻度缺血以细胞凋亡为主，重度以坏死为主；1887年Flemming将自己的发现的这种细胞死亡命名为染色质溶解死亡，并对死亡现象做了精彩的形态描述。氧自由、神经元内钙增多、β－淀粉样蛋白增多Bax亚家族：Bax、Bak、Bok等（促进凋亡）；6）tat蛋白：诱导CD4+淋巴细胞产生OFR，增强动脉粥样硬化（artherosclerosis）、1965年发育生物学家Lockshin在研究蛾发育过程中首次提出程序化死亡（programmedcelldeath）概念。较弱刺激，非随机、散在发生性畸形、甲状舌骨囊肿等视网膜病，脊肌肉萎缩、早老诱导下，细胞内的死亡程序被激活，而引发的有序阿尔茨海默病（AlzheimerdiseaseAD）线粒体膜通透性转换（permeabilitytransitionpore,PTP）：一、AnnexinV-FITC结合膜表PS实验AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；病毒感染宿主细胞后有两种结局：②损伤膜结构─→脂质过氧化反应；认识线粒体在凋亡中的重要作用；27

3、Caspase的分类：（2）凋亡效应酶：Caspase3，6，7

前体部分小不含蛋白结合区，分解细胞蛋白（凋亡执行器）。

（3）ICE（IL-1βconvertingenzyme）亚类Caspase蛋白酶：Caspase1、4、5、11、12、13、14。参与凋亡但不起主要作用膀胱癌3428

4.功能

凋亡信号激活Caspase酶原级联反应，是细胞凋亡的共同通路。

FasL与靶细胞Fas受体结合─→激活Caspase8酶原─→Caspase3,6,7─→级联放大。不同Caspase介导不同的凋亡信号通路：

Caspase8─→死亡受体相关的凋亡；

Caspase9─→细胞毒因子诱导的凋亡；

Caspase12─→内质网应激途径的凋亡284.功能凋亡相关基因激活DNase激活、Caspases激活巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞悉尼·布雷诺尔罗伯特·霍维茨约翰·苏尔斯顿2002年诺贝尔生理与医学奖获得者►细胞凋亡大致过程(Theprocessofapoptosis)+cAMP、Ca2+、神经酰胺死亡信号凋亡诱导因素受体凋亡信号转导

凋亡基因激活

凋亡的执行

凋亡细胞清除

细胞凋亡的过程与调控凋亡相关基因激活DNase激活、Caspases激活巨噬细胞29细胞凋亡的过程细胞凋亡的过程30apoptosis凋亡过程与调控受体cAMPCa2+神经酰胺凋亡相关基因激活信号转导细胞膜细胞核凋亡诱导因素+Dnase激活Caspases激活死亡信号apoptosis凋亡过程与调控受体cAMP凋亡相关基因激活31apoptosis凋亡过程与调控DNase激活Caspases激活凋亡细胞的清除凋亡执行apoptosis凋亡过程与调控DNase激活Caspase3233

一、细胞凋亡相关因素

（一）诱导性因素：

1.理化因素：射线、缺血缺氧、抗癌药；

2.生物因素：细菌及病毒；

3.激素和生长因子水平失衡；

4.免疫因素：一些免疫分子诱导靶细胞凋亡。（二）抑制性因素:1.某些细胞因子(IL-2、神经生长因子)；

2.某些激素（ACTH、睾丸酮、雌激素）；

3.其他：Zn2+、病毒（EB）、苯巴比妥等。33一、细胞凋亡相关因素二、细胞凋亡的信号转导多途性：同一凋亡诱导因素可通过多条信号转导途径触发凋亡。多样性：不同种类的细胞有不同的信号转导系统偶联性：死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程中的信号转导系统在某些环节上有交叉、偶联。

同一性：不同的凋亡诱导因素可通过同一信号转导途径触发凋亡。凋亡诱导因素凋亡信号转导死亡程序激活apoptosis特点：二、细胞凋亡的信号转导多途性：同一凋亡诱导因素可通过多条信号3435

二、细胞凋亡的信号转导

可分为：①死亡因子及其受体介导的凋亡；②线粒体损伤启动的细胞凋亡。(一)死亡因子及其受体介导的细胞凋亡

1.死亡因子及其受体

死亡因子（deathfactor）：TNF、FasL、TNF-相关凋亡诱导性配体。

死亡受体（deathreceptor,DR）：Fas、TNFR

为跨膜蛋白，胞外C端是配体结合区，胞浆N端含死亡结构域（deathdomain,DD）。35二、细胞凋亡的信号转导362.

