细胞培养基本方法

.操作台基本要求:图2.1.图2.1.适合惯用右手的工作人员的理除并通风南基本布局.惯用左手的工作人员可相应为调整工作会面工物品的送放位置..随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20℃或-80℃冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。.细胞污染：（1）细菌污染由22班即相差图鹏显示巫暧主代的上羽炬花还太麻鼾皮污染.以点显徵象下可只贴理无泡用的且感存存一些靠谶发更笆微小涯札，但是臂个脚苗不易区分炉用以将患也方程区蜘一步放大高可斌显示出各个大桁科南如恒一这些空趣通常为阡状.妁2Hm衣，直径约05叩10图冉山里色方座的超迫忙堪均为1ODpmo(2)酵母污染图才生埋殖相差图信显示站暨培苏的加三生胞薮整段污桀口考茉的磔母细胞昱她或咫题X.复需时会年生中辅■」、的新卦.(3)霉菌污染初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。(4)病毒污染一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。(5)支原体污染唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE、PCR、免疫染色、放射自显影.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出.适合贴壁的细胞和悬浮的细胞贴壁培养悬浮培养适营包拈原代出胞在内的大多效抽的类型口适自己适应悬浮培养的拙胞以及其他一些无拈附性的细胞1例如:造皿郭胞卜常要醒朗传代一怛是易于通过倒置显微镣双察，较导传和一但是零要每天进行堀胞计数和存活率测定一以监测生长模式；可将培养物稀释以赭淞生长.利用酣〔例如：EMLEK眸55,胰蛋,白酷）或机械方法瑁离细胞-无需通辽且或机捕方法解离副胞口细胞生长受表面积限制，因而产量受限*珀的生长野勤苴在塔养基中浓度的限制，易于扩大培养规椁口需要使用经过组堪培於处理的容器口可使用未及组织培养处理的容器迸行培养.但茄要援劭【即：摇晃曲授抨〕以便通行充分的『律交篇口可理殴位萩产物，用于细版学研究等多耗研究期域口可批量收萩产物.用于墨白用的大量生产及当利用究领域..基础培养基，减血清培养基，无血清培养基.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4；成纤维细胞系适合轻度偏碱（PH7.4-7.7）Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长.温度： 大多数人和哺乳动物细胞系在36℃至37℃最佳昆虫细胞在27℃为最佳禽类细胞在38.5℃最佳冷血动物（15℃-26℃）.动物细胞形态划分：成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附•特殊形态：令I型有长突触令II型没有轴突.细胞增长模式园43培养狙国的舆型生长撑式图.此黄对酸困显示了酒匏期展与里弄时间工时为美且.靖尹的隼地西管生姮手米生隹蛆帽拈.4箱接种后篁一小生长断的是我需的.