免疫组织化学技术研讨课件

免疫组织化学技术

免疫组织化学技术

1免疫组织化学技术基本原理

通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原—抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。免疫组织化学技术基本原理2组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法组织与细胞材料的制备3组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作4切片的制作组织的固定组织石蜡包埋切片切片的制作组织的固定5目的:（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便

于辨认。组织材料的固定目的:组织材料的固定6固定液的选择：(1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中性缓冲福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂固定液的选择：7固定时间：固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。固定时间：8大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。组织石蜡包埋大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～1209切片载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。切片粘合剂的使用：

（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。

（2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）干净载玻片→丙酮5min→用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮）1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml（4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml切片载玻片的清洁：10切片：

石蜡切片：

(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片18h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)编上号

(6)切片可在4℃保存数年

冰冻切片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理

24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用切片：11细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内12细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最13免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学14荧光标记免疫组织化学

直接法间接法荧光标记免疫组织化学直接法15酶联免疫组织化学ABC法S-P法酶联免疫组织化学ABC法16免疫组化二步法免疫组化二步法17二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯18甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜19抗原修复方法真空负压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。

⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。

抗原修复方法真空负压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.320微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。

⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲21高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。

⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处22隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。

⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。

隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇23电炉加热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。

⑤待抗原修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选定的免疫组化染色方法进行染色。

电炉加热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲24胃蛋白酶消化法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④PBS洗3次，1分钟/次。

⑤滴上配制好或商品化的胃蛋白酶，处理切片20分钟左右。

⑥PBS冲洗3次，2分钟/次。

⑦后按选择好的免疫组化该法进行染色。

胃蛋白酶消化法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处25胰蛋白酶消化法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④PBS洗3次，1分钟/次。

⑤滴上自配的或商品化的胰蛋白酶，处理切片20分钟左右。

⑥PBS洗3次，2分钟/次。

⑦后按选好的免疫组化染色方法进行染色。

胰蛋白酶消化法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处26注意事项一、抗体的保存

浓缩抗体：有效期内，只需放在4℃冰箱内，保存时间可达1-3年。即用型抗体：理论上在4℃冰箱内可保存半年左右。

PBS或抗体稀释液稀释的抗体：一般只可放置1-2个月。注意事项一、抗体的保存27二、出现假阳性的原因

组织切片质量不佳，造成假象，如刀痕裂缝边缘的组织着色过深，不能作为判断阳性的依据。出血和坏死：红细胞的内源性过氧化物酶，坏死细胞释放的内源性过氧化物酶均可出现假阳性反应。抗体的交叉反应。二、出现假阳性的原因28三、出现假阴性的原因

固定时间过长，浸蜡、烤片温度过高，导致抗原丢失，无法补救。固定液不合适或浓度不对，导致固定不佳。最好使用10%中性福尔马林。抗体浓度过低。孵育时间太短，或孵育温度太低。缓冲液pH值不正确。三、出现假阴性的原因29免疫组织化学技术研讨30四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。五、DAB有致癌性，用后不应随处倒弃。四、必须严格设置阳性对照和阴性对照。31

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32免疫组织化学技术基本原理

通过免疫学中抗原抗体结合反应，用特异性抗体（单克隆或多克隆）检测组织、细胞内相应的抗原物质，形成抗原—抗体复合物；此复合物上带有事先标记的标记物，通过与标记物相对应的检测系统，如酶底物显色反应可使之呈现某种颜色，从而可检测组织细胞内的抗原，以达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。免疫组织化学技术基本原理33组织与细胞材料的制备免疫组织化学方法组织与细胞材料的制备34组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作组织冰冻切片制作细胞爬片制作细胞涂片制作组织与细胞材料的制备组织石蜡切片制作35切片的制作组织的固定组织石蜡包埋切片切片的制作组织的固定36目的:（1）防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（2）使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便