信号转导死亡因子（TNF、FasL

）与受体结合

受体三聚体与接头蛋白结合激活Caspase8引发级联反应细胞凋亡362.信号转导膀胱癌34280软组织肉瘤31不确定㈠合理利用凋亡相关因素一、AnnexinV-FITC结合膜表PS实验生理性或病理性，特异性细胞色素C(CytC)与Apaf（凋亡蛋白酶激活因（3）减少内质网Ca2+释放，限制核内[Ca2+]持续↑；AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；正常细胞中，CAD（Caspase激活的DNA酶）与ICAD（Caspase激活的DNA酶抑制物）结合而无活性。风湿性关节炎、桥本甲状腺炎免疫系统免疫缺陷病、AIDS（2）与凋亡促进蛋白Bax形成异二聚体，抑制Bax的促凋亡作用；与CD4＋淋巴细胞表面的受体结合，触发凋亡Bcl-2亚家族：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等（抑制）；cAMP、Ca2+、神经酰胺（2）凋亡效应酶：Caspase3，6，7前体部分小不含蛋白结合区，分解细胞蛋白（凋亡执行器）。窄或闭锁、动脉导管未闭、两肌萎缩性侧索硬化症、色素性（二）生化改变（一）诱导性因素：MassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USA、CytC、Apaf─→凋亡。胞内信号途径膀胱癌3437病生课程调亡标准课件3839(二)线粒体损伤启动的细胞凋亡

1.线粒体膜通透性转换（permeabilitytransitionpore,PTP）：凋亡因子─→线粒体跨膜电位↓、电子传递脱耦联─→PTP开放─→膜通透性↑，线粒体释出AIF、CytC、Apaf─→凋亡。

AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；

细胞色素C(CytC)与Apaf（凋亡蛋白酶激活因子）相互作用─→激活Caspases9─→激活Caspases3，6。39(二)线粒体损伤启动的细胞凋亡40

2.活性氧及胞内Ca2+改变：线粒体损伤─→氧化应激─→胞内活性氧↑及[Ca2+]i↑─→①损伤DNA由野生型p53基因介导凋亡；②损伤膜结构─→脂质过氧化反应；③ATP↓使钙泵失灵促进[Ca2+]i↑─→激活核酸内切酶或蛋白激酶C(PKC)等途径，介导凋亡。402.活性氧及胞内Ca2+改变：病生课程调亡标准课件41病生课程调亡标准课件4243

三、凋亡相关基因

凋亡相关基因指可诱导或阻止细胞凋亡的基因。抑制凋亡基因：Bcl-2（属于Bcl-2家族）；促进凋亡基因：Bax，Bid，P53；对凋亡双向调控基因：C-myc，Bclx。43三、凋亡相关基因44

（一）B细胞淋巴瘤/白血病-2家族（Bcelllymphoma/leukemia-2，Bcl-2家族）含1个或多个BH（homologousdomain）结构域：

1.Bcl-2亚家族：Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等（抑制）；

2.Bax亚家族：Bax、Bak、Bok等（促进凋亡）；

3.BH3亚家族：Bad、Bid、Bik、Hrk等（促进）。存在：造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、癌细胞等。定位：细胞膜、线粒体膜和内质网膜。44（一）B细胞淋巴瘤/白血病-2家族45

Bcl-2抑制凋亡的作用机制：（1）调节PTP活性─→降低线粒体膜通透性，阻止Cyt-C释放，可与Apaf-1直接结合而阻止Caspase-9的激活；（2）与凋亡促进蛋白Bax形成异二聚体，抑制Bax的促凋亡作用；（3）减少内质网Ca2+释放，限制核内[Ca2+]持续↑；（4）抑制Caspase的活化。45Bcl-2抑制凋亡的作用机制：46（二）野生型P53基因（“分子警察”）野生型P53基因：

表达产物P53蛋白是DNA结合蛋白，G1期负责监测DNA损伤并启动修复机制，维持细胞基因的完整性。若不能修复，则促进细胞凋亡而减少带有缺损或突变基因的继续存活，被誉为“基因警卫”。突变型p53基因：