此盼焦如肥生共纭慢.址于适应热葬百鼻.为生愿也甚悚觉铅的原老.延沛明之后是对短翱，此阶的津能呈指黄甥班.海林生长施弄型中附言弄重.当斯府生长厚开宓丹被杼息，即二一种里手抻营养盛韩埠】立者掴艇已占据所有可用甚哉对,细胞用进忍静止懈［就：平台飘L剧弗座度大大降饪甚T竟至停止，.何时传代?哺乳动物：生长的PH值通常表示乳酸储积，且有毒性，当PH迅速降低（）0.1-0.2PH单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。■12.昆虫细胞PH■12.贴壁细胞的解离方法解肉作用用途程寤堤轻临昆珞养客出，寸罟剧烈殴打研柏贴壁的把触.再想分裂亚胞副削司制的对雷白潞整感的掴鸵系；qSEM一些用脑藤重白曲修贴受性将跑藕国白的一般庖甑高望度重能!、已^形成举层堵杓的m.特引是成■畀界细胞初第密法多祖障便留虑完登、汇告片层的载由一组地夙用齐皿表面脱高下聚，而不料型胞鼠雳TrypLE™解置函导站史性目舱；直喽时代膝争白甑：重要使用非访物源性试■何地典域13.贴壁细胞的传代所需材料•墓有玷里虻胞的坞葬客热•经包组织增齐处理的培齐丽，培养梅交熠芥皿-完全生式填养基.顼热至m穴・次性无独谷制1_就管三产匚室界箱，充石二五位取茶唐为弼的濯化空气平劭苗溶液，列如:杜尔贝科碟触/缓冲液tDPE*,不含钙，集和配杠•梆裔利,列JS：技第日独或TrypLEERp咨5.不■&录缸•用于活拉胞相总岫胞计数的品剂料设备，例如.Uwn忙5寸自动加胞汁做柩、告给篮染/耳口叽师计翌器-蜜百Suit巨rSjM巨广（B^krrianCouftsr（六壁细腿传代流程 匪有肾细胞愦触的咨校和爱筒均应力元朗优恋■金湎呆期F瑞的无泡理市，开且在展济一通扭I隔岗工作.工从培养塞鼎中队出用包的里览塔葬基并于拜口，用不含超和镁的平衡身的诙冲洗蛆庵（把1。51』塔??寰面朝鸡至上mLSSiSL取写蹈箜用担房相惠的荐黑一恻轻轻加入冲洗液.以注曼依动归胞品，轲后睡足容器过去。事二叶洗沙囊可去就可融抑住箱超捐作用的小・皿再、箕如篌口J.从增君容式中吸出.即^理升芸耳*.向培养率中加入预科的廨惠嗣〔例加：腆蜜白料虱TWEF：试刺・应足以商董西胞尾（繇lOcm^^O-SmL}.轻轻轮晃者器，陵统招定会费盖用陂层口.我培养容器在室温下照育的2分钟口清注妆实际辨皆时阈根用所用空胞源不同而有淅差.在星氟翰下蓑熊细胞解幅情况.如果后常程度不达如喝，可持期,时间延性凡齿钟，打如砂押畛查一次解高情况」也可羟羟指打培乔器器以加愧鼬胭黎度■九纪怛所高嗫鹿大于善于两％前，阐耨培并存事，徒用隗上液峰旱情就尽”加入所用解阍制阿佶值现的鹫建定至主任地葬基.啖却瑞照层去画树看，僮培养基芬附，&常更附转愿到IS-mLetl昭普中、义200Kg的高心力麋心占至I。分钟."注笈离心递电荏肘间依班无呼奘不同而等所差异・班用最少体启的芨祺完全生虻培养基型新悬浮岫朋沉症.取出少・其品正行计君&1&.采用IL球计劲器，驰凰汁触饯抒照台时蓝拒编法或者陋闻匚灯,侬•自动细题计独伐前定总芟胆数和活细胞百分比.心芟时一可再次向却阅中加入生隹焙养基，以通达到所零的电胞茶废，并重新避行却胞计数。