乳清酸左卡尼汀对实验大鼠胃溃疡的治疗作用(一)

乳清酸左卡尼汀对实验大鼠胃溃疡的治疗作用(一)

作者：何健茹，王立军，苏玉虹【摘要】目的观察乳清酸左卡尼汀对胃溃疡的治疗作用，并探讨其抗溃疡的相关机制。方法大鼠胃溃疡造模,应用HE染色观察大鼠胃溃疡创面的愈合程度，Elisa法测胃溃疡组织IL-8，IL-10的表达情况;应用免疫组化法测胃溃疡组织EGF的表达情况。结果乳清酸左卡尼汀低剂量组25mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀中剂量组50mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀高剂量组100mg/(kg·d)对胃溃疡均有治疗作用，中剂量效果接近于奥美拉唑。乳清酸左卡尼汀能够降低组织MDA含量，增强SOD活性，通过抗氧化应激治疗溃疡。乳清酸左卡尼汀通过抑制胃溃疡组织炎症因子IL-8,10表达而起到抗氧化作用。乳清酸左卡尼汀的抗溃疡作用与其促进表皮生长因子(EGF)表达有关。结论乳清酸左卡尼汀对胃溃疡有治疗作用，其机制可能与抗氧化应激和促进EGF表达有关。【关键词】乳清酸左卡尼汀;胃溃疡;抗氧化应激;生长因子;大鼠TheTreatmentEffectandMechanismResearchofCarnitine-orotateonGastricAcidLeftHEJianru1,WANGLijun2,SUYuhong1(1.LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001China;2.ChongqingPoliceStation,Chongqing400020China)Abstract:ObjectiveToobservethetherapeuticeffectofCarnitine-orotateongastriculceranddiscusstherelevantmechanism.MethodsHEdyeingobservationwasappliedintotheratgastrichealingprocess.ElisatestIL-8,IL-10expression.ImmunohistochemicalmethodwasappliedtotesttheexpressionofEGF.Results①Carnitine-orotatecanhealgastriculcer.②Carnitine-orotatecanreduceMDAcontentoftheorganization,StrengthenSOD,Throughanti-oxidationstresstreatmentulcers.③Carnitine-orotateinhibitinflammatoryfactorIL-8,10expressionandplayaroleinanti-oxidation.④Carnitine-orotateresistanceandpromoteEGF.ConclusionsCarnitine-orotateiseffectivetotreatstomachulcersmainlythroughanti-oxidationstressesandpromotetheexpressionofEGF.Keywords:Carnitine-orotate;gastriculcer,antioxidantstress;growthfactor;rats左卡尼汀为一种氨基酸衍生物，是脂肪代谢必需的辅助因子，可促进脂质代谢，临床上一直用于降血脂治疗及调整胃肠道功能。随着对该药物研究的深入，近年研究发现，左卡尼汀有促进创伤愈合的作用，其机制为抗氧化作用。在此基础上，我们为左卡尼汀加入了一个乳清酸基团，形成了一种新的药物乳清酸左卡尼汀或左卡尼汀乳清酸盐。此药还处于实验室研制阶段，有研究发现左卡尼汀对急性肝损伤具有保护作用，但其作用于消化性溃疡至今未见报道。本实验旨在通过大鼠消化性溃疡动物模型，观察乳清酸左卡尼汀对消化性溃疡的治疗作用，并探讨相关机制，从而为乳清酸左卡尼汀的临床应用提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1动物与分组：健康SD雄性大鼠60只,体重为200g，由辽宁医学院动物实验中心提供。