编码的p53蛋白对细胞凋亡有抑制作用。

46（二）野生型P53基因（“分子警察”）THE2002NOBELPRIZEWINNERDNase激活、Caspases激活生理性或病理性，特异性Caspase如何杀死细胞？线粒体膜通透性转换（permeabilitytransitionpore,PTP）：3.细胞凋亡是一个程序化过程，可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治疗疾病AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；血管平滑肌细胞增殖↑↑、凋亡↑（为存在：造血细胞、上皮细胞、淋巴细胞、癌细胞等。②损伤膜结构─→脂质过氧化反应；为跨膜蛋白，胞外C端是配体结合区，胞浆N端含死亡结构域（deathdomain,DD）。巨噬细胞分泌TNF，与TNF受体（死亡受体）结合，启动凋亡，或产生氧自由基06%，增殖占优势）。与CD4＋淋巴细胞表面的受体结合，触发凋亡、CytC、Apaf─→凋亡。专职吞噬细胞（如单核巨噬细胞）或邻近固有的组织细胞（如上皮细胞、内皮细胞、肿瘤细胞）或自然脱落离开生物体，不伴有局部炎症反应。单核C粘附、移行内膜下内皮下胶原暴露THE2002NOBELPRIZEWINNER47DNA严重受损后，P53大量表达，诱导细胞凋亡Bax、Fas、Apaf-1、DR5、……THE2002NOBELPRIZEWINNER47D表人类肿瘤p53基因突变热点和频率肿瘤型突变频率（%）突变热点肿瘤型突变频率（%）突变热点肺癌56157，248，273前列腺癌30不确定结肠癌50175，245，248，273肝细胞癌45249食道癌45不确定胶质癌25175、248卵巢癌44273乳腺癌22175、248、273胰腺癌44273子宫内膜癌22248皮肤癌44248、278甲状腺癌13248、273胃癌41不确定白血病12175、248头颈鳞癌37248宫颈癌7273膀胱癌34280软组织肉瘤31不确定表人类肿瘤p53基因突变热点和频率4849（三）C-myc和Bcl-X

双向调控凋亡，取决于刺激种类和生长环境；

C-myc基因表达，若无足够的生长因子刺激─→细胞凋亡；

Bcl-X基因可翻译出2种蛋白

Bcl-XL（抑制凋亡）；而Bcl-Xs（促凋亡）。49（三）C-myc和Bcl-X四、细胞凋亡的执行特点：cysteine-containingaspartate-specificprotease（含半胱氨酸的天门冬氨酸特异水解酶）apoptosis凋亡过程与调控和凋亡有关的两个酶作用：切割染色质DNADNase特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活性Caspases作用：灭活凋亡抑制物水解蛋白质结构，形成凋亡小体水解凋亡相关活性蛋白四、细胞凋亡的执行特点：cysteine-containin50Caspases家族简介1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第1个Ced-3同源分子，叫白细胞介素-1β转换酶（Interleukin-1βConvertingEnzyme，ICE），Pro-ICE含404个氨基酸，分子量45KD。在一定形式下可自身催化产生20KD和10KD二个片段，聚合形成（p20）2(p10)2杂四聚体，为活化的ICE。到1998年底为止共发现有14个Ced-3同源分子，分别定名为Caspase1-14。

Caspases家族简介1993年Yua51使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD破坏细胞结构，如Lamina将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如GelsolinCaspase如何杀死细胞？使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICADCaspase如何杀52五、凋亡细胞的清除——吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬吞噬细胞凝集素（lectin）血小板反应蛋白磷脂酰丝氨酸受体五、凋亡细胞的清除——吞噬细胞对凋亡细胞的识别与吞噬吞噬细胞53apoptosis

细胞凋亡与疾病的关系——该“死”的细胞不死，不该“死”的细胞却死了，也就是说无论凋亡过度或凋亡不足都可以导致疾病的发生。细胞凋亡不足：肿瘤，自身免疫病，细胞凋亡过度：心肌缺血，心力衰竭，神经元退行性疾病，病毒感染不足与过度并存：动脉粥样硬化凋亡与疾病apoptosis细胞凋亡与疾病的关系——该“死54

表：与细胞凋亡异常相关的疾病

凋亡不足凋亡过度肿瘤肝癌、恶性血液肿瘤、乳腺癌发育异常气管-食管瘘、房（室）间隙缺、膀胱癌、肺癌、胶质瘤、前损、唇（腭）裂、短肢畸形、列腺癌等尿道下裂以及多囊肾等发育异常先天性消化道、胆道、肛门狭CNSAlsheimer病、Parkinson病、窄或闭锁、动脉导管未闭、两肌萎缩性侧索硬化症、色素性性畸形、甲状舌骨囊肿等视网膜病，脊肌肉萎缩、早老免疫系统系统性红斑狼疮、糖尿病、类性痴呆风湿性关节炎、桥本甲状腺炎免疫系统免疫缺陷病、AIDS