于辨认。组织材料的固定目的:组织材料的固定37固定液的选择：(1)甲醛固定液：10％福尔马林，10％中性福尔马林，10％中性缓冲福尔马林(2)4％多聚甲醛固定液(3)BouinS液及改良BouinS液(4)ZenkerS液(5)ZamboniS液(6)PLP固定液：过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛固定液。该固定剂较适合富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。(7)PLPD固定液取PLP固定液25ml，加入2.5%重铬酸25ml。(8)KanovskyS液(9)Methacarn固定液，对核内抗原的保存效果较好。(10)PEG液(11)0.4%对苯醌(12)碳二亚酰胺-戊二醛（ECG-G）液(13)丙酮及醇类固定剂固定液的选择：38固定时间：固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。固定时间：39大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～120min，95％醇Ⅰ2h，95％乙醇Ⅱ2h，95％乙醇Ⅲ过夜，无水乙醇Ⅰ30～60min，无水乙醇Ⅱ30～60min，无水乙醇Ⅲ60min～120min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各15min（可视观察结果而定），石蜡Ⅰ30min石蜡Ⅱ1～2h，石蜡Ⅲ2～3h。小组织：75％乙醇30min，85％乙醇30min，95％乙醇Ⅰ1h、Ⅱ1h、Ⅲ过夜或2h，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ各30min，二甲苯Ⅰ15min、Ⅱ10min、Ⅲ10min（肉眼观察），石蜡Ⅰ30min，石蜡Ⅱ30min，石蜡Ⅲ1～2h。组织石蜡包埋大组织：75％乙醇30～120min，85％乙醇30～12040切片载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片240℃烤2h。切片粘合剂的使用：

（1）多聚赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。

（2）APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）干净载玻片→丙酮5min→用镊子夹住浸入APES试剂（1ml+50ml丙酮）1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。（3）铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml（4）甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml切片载玻片的清洁：41切片：

石蜡切片：

(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。

(2)52－60℃烤片18h。

(3)切片厚2～4μm。

(4)切片刀要快

(5)编上号

(6)切片可在4℃保存数年

冰冻切片：(1)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组织需经庶糖处理

24h，冰冻切片。(2)冰冻切片后需凉干后立即固定(3)冰冻切片固定后-80℃保存备用切片：42细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内。待细胞生长达到60％以上后取出玻片。用4%的多聚甲醛固定2h以上。可加甘油封存置于零下20度保存。细胞爬片制作将处理好的盖玻片放入接种了细胞的培养瓶或六孔板内43细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最后用PBS将细胞重悬。吸取30－50ul（可根据细胞量调整）滴至处理过的载玻片上，然后涂抹均匀。待稍微风干以后加4％多聚甲醛溶液覆盖细胞，固定2－4小时。在细胞上加一层甘油放-20℃保存。细胞涂片制作离心将细胞收集出来，用预冷的PBS洗2－3遍，最44免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学免疫组织化学方法荧光标记免疫组织化学酶联免疫组织化学45荧光标记免疫组织化学

直接法间接法荧光标记免疫组织化学直接法46酶联免疫组织化学ABC法S-P法酶联免疫组织化学ABC法47免疫组化二步法免疫组化二步法48二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯49甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜50抗原修复方法真空负压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇真空负压处理5分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），真空负压干燥箱预先调至95℃，真空负压处理10分钟。

⑤待修复注降至室温的一，PBS洗3次，随后按选好的免疫组化染色方法进行染色。

抗原修复方法真空负压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.351微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH6.0），于微波炉内微波辐射10分钟，如检测Er和Pr则需要20辐射分钟左右。

⑤待修复液降至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学的染色方法进行染色。

微波辐射抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲52高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入抗原修复液中，边同容器放入高压锅中加热至沸腾。盖上压力阀至喷汽后持续1－4分钟。

⑤待修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选好的免疫组织化学染色方法进行染色。

高压抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处53隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④切片放入0.01M柠檬酸盐缓冲液（PH0.6）中，边同容器一起放入水溶锅中加热，其间应不断用温度计测其温度，待抗原修复液的温度达到有效温度后（92℃↑）。即开始计时，持续40分钟。

⑤待抗原修复液恢复至室温后，PBS洗3次，随后按选定好的免疫组化染色方法进行染色。

隔水热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇54电炉加热抗原修复法：

①切片脱蜡至水。

②0.3%H2O2甲醇处理切片10分钟。

③自来水洗，蒸馏水洗。

④将切片放入抗原修复液中于电炉上加热，不时用温度计测量温度，当达92℃后，即可拔离电源，当温度低于92℃时，再插上电源，如此反复持续至10分钟左右。

⑤待抗原修