按完全随机设计法将其分成6组，每组10只,分别为：(1)正常对照组，无手术自由进食水;(2)胃溃疡模型组，手术后以1mL/100g生理盐水灌胃;(3)乳清酸左卡尼汀低剂量组25mg/(kg·d);(4)乳清酸左卡尼汀中剂量组50mg/(kg·d);(5)乳清酸左卡尼汀高剂量组100mg/(kg·d);(6)奥美拉唑组14mg/(kg·d)。SD大鼠给药剂量按动物与人体的每千克体重等效剂量折算系数计算(公式：大鼠日服药量=人日服药量×0.16)，灌胃容积最大为2mL/100g。1.1.2主要试剂及药品①乳清酸左卡尼汀，由锦州奥鸿药业有限责任公司提供;②奥美拉唑，由锦州九泰药业提供;③表皮生长因子(Epidermisgrowthfactor，EGF)、过氧化物歧化酶(Proliferatingcellnuclearantigen，SOD)检测试剂盒、丙二醛(MaleicDialdehyde，MDA)检测试剂盒，由武汉博士德生物工程有限公司提供;④ELISA检测试剂盒：上海西唐生物科技有限公司;⑤紫外分光光度计：日本岛津。1.2方法1.2.1动物造模：按照文献用乙醚麻醉然后将固定于手术台上,剪掉腹壁毛，常规消毒后，剑突下腹壁正中切口2～2.5cm暴露全胃，在胃体部与幽门窦交界处将微量注射器平刺入浆膜下0.4～0.5mm注入体积分数为10%醋酸0.05mL形成丘疹,将胃送回腹腔,缝合腹壁，消毒伤口。术后2～3h内均清醒过来，60只大鼠随机分成6组(除外正常对照组)，造模周期为2天，第3天开始给药。乳清酸左卡尼汀高、中、低剂量治疗组、奥美拉唑组分别以1mL/100g的容积按上述药物剂量配成悬浊液给药，模型组以1mL/100g的生理盐水灌胃，正常对照组自由饮食，连续给药10天。1.2.2取材：大鼠在连续灌胃给药10天后，于末次给药后禁食24小时，自由饮水，12天将大鼠麻醉后颈动脉取血，分离血清并取材。以溃疡部位为中心修剪胃壁组织，以溃疡瘢痕平行于胃长轴方向的最长径为中心取材，切取含溃疡边缘约3mm组织在内的溃疡组织块(正常组在胃前壁近幽门处取组织)组织块约1.0cm×1.2cm大小，分成两部分。一部分体积分数为0.10的中性甲醛固定，按照常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5μm厚度连续切片，分别作HE染色和免疫组化使用;另一部分迅速放入EP管内放入-80℃冰箱内储存，以备SOD、MDA和ELISA检测IL-8，10表达的使用。1.2.3HE染色：取以上各组大鼠胃组织切片进行HE染色，主要步骤如下:石蜡切片常规脱蜡至水(二甲苯I10min→二甲苯Ⅱ10min→体积分数为1.00的乙醇I5min→体积分数为1.00的乙醇Ⅱ5min→体积分数为0.95的乙醇I5min→体积分数为0.95的乙醇Ⅱ5min→体积分数为0.90的乙醇5min→体积分数为0.80的乙醇5min)→自来水冲洗1min→Harris苏木素染液3～5min→流水冲洗1～2min→盐酸酒精分化30～45s→流水冲洗10～20min至返蓝→伊红染液复染30～45s→梯度酒精脱水(体积分数为0.80的乙醇5min→体积分数为0.90的乙醇5min→体积分数为0.95的乙醇I5min→体积分数为0.95的乙醇Ⅱ5min→体积分数为1.00的乙醇I5min→体积分数为1.00的乙醇Ⅱ5min)，二甲苯透明(二甲苯I10min→二甲苯Ⅱ10min)，中性树胶封片。光学显微镜下观察各组的病理学变化。1.2.4免疫组织化学检测EGF表达：取切片常规脱蜡按照免疫组化试剂盒说明书操作，DAB显色20min，自来水充分冲洗，苏木素复染、脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。棕黄色颗粒状为阳性细胞。1.2.5组织中SOD、MDA含量测定：按SOD、MDA试剂盒操作。1.2.6酶联免疫吸附测定IL-8和IL-10的含量(enzyme-liknedimmunosobrentassay,ELISA)。1.3统计学分析应用SPSS13.0软件进行统计分析，形态学指标进行描述性统计分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，进行单因素方差分析及LSD检验。