、多发性的硬化症等表：与细胞凋亡异常相关的疾病5556

一、肿瘤增殖过度而分化不足、凋亡受抑─→发生肿瘤。突变型P53↑、野生型P53缺失使肿瘤发生率↑（在肺癌中，发生率上升50～80%）；

bcl-2基因的高表达与肿瘤的恶化程度与预后密切相关（前列腺癌、结肠癌等）；肿瘤细胞Fas低表达，降低肿瘤细胞凋亡；肿瘤细胞分泌FasL─→淋巴细胞凋亡─→肿瘤细胞逃脱免疫攻击。56一、肿瘤巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。临床上采用钙拮抗剂（尼莫地平）治疗，较弱刺激，非随机、散在发生而Bcl-Xs（促凋亡）。偶联性：死亡信号的转导系统与细胞增殖、分化过程②线粒体损伤启动的细胞凋亡。氧自由、神经元内钙增多、β－淀粉样蛋白增多发育中──→清除针对自身抗原的免疫细胞。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,早老性痴呆)1993年Yuan从哺乳类细胞中发现第1个Ced-3同源分子，叫白细胞介素-1β转换酶（Interleukin-1βConvertingEnzyme，ICE），Pro-ICE含404个氨基酸，分子量45KD。（1）凋亡启动酶：Caspase2、8、9、10cAMP、Ca2+、神经酰胺表达产物P53蛋白是DNA结合蛋白，G1期负责--至今细胞凋亡进入分子阶段的研究，在此间发现细胞凋亡的相关的调控基因；一、细胞凋亡相关因素Fas受体上调；Caspase9─→细胞毒因子诱导的凋亡；57

二、自身免疫性疾病

发育中──→清除针对自身抗原的免疫细胞。细胞凋亡在T细胞发育中的作用：胸腺细胞正选择：同MHC多肽复合体异己抗原起反应的T细胞保留和存活；胸腺细胞负选择：同MHC多肽-自身抗原复合体起反应的T细胞通过凋亡而去除（可预防自身免疫病）。

自身抗体致敏T淋巴细胞含自身抗原细胞自身组织损伤临床症状凋亡巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞57二、自身免疫性疾病自身抗体58多发性硬化症胰岛素依赖性糖尿病系统性红斑狼疮慢性甲状腺炎细胞免疫应答过程中，靶细胞死亡的重要方式是Fas-FasL途径的凋亡机制：淋巴细胞Fas抗原和FasL表达减弱或缺陷，阻碍胸腺细胞负选择；Bcl-2过表达糖皮质激素可诱导异常存活的自身免疫性T细胞凋亡58多发性硬化症细胞免疫应答过程中，靶细胞死亡的重要方式是F59

三、心血管疾病

1.心脏传导障碍与心律失常

（1）发育中P细胞凋亡↓，残存P细胞能产生自主心律（某些心律失常患者随着年龄增长，心律失常可自行消退，与延迟凋亡有关）；

（2）发育中P细胞过度凋亡─→不稳定电活动，心源性猝死。新生儿窦房结大量P细胞和少量胶原

成人窦房结少量P细胞、过渡细胞和大量胶原P细胞凋亡59三、心血管疾病（1）发育中P细胞凋亡↓，残存P60

2.心力衰竭内毒素、过度负荷、缺血缺氧等─→心肌细胞、心肌成纤维细胞高表达TNF-α─→心肌细胞

凋亡↑

─→心功能↓，心力衰竭。

3.心肌缺血-再灌注损伤缺血、氧自由基、Ca2+超载等均为凋亡诱因①缺血早期以凋亡为主，晚期以坏死为主；②轻度缺血以细胞凋亡为主，重度以坏死为主；③缺血-再灌注的一定时间内，发生的凋亡比单纯缺血更严重；

④细胞凋亡有可能通过干预加以挽救。602.心力衰竭61

缺血性心脏病(ischemicheartdisease)、心力衰竭(heartfailure)、心律失常(arrhythmia)、心肌病(cardiomyopathy)、动脉粥样硬化（artherosclerosis）、高血压（hypertension）等心血管疾病

——

其发生均与凋亡密切相关。61缺血性心脏病(ischemi62

四、神经元退行性疾病阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,早老性痴呆)

帕金森病、肌萎缩性侧索硬化症、脊肌肉萎缩、小脑退行性病、遗传性视网膜退行性变

凋亡在神经元退行性疾病发生机制中起重要作用。62四、神经元退行性疾病63

四、神经元退行性疾病

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,早老性痴呆)

海马及基底神经核的胆碱能神经元丧失达30-50％大脑皮质神经元丧失、脑萎缩脑实质有大量β－淀粉样蛋白及神经原纤维缠结机制：氧自由、神经元内钙增多、β－淀粉样蛋白增多临床上采用钙拮抗剂（尼莫地平）治疗，能延缓神经元的死亡，AD症状可得到改善。63四、神经元退行性疾病海马及基底神经核的胆碱能神经元丧五、病毒感染HIV感染HIV的宿主细胞膜上表达一种gp120糖蛋白，与CD4＋淋巴细胞表面的受体结合，触发凋亡2.

感染HIV的CD4＋细胞逐步融合成合胞体或多核巨细胞，合胞体在形成过程中或形成后即可发生凋亡解体。3.

Fas基因表达上调，使CD4＋细胞对Fas介导的细胞凋亡敏感性增加，易发生凋亡4.

T细胞激活，与凋亡有共同的信号传递系统，缺乏足够的细胞生长因子时，引起凋亡5.