汪：变1E逮议使用匚aunt整广自动sfl胞计戮长涮定忌细胞道和活弼胆百分比.Caint^官制眼胞讦物以汁热用胃的样不上与您回前使用的5计款器所需■相同，且不到一分钟即可定成一个荐本的奥理夔的计题一适用于喑杵真极第胞*有关传烧血球计数珥使用的克多恃芭-请参询第钮或的’支持掳本方累.部昔，3,杵华的悬液烽薛到该郎胞系拦若的接肿盍廖，并将适■悴他的酒袍后液转移到新的非触培养霹誉中.把细胞放回店养莉.汪：如巢便用塔苦拈.热其放入JS;；箱前应将瓶盗挺松.此便进行充分的胃低姿段，除非同惬用的是通不式培导他召透气慢用盈，14.贴壁昆虫细胞传代:肘壁尾由蓟胞传代的注意事项 虽也品U到常传优的一毅步累与哺乳动物期胞相同，倬是理当培养系统的一些关摄要求有所不同，为了我甯量巷绪黑，实凿中磬密产国守所有产品明帝的承作说明a民出凯胞应在无效盘戋代。住走.如枭书钟的生理站至士民兄纪制.则向在细胞正到工吾牧甚事■者应刚畀培从喀弗瓶底配脱离因进行传代，囚力此射电隹客易匣器口细埴里度幅于汇合双强的前％时.圣胞生王会受理抑制.牍笳状态昭好的班电是时数用曲歌的空胞•培罪昆虫独胞时建设不要避行二科比碳交换.昆虫釉胞由于“管.第涅化不理中培并口有微先弟件下可柘细跑栽在攫柞台上奎考放八抽屉中于室温下培并・但是，建说使用泡盅挖制在万七的环境■泰冏昆三均胞专用的埒弗基.在无皿淌培齐基仲下一昆虫挑域与基用贴的极为本固.霍至右勇以女力彳才能有其脱第=装使足胞粉—―—一单的前一坟—一下塔齐租•为了避免万人.三行此检昨前四助董想盖子.管者二建设不善即剂器里堪界哥.因为这槎可能受齿成细琪损仿.悬浮细胞的隹代 总谆貂也传代比知理咄胞传杖■袒敢有隼一些口由F汇制已经在生悦唐共基中悬浮.囚统无需通述ift的作拓孽其从用春寄赛卷需双圈，整个过程较为迅速.对翩圉的损情也粒小.喜浮培芬时不进行生靛尾芥基的更摸：而是海上箕m又加同一史.直到细胞臣含•可以直抵在墙葬期中稀群知粗.然后姓理堵养犷博，串■者也可以从培芹瓶中取出一部分细胞，花余下的细胞稀耶到诙霜眼垂适宜的接种害度.总矛坦能传代后的加满题一班比照珪隼脆短，悬浮培养等耨 悬浮注芥可录用未经第税塔齐处里的元为用芥鹿喇加；不常折就根的辨瓶〕进行.停是，专为把用细胞里手值计匡痔福（即：般择瓶〕具有出包的】律交换功班，盯进行更上规模茁黯旎婚芥。转藻有两种叁本毁计；注培养王田总挂的盘畔玛里者垂直的叶轮技捍『即揽动卜叁旦叶他的拴色败果更隹.转布且喀芦体态不求词过转瓶■现示停租的一泮，以便粮,充分〔胴如：5Kmk转瓶虫凿井液体不能越过25口mu口15.悬浮细胞传代流程.当虻胞百台玮低［即：处于对敬士荒期而至达弱汇合桂态」时，从用弄箱中取出后齐埴，使用无归吸赞乂珀里来中取出沙盘堀附注JU如果眼取作品前细照已转沉迫.应转动培养殖一便细至在塔弄堂中均匀分布*.通过此忘品.采用CoMt”/自面阴埴汁及值或者£球计觎黑.掴胞计也但接黑白朗慕拒假法君定总釉艳她和港知胞百力比.1.计Jf椅里随碓拜到推荐令衿密度肘需要加人的笫井里悻押。4.在无由求愈下将适量预热的主把培养基.；.口人到培齐.电申,旧委时可将培甚的吃胞分到多个增养费中.5、格培养箱的埴it旋开一图，以便进行充分的3体交换1或青使用透与性瓶靛〕，井梅培寺期I回索延坞#箱.粗是逮腹取决不具体的削胞买.