2结果2.1光镜观察结果2.1.1乳清酸左卡尼汀高剂量组100mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀中剂量组50mg/(kg·d)、乳清酸左卡尼汀低剂量组25mg/(kg·d)、奥美拉唑组均可见不同程度的愈合，乳清酸左卡尼汀组的粘膜腺体排列较为整齐且密集，炎性细胞明显减少，可见新生的腺体覆盖溃疡和增生的纤维结缔组织，溃疡底部有明显肉芽组织形成，胃黏膜血管轻度扩张、充血。乳清酸左卡尼汀低剂量组25mg/(kg·d)黏膜溃疡清晰可见，愈合不是十分显著。模型组部分区域黏膜坏死、脱落，局部腺体破坏明显且排列极不规则，正常对照组大鼠的胃窦壁结构完整，黏膜腺体排列整齐，见图1。2.2EGF的阳性表达EGF阳性细胞的细胞膜、胞浆着色均为棕黄色，EGF主要定位于细胞质，阳性表达以胃黏膜的壁细胞、颈部细胞为主。EGF免疫组化染色结果显示，对照组EGF表达呈弱阳性，奥美拉唑组表达为阳性，乳清酸左卡尼汀高剂量组100mg/(kg·d)表达最强，未治疗模型组与乳清酸左卡尼汀低剂量组25mg/(kg·d)表达最弱(图2)。2.3大鼠胃组织和血清中丙二醛(MDA)含量从表1可见，空白对照组，乳清酸左卡尼汀高剂量组100mg/(kg·d)MDA含量与模型组比较差别有显著性(P0.01)。2.4大鼠胃组织和血清中超氧化物歧化酶(SOD)含量3讨论消化性溃疡(PU)主要以上腹部反复疼痛，消化道粘膜、肌层和/或浆膜层受到损害为特征，包括胃溃疡(Gastriculcer，GU)和十二指肠溃疡(Duodenalulcer，DU)，发病机制较为复杂，迄今仍末完全阐明，一般认为主要与粘膜的防御因子(胃粘液-粘膜屏障、内源性前列腺素、粘膜血流等)和攻击因子(胃酸、胃蛋白酶、Helicobacterpylori幽门螺杆菌感染[1]、药物)失衡有关。其中GU主要是防御因子削弱所致，而DU主要是攻击因子增强造成。近年研究结果表明，体内自由基过多可引起机体组织细胞损伤，导致多种疾病发生、发展甚至死亡。自由基是生物体产生并损害自身的毒性产物[2]，可引起脂质过氧化反应，产生脂质过氧化物，其中以MDA毒性作用最大，它的含量反映机体脂质过氧化的速率及强度，可间接反应组织受自由基损伤的程度，因此MDA是胃粘膜的攻击因子之一。SOD是一种重要的抗氧化酶，可以清除超氧阴离子自由基，保护生物体免受自由基的攻击，对机体的氧化及抗氧化平衡起着至关重要的作用，因此SOD是胃粘膜的保护因子之一，其活力的高低间接反映了机体清除自由基的能力[3]。SOD和MDA可间接反应自由基代谢水平。当胃粘膜损伤时，表现为SOD的活性降低，MDA的含量升高。增强自由基清除能力，如增加SOD浓度或降低MDA含量，对胃粘膜可起到保护作用[4]。本实验结果显示，乳清酸左卡尼汀能提高乙酸性胃溃疡大鼠血清和胃组织中超氧化物歧化酶(SOD)的含量，降低MDA水平，从而消除氧自由基，消减过量的超氧阴离子对胃粘膜的损伤，提示该药可提高机体抗氧化和清除自由基能力，抑制脂质过氧化反应，改善自由基代谢，能有效地对乙酸诱发胃溃疡大鼠粘膜起到促进愈合作用，对于胃溃疡病也是一种有效的制剂，这些结果为其用于治疗消化性溃疡提供了实验依据。本研究证实，乳清酸左卡尼汀将IL-8，10表达下调，通过抗氧化作用抑制了胃黏膜炎症反应，增强了胃黏膜的屏障功能从而促进溃疡愈合，对溃疡有明显治疗作用。分子生物学研究发现溃疡的愈合是一个增殖或移形上皮细胞和结缔组织成分去补充已损坏或坏死粘膜复杂的主动过程[5]。要达到相当的溃疡愈合质量，将对治疗药物提出更高要求。而生长因子就是其相对应的受体结合从而刺激增殖、维持活力的一类细胞因子[6]。EGF能明显促进表皮细胞生长，还能刺激间质细胞和内皮细胞的生长分化，在机体的整个生长、发育和分化过程中都离不开EGF的参与[7]。本实验证实，乳清酸左卡尼汀将EGF表达上调。EGF对消化道粘膜有明显保护作用，且通过促进溃疡边缘上皮组织增殖、分化从而促进溃疡愈合，对溃疡有明显治疗作用。本研究从分子生物学方面揭示了乳清酸左卡尼汀抗胃溃疡到治疗作用及其作用机制。由于消化性溃疡病因极其复杂[8]，机体的精神因素、生活习惯都可导致胃溃疡的发生[9]，乳清酸左卡尼汀是否抗HP，以及抗溃疡作用与机体免疫功能调节有何关系等，还有待进一步研究。【参考文献】

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[4]吴海默，孙玉华.枸橼酸铋雷尼替丁与奥美拉唑根除幽门螺