巨噬细胞分泌TNF，与TNF受体（死亡受体）结合，启动凋亡，或产生氧自由基五、病毒感染HIV感染HIV的宿主细胞膜上表达一种gp1206465受感染的细胞产生tat蛋白，透过细胞膜，使CD4+细胞内氧自由基生成增多，增强Fas抗原表达，细胞对凋亡的易感性升高7.

慢性感染期，受感染的CD4+淋巴细胞作为效应细胞，诱导未受感染的CD4+淋巴细胞凋亡8.HIV可诱导B细胞，CD8+淋巴细胞，巨噬细胞凋亡意义：终止病毒复制和表达65受感染的细胞产生tat蛋白，透过细胞膜，使CD4+细胞766

五.细胞凋亡不足与过度并存性疾病动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）

动脉内膜和内膜下脂质沉着，中层平滑肌细胞向内膜移行增殖，内膜增厚形成粥样病灶或纤维脂质斑块。

AS发生中：血管内皮细胞凋亡↑（为34.0%远高于对照组8.0%）；血管平滑肌细胞增殖↑↑、凋亡↑（为29%远高于对照组0.06%，增殖占优势

）。66五.细胞凋亡不足与过度并存性疾病67§4.细胞凋亡在疾病防治中的意义

通过调控（抑制或促进）细胞凋亡，防治疾病。

1、合理利用凋亡相关因素

（1）诱导凋亡（射线、高温），治疗肿瘤。（2）抑制凋亡（生长因子、激素），治疗退行性病变

2、干预凋亡信号转导来调控凋亡，治疗疾病

（1）阿霉素刺激肿瘤细胞表达Fas/FasL使细胞相互交联，促进肿瘤细胞凋亡；（2）磷酸鞘氨醇（SPP）具有转递增殖信号拮抗凋亡作用，防止神经元凋亡。67§4.细胞凋亡在疾病防治中的意义683、调节凋亡相关基因来影响凋亡

导入野生型P53基因诱导肿瘤细胞凋亡，抑制或封闭Bcl-2表达─→提高肿瘤细胞对抗癌药物敏感性。

4、控制凋亡相关酶来影响凋亡

调控caspase、核酸内切酶活性─→影响细胞凋亡。

5、防止线粒体跨膜电位的下降，抑制凋亡

环孢菌素A能稳定线粒体膜电位─→抑制凋亡。683、调节凋亡相关基因来影响凋亡69

教学要求1.掌握细胞凋亡的概念及特征性的变化。2.熟悉细胞凋亡的调控因素及发生机制。3.了解细胞凋亡的生物学意义及凋亡与疾病发生进展的关系。69教学要求1.掌握细胞凋亡的概念及特征性的变化。㈠细胞凋亡不足⒈肿瘤：凋亡抑制基因Bcl-2基因过高表达------凋亡衰减（前列腺癌）促凋亡基因如p53基因突变或缺失，肿瘤发生率↑⒉自身免疫病

———自身抗原受到自身抗体或致敏T淋巴细胞的攻击而损伤

T、B淋巴细胞通过正选择和负选择才能发育、分化成熟

负选择：凋亡清除针对自身组织抗原和TCR的双阳性细胞正选择：保留能够识别自身组织抗原的T细胞，并增殖成熟

如果负选择机制失调，针对自身组织抗原的T细胞存活、增殖，产生自身免疫病。如果负选择机制失调，针对自身组织抗原的T细胞存活、增殖，70㈡细胞凋亡过度⒈心血管疾病⑴心力衰竭⑵心肌缺血与再灌注损伤———坏死与凋亡共存发生机制：氧化应激；细胞内钙超载；

Fas受体上调；p53基因转录增强

凋亡特点：①早期凋亡为主，晚期坏死为主②梗死灶中央以坏死为主，周边凋亡为主③慢性、轻度缺血以凋亡为主，急性、重度缺血则常常发生坏死④IR引起的细胞凋亡有时比单纯缺血更严重

㈡细胞凋亡过度71⒉神经元退行性疾病

———特定神经元进行性丧失为病理特征的疾病阿尔茨海默病（AlzheimerdiseaseAD）

AD主要是由于海马及基底神经核的胆碱能神经元大量丧失,病理切片上可见β-淀粉样蛋白沉积和神经元缠结

机制：β-淀粉样蛋白基因位于21号染色体，当钙超载、氧化应激或神经生长因子分泌不足时，Ca2＋内流增加，激活与β-淀粉样蛋白合成有关的基因，使β-淀粉样蛋白含量增加，沉积于神经元内，进一步激活周围的Mφ释放细胞因子和炎性介质促进凋亡的发生⒉神经元退行性疾病72⒊病毒感染