注：为了厚■融少陷胞评片和无用的代谢画产要在推爨培养串票中番双，每三周I或者必要时】应拚鲤胞悬液轻轻需心一比，禽心力为lOOKd酎同为三军加行仲，然后用新好的生母培养基堂新悬浮更胞沈淀*转ittR寸JbMfi茶甚悻枳iaamL10IM25DmL50mL5(MmL2DCImL斐伯埋迎开箱既荐堪弟对辕塞笄番不要超过5馆Ei,猫议息方茫成■魁.体祀较小的转施更蛤逐步K夫培养族模。1.当归胞适刍传H【即.胜于对聂戈景北面未达豆狂盲状态｝附，以堵黑而中取出培养题，使用无曲吸发从培养期中段出抄;■瑞施把品，如垂变兄悻扉勃理前已建沉淀，应转动堵郭箍.他酒脆在塔畀型中均句安书*七逅近此样品.王月亡mntuEE,自动菜胞园数仪园罟皿球计数需、蛆跄归数悦魏照吾睑君挹观法测定总用胞过和及西伯百分比.，计算舛英胞推璘到推荐若科雷康时需要却入的雄至基悴即.工在无曲双强下腾盲■和热的生英箱养基加入到填养瓶中.哈要时可甚燧养的壮胆行到客个培萍睡中・入拼培芥箍的瓶盖挂开一圈，以便进行充分的气体兖掘，井杯培界瓶族回增养帽。转速取决于无月斑啦系和二十靶父里。屈诙保蔻速始送去碓农埔范围内一以更勇切应力导进生胞飓注；为了尽■越受珀胞碎片和无用的R谢用产室在旋叶培并体系中番和,一三用（或青吁要田［应将西胞导液舞轻霭心一凌,羯心力为1面乂中行间为5至10分钟.然后用新鳍巴生式增舞型生笥焦券把抱质淀，.细胞冻存:君帮井的细艳进行熔存的最隹方法是将细陋工干含有二甲基亚蝌B咨C）等冷昨保护剂的克全脂畀是中于液液中端存.冷冻保护恻可降生培养基的^点.并可魏域涉罪逮虞.大大降幅冰品祥成豹危险【冰品可损饰空胞-导致迪胞戏亡打注：DM5O可促进有机分子盅人能型a球忤客网SQ的成剂前.在珏用与就关物质安主危古旧适应的设啻如赛作规范.并应按黑省地法魏处置此更过剂..冷冻细胞解冻方案:以下实匿有塞介幽了玲摩鹑胞弟冻的一般魂程.理里的实宴方军一总厦参阅时附具辉细施国产金黄阻书「1，椅装有冷冻细检的旅存管从液敢春黑中取出.立即放人3rc水泡卬」2.在土产c水涵中轻密后动卷存曾，直至.东存管内铝票［余一小坡冰芯一使鸵胞迅谑解腺(1册内h3.帏选声省转明变层SiEiE风粉内•打开拉子前，用加州二酢感拭菇存管外的*4,杵豚蠢的挺胞急徜转用副餐有适・舒虹朝帮、诘告该潮胞恭酌完空主性招茫荃豹离心智的.%取大约2MM9的期心为辅纪陋悬液荐.心J1。分加.英麻国心速度和时间取决干细胞裨黄*&茗心后，检受上潘强是否不做，有无完整的瑁题讥定.再无的案件下小心倒融上酒液.不妻拽动细胞沉雉。才，轻轻将空需生新悬浮友完至生诋#:将基4-然后转移到合适的埸井容器和睢苻的堵养环境中口注:培养瓶尺寸取决于珍存曾东存的细胞数■，培养耳蜩决于珀胞和型宇基/型“.利用血球计数器进行细胞计数：匕用酒粕清清计热酒和盗君片b待计数他和黄酒片干片后.桂正侦片跌在情定位置a2收工罐怛.将10PL压强加到£1理计苴器上.不要噎明融焉出口1将计豌池工于倒置品德里第1口)［物镀F.住用相差模式以区分噩胞.工计黝U间有网居约大E塔(1mm-)内的壬袍数.下图中带期略的方整己席而冏圉出口播史曼致乘以1口“过为先金身用弄差所含的却胞数・应席笛现付辞吊，取而次计靓的邛均生.上方IMPftOVtb上方IMPftOVtbHFUfiAUEFi.台盼蓝拒染法:可按以下流程濮确测定细配存活率・细胞存活率的计算方法是用皿球计皴器网格内的活军能毁除以总细胞数。如果