病毒感染宿主细胞后有两种结局：一是诱导细胞凋亡从而限制病毒生长（肝炎病毒）；二是由病毒基因表达的蛋白抑制宿主细胞凋亡，造成持续性感染或增加某些病毒的致癌可能性。

AIDS:由HIV感染引起，其关键是CD4+淋巴细胞被破坏，导致CD4+淋巴细胞显著减少，相关免疫功能缺陷。CD4+淋巴细胞与HIV感染者病情发生发展有密切关系，它决定感染者是否发病和发病的速度和严重程度。⒊病毒感染73HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素：1）HIV的基因产物GP120能直接启动CD4+淋巴细胞的死亡程序2）合胞体形成：3）Fas基因表达上调4）T细胞激活激活诱导的细胞死亡5）细胞因子受感染的Mφ释放TNF增多6）tat蛋白：诱导CD4+淋巴细胞产生OFR，增强

Fas表达7）慢性感染时，受感染CD4+淋巴细胞作为效应细胞，可增强未感染的CD4+淋巴细胞对凋亡的敏感性HIV感染导致CD4+淋巴细胞发生凋亡的相关因素：74㈢细胞凋亡不足与过度并存

由于细胞类型的差异，各种细胞在致病因子作用下，有些可表现为凋亡不足，而另一些细胞可表现为凋亡过度，因此同一疾病或病理过程中两种情况也可同时存在。例如：动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）㈢细胞凋亡不足与过度并存由于细胞类型的差异，各种细胞75AS——血管内皮细胞凋亡过度而血管平滑肌细胞凋亡不足血脂↑（oxLDL）血流动力学改变动脉内膜功能受损血管内皮解剖性损伤单核C粘附、移行内膜下内皮下胶原暴露吞噬LDL成为泡沫C血小板激活

释放GF（PDGF、FGF、TGF-β、EGF）刺激平滑肌C、成纤维C增生刺激结缔组织形成、抑制平滑肌C增生病生课程调亡标准课件76②线粒体损伤启动的细胞凋亡。二、细胞凋亡的信号转导Bax亚家族：Bax、Bak、Bok等（促进凋亡）；二、细胞培养液LDH活性检测——其发生均与凋亡密切相关。死亡因子（deathfactor）：TNF、FasL、TNF-相关凋亡诱导性配体。1、酶原结构（Procaspase)：（1）凋亡启动酶：Caspase2、8、9、10二、自身免疫性疾病发生机制：氧化应激；（1）发育中P细胞凋亡↓，残存P细胞能产生自主心律（某些心律失常患者随着年龄增长，心律失常可自行消退，与延迟凋亡有关）；AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；糖皮质激素可诱导异常存活的自身免疫性T细胞凋亡专职吞噬细胞（如单核巨噬细胞）或邻近固有的组织细胞（如上皮细胞、内皮细胞、肿瘤细胞）或自然脱落离开生物体，不伴有局部炎症反应。1887年Flemming将自己的发现的这种细胞死亡命名为染色质溶解死亡，并对死亡现象做了精彩的形态描述。C-myc基因表达，若无足够的生长因子刺激─→AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；①缺血早期以凋亡为主，晚期以坏死为主；临床上采用钙拮抗剂（尼莫地平）治疗，细胞凋亡在疾病防治中的意义

细胞凋亡是一个程序化过程，可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治疗疾病㈠合理利用凋亡相关因素1.诱导靶细胞凋亡放疗、化疗

高热、高温2.减少细胞凋亡NGF、促生长因子抗氧化剂抑制Bcl-2抗凋亡作用促进促凋亡基因作用引发氧化应激，增强P53促凋亡作用②线粒体损伤启动的细胞凋亡。细胞凋亡在疾病防治中的意义抑制77㈡干预凋亡信号转导㈢调节凋亡相关基因㈣控制凋亡相关酶学机制㈤防止线粒体跨膜电位的下降㈡干预凋亡信号转导78附：细胞凋亡检测

一、AnnexinV-FITC结合膜表PS实验二、细胞培养液LDH活性检测三、核DNA片段检测

1.DNALadder2.Tunel法四、镜检凋亡小体五、细胞凋亡反应核心因子检测六、流式细胞术附：细胞凋亡检测

一、AnnexinV-FITC结合膜表P79apoptosis生化改变凋亡过程与调控凋亡时细胞的主要变化形态学改变apoptosis生化改变凋亡过程与调控凋亡时细胞的主要变化8081TransmissionalElectronMicroscopy对照凋亡凋亡

坏死81TransmissionalElectronMicr8182

（二）生化改变

DNA

Ladderfrom82（二）生化改变DNALadderfr82apoptosis凋亡过程与调控DNase激活Caspases激活凋亡细胞的清除凋亡执行apoptosis凋亡过程与调控DNase激活Caspase8384(二)线粒体损伤启动的细胞凋亡

1.线粒体膜通透性转换（permeabilitytransitionpore,PTP）：凋亡因子─→线粒体跨膜电位↓、电子传递脱耦联─→PTP开放─→膜通透性↑，线粒体释出AIF、CytC、Apaf─→凋亡。

AIF（细胞凋亡诱导因子）─→可快速激活核酸内切酶，并增强Caspase3活性；

细胞色素C(CytC)与Apaf（凋亡蛋白酶激活因子）相互作用─→激活Caspases9─→激活Caspases3，6。84(二)线粒体损伤启动的细胞凋亡84病生课程调亡标准课件8586

Bcl-2抑制凋亡的作用机制：（1）调节PTP活性─→降低线粒体膜通透性，阻止Cyt-C释放，可与Apaf-1直接结合而阻止Caspase-9的激活；（2）与凋亡促进蛋白Bax形成异二聚体，抑制Bax的促凋亡作用；（3）减少内质网Ca2+释放，限制核内[Ca2+]持续↑；（4）抑制Caspase的活化。86Bcl-2抑制凋亡的作用机制：8687（二）野生型P53基因（“分子警察”）野生型P53基因：

表达产物P53蛋白是DNA结合蛋白，G1期负责监测DNA损伤并启动修复机制，维持细胞基因的完整性。若不能修复，则促进细胞凋亡而减少带有缺损或突变基因的继续存活，被誉为“基因警卫”。突变型p53基因：

编码的p53蛋白对细胞凋亡有抑制作用。

87（二）野生型P53基因（“分子警察”）87apoptosis研究历史定义★与坏死的区别★生理意义概述概述apoptosis研究历史概述概述8889

1842年Vogt在研究蝌蚪发育时，发现一种不同于细胞坏死的细胞死亡现象。1885年Flemming在研究卵巢滤泡时再一次发现了有不同于细胞坏死的细胞死亡现象，并指出这种细胞死亡是生物体生理机能的一部分。1887年Flemming将自己的发现的这种细胞死亡命名为染色质溶解死亡，并对死亡现象做了精彩的形态描述。1887年德国的科学家Graper在一篇关于线粒体论文中再次提到Flemming的发现。§1.概述

一、细胞凋亡的研究历史

21842年Vogt在研究蝌蚪发育时，发现一种不同于90

1965年发育生物学家Lockshin在研究蛾发育过程中首次提出程序化死亡（programmedcelldeath）概念。

1972年

Kerr首次提出细胞凋亡（apoptosis）的概念。

1973年

首次在细胞凋亡中发现DNA的降解。

1973～1987形态学描述和生物化学研究阶段。--至今细胞凋亡进入分子阶段的研究，在此间发现细胞凋亡的相关的调控基因；发现细胞凋亡的抑制剂；认识线粒体在凋亡中的重要作用；发现细胞凋亡的诱导因子；尤其近几年细胞凋亡进入临床应用阶段。§1.概述

31965年发育生物学家Lockshin在研究蛾发育过91

SydneyBrenner1/3oftheprizeUnitedKingdomTheMolecularSciencesInstitute

Berkeley,CA,USAb.1927

(inUnionofSouthAfrica)H.RobertHorvit1/3oftheprizeUSAMassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USAb.1947JohnE.SulstonUnitedKingdomTheWellcomeTrustSangerInstitute

Cambridge,UnitedKingdomb.1942

THE2002NOBELPRIZEWINNER4

92§1.概述二、细胞凋亡的概念

细胞凋亡（Apoptosis）——在一些体内外因素诱导下，细胞内的死亡程序被激活，而引发的有序的细胞死亡。又称为程序性细胞死亡（programmedcelldeath）；凋亡有其独特的形态学和生物化学改变。

1972年英国Aberdeen大学病理系Kerr教授和Wyllie在研究中观察到一种不同于坏死的散在细胞死亡方式，联想到秋日落叶特征，命名为“apoptosis”。5§1.概述197三、凋亡与坏死的区别特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释放酶，细胞核内染色质沉淀靠近核膜边，蛋白质合成下降，由于膜破裂，出现炎症反应一般过程：因补体反应或烈性病毒感染破坏了质膜，或者能量依赖性离子泵被破坏产生的钠钾等离子沿着各自的浓度梯度进入细胞，从而导致细胞吸水膨胀，最终破膜而死。§1.概述三、凋亡与坏死的区别特征：线粒体膨胀，细胞骨架降解，溶酶体释9394细胞坏死细胞凋亡性质病理性，非特异性生理性或病理性，特异性诱导因素强烈刺激，随机、成片发生较弱刺激，非随机、散在发生形态变化

细胞肿胀、胞浆、核染色质等结构全面破坏、崩解

细胞皱缩、核固缩，染色质边集，胞膜和细胞器相对完整凋亡小体

无

由膜包绕分割细胞形成炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应细胞内含物不外溢，无局部炎症反应生化特点

被动过程，无新蛋白合成，不耗能

主动过程，有新蛋白合成，耗能，内源性核酸内切酶活化DNA电泳弥散性降解，片段长短不一核酸内切酶水解DNA呈片段化（180-200bp倍数片段），呈梯形电泳带基因调控

无有凋亡相关基因参与凋亡与坏死的差异比较7细胞坏死细胞凋亡性质病理性，非特异性生理性或病理性，特异四、细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能

所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。概述四、细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长概述95病生课程调亡标准课件96病生课程调亡标准课件97细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长维持内环境稳定发挥积极的防御功能

所以细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡过多或过少都可引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为医学界的关注热点。apoptosis概述细胞凋亡的生理意义确保正常发育、生长apoptosis概98apoptosis生化改变凋亡过程与调控凋亡时细胞的主要变化形态学改变apoptosis生化改变凋亡过程与调控凋亡时细胞的主要变化99100一、细胞凋亡的主要特征

（一）形态学改变

1.细胞固缩（condensation,shrinkage）

细胞表面微绒毛消失，与周围细胞脱离；胞质浓缩，胞膜空泡化，细胞体积缩小、出现固缩；13一、细胞凋亡的主要特征101

2.核边集（margination）：核染色质高度浓缩，融合成团并向核膜下聚集，呈新月形或环形分布，也可呈马蹄、镰刀等形状排列；或向中心集中（即中聚形成黑洞样）。新月状八字形花瓣状环状球状黑洞样142.核边集（margination）：新月状102TransmissionalElectronMicroscopy对照凋亡凋亡

坏死15TransmissionalElectronMicr103

3.出芽（budding）及形成凋亡小体（apoptoticbody）：骨架与胞浆膜脱耦联，包膜向外不规则膨出，包裹线粒体等细胞器、空泡化的胞浆及裂解的高浓度核物质，最终脱落形成多个外有膜包裹、内有不能外溢内涵物的凋亡小体，其大小不一，圆形或椭圆型或不规则型。163.出芽（budding）及形成凋亡小体（apop释放GF（PDGF、FGF、TGF-β、EGF）肿瘤细胞分泌FasL─→淋巴细胞凋亡─→肿瘤细2、干预凋亡信号转导来调控凋亡，治疗疾病而Bcl-Xs（促凋亡）。发育异常先天性消化道、胆道、肛门狭CNSAlsheimer病、Parkinson病、DNA严重受损后，P53大量表达，诱导细胞凋亡（二）生化改变Bcl-X基因可翻译出2种蛋白二、自身免疫性疾病特点：Ca2+/Mg2+增强活性，Zn2+抑制其活性单核C粘附、移行内膜下内皮下胶原暴露MassachusettsInstituteofTechnology(MIT)

Cambridge,MA,USACaspase如何杀死细胞？子）相互作用─→激活Caspases9─→激活Caspases巨噬细胞吞噬分解凋亡细胞5）细胞因子受感染的Mφ释放TNF增多又称为程序性细胞死亡（programmedcelldeath）；细胞表面微绒毛消失，与周围细胞脱离；Caspase12─→内质网应激途径的凋亡②轻度缺血以细胞凋亡为主，重度以坏死为主；104

4.识别并被吞噬清除：

专职吞噬细胞（如单核巨噬细胞）或邻近固有的组织细胞（如上皮细胞、内皮细胞、肿瘤细胞）或自然脱落离开生物体，不伴有局部炎症反应。释放GF（PDGF、FGF、TGF-β、EGF）174105细胞凋亡的形态学改变18细胞凋亡的形态学改变10619107

（二）生化改变

1.DNA片段化：凋亡诱因—→激活凋亡蛋白酶（Caspase）—→激活内源性核酸内切酶

—→裂解DNA，形成180-200bp整数倍的寡核苷酸片段—→电泳呈梯形条带（ladderpattern)。20（二）生化改变108

（二）生化改变

DNA

Ladderfrom21（二）生化改变DNALadderfr109

（二）生化改变

2.内源性核酸内切酶

Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶，Zn2+抑制其活性。

正常细胞中，CAD

（Caspase激活的DNA酶）与ICAD（Caspase激活的DNA酶抑制物）结合而无活性。

Caspase裂解ICAD使CAD游离而活化─→分解DNA使其片段化。22（二）生化改变正常细胞中，CAD（Cas110

（二）生化改变

3.凋亡蛋白酶（Caspase蛋白家族）（Cysteine-containingaspartate-specificproteinase）结构含半胱氨酸，可在天冬氨酸（Asp）残基后切断肽链的蛋白酶家族，其相应基因用CASP

表示。

1、酶原结构（Procaspase)：含N末端结构域、20Kd大亚基和10Kd小亚基。2