时间分辨荧光免疫技术培训课件整理

主要内容时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。TRF的标记物及特点。为什么叫“时间分辨”?TRF在免疫分析方法学中的地位。各种免疫方法学的比较。临床应用主要内容时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。1回顾标记免疫学发展放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶联免疫 （精度：10-9mol/L）胶体金标记 （金标：10-15mol/L）化学发光 （精度：10-15mol/L）电化学发光 （精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）生物芯片回顾标记免疫学发展放射免疫 （精度：10-12mol/L）2时间分辨荧光技术

（Time-ResolvedFluorescence）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA）时间分辨荧光核酸探针分析时间分辨荧光细胞活性分析时间分辨荧光探针分析时间分辨荧光技术

（Time-ResolvedFluo3时间分辨荧光技术原理（TRF）用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨荧光技术原理（TRF）4时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolvedFluo5时间分辨荧光免疫试剂

工作原理示意图时间分辨荧光免疫试剂

工作原理示意图6微量反应孔包被好的表面抗体微量反应孔包被好的表面抗体7表面抗原表面抗原8V标记物轻链螯合剂Eu重链V标轻链螯合剂Eu重链9VV10VV11HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH12HH13时间分辨荧光免疫技术培训课件整理14标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)镧系元素荧光特点：荧光寿命极长镧系元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100us样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。Stokes位移大（大约290nm）铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为28nm荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615±5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有15利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0时间分辨荧光免疫原理图利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧16利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的17DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零背景、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记标记位点多，可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间18灵敏度更高，检测范围更广以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书试剂 DELFIA ImmuliteACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L

TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/mlFSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml

Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml

灵敏度更高，检测范围更广19时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，0.5120放射性免疫分析法（RIA）应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。缺点放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。放射性免疫分析法（RIA）应用缺点21酶免疫分析法（ELISA）应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术曾经一度被认为是取代放免的检测手段。缺点灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。酶免疫分析法（ELISA）应用缺点22化学发光免疫分析法（CLIA）应用单个样本检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。分类：以丫啶酯直接标记—ACS180系统以HRP标记，鲁米诺为发光底物—Amerlite系统以AP为标记物，AMPPD为发光底物—Immulite系统缺点发光过程短，样品不能重复检测。本底较高，易受环境物质干扰。仪器故障率较高。试剂稳定性较差，需多次定标。检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂；试剂价格高。化学发光免疫分析法（CLIA）应用缺点23电化学发光免疫分析法（ECL）应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。基本原理：根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。缺点非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。电化学发光免疫分析法（ECL）应用缺点24时间分辨荧光免疫的试剂种类内分泌科检查甲状腺系列： TSH，UltraTSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG糖尿病系列： Insulin，C-Peptie生长激素类： hGH其他： Cortisol妇产科检查FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG肿瘤科检查AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211*遗传科检查产前筛查： hAFP/HCG，PAPPA新生儿筛查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCR检测。肝炎系列甲肝，乙肝，丙肝血液科检测贫血检查： Ferritin，VitB12，Folicacid白血病： 免疫细胞分型等细胞学检查细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目酶类检测及细胞受体检测（包括MHC，HLA等多种检测）科研工具单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测时间分辨荧光免疫的试剂种类内分泌科检查25时间分辨荧光免疫---突出优点零本底、灵敏度高线性范围宽试剂有效期长标准曲线稳定性好易于自动化TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命。时间分辨荧光免疫---突出优点零本底、灵敏度高26时间分辨荧光与化学发光方法学比较 时间分辨荧光

化学发光发光效率 95% 1% 重复检测 可无数次 不可重复 本底噪声 零本底 干扰大灵敏级数 10-18 10-15标记物 原子 大分子化合物 标记位点 可达20个/抗体 1个/抗体 标准曲线 稳定达一年以上 稳定2到4周 多标记 有，最多可达四标记 无科研开发 有 无时间分辨荧光与化学发光方法学比较 时间分辨荧光27时间分辨荧光和电化学发光的比较

时间分辨荧光

电化学发光标记物 四种原子:Eu,Sm,Te,Dy 一种原子:钌多标记技术 有 无做科研 能(1000多种科研项目) 无试剂种类 58种临床,24种科研,共82种 28种临床,无科研试剂试剂价格 低 高时间分辨荧光和电化学发光的比较 时间分辨荧光 电化学发28泰莱—I时间分辨荧光免疫分析系统泰莱—I时间分辨荧光免疫分析系统29泰莱—I时间分辨荧光免疫分析系统高灵敏度 10-17mol/孔(Eu3+)线形范围宽 10-13mol/孔—10-19mol/孔快速测试 1秒/一个样品测试灵活 可以测试任意1-96个孔，样品摆放位置不受限制标本量灵活随机配置泰莱—I全中文测试分析软件 界面简明友好，随意进行项目的选择和参数筛选泰莱—I时间分辨荧光免疫分析系统高灵敏度30 谢谢各位光临！

敬请各位指出不足并多提建议 谢谢各位光临！

敬请各位指出不足并多提建议31谢谢！谢谢！32时间分辨荧光免疫技术培训课件整理33主要内容时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。TRF的标记物及特点。为什么叫“时间分辨”?TRF在免疫分析方法学中的地位。各种免疫方法学的比较。临床应用主要内容时间分辨荧光免疫技术（TRF）定义。34回顾标记免疫学发展放射免疫 （精度：10-12mol/L）酶联免疫 （精度：10-9mol/L）胶体金标记 （金标：10-15mol/L）化学发光 （精度：10-15mol/L）电化学发光 （精度：10-17mol/L）时间分辨荧光（精度：10-18mol/L）生物芯片回顾标记免疫学发展放射免疫 （精度：10-12mol/L）35时间分辨荧光技术

（Time-ResolvedFluorescence）时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）时间分辨免疫荧光分析（TRIFMA）时间分辨荧光核酸探针分析时间分辨荧光细胞活性分析时间分辨荧光探针分析时间分辨荧光技术

（Time-ResolvedFluo36时间分辨荧光技术原理（TRF）用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点（特异性强、荧光光谱的Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨荧光技术原理（TRF）37时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolvedFluorescenceImmunoassay）时间分辨荧光免疫原理图（Time-resolvedFluo38时间分辨荧光免疫试剂

工作原理示意图时间分辨荧光免疫试剂

工作原理示意图39微量反应孔包被好的表面抗体微量反应孔包被好的表面抗体40表面抗原表面抗原41V标记物轻链螯合剂Eu重链V标轻链螯合剂Eu重链42VV43VV44HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH45HH46时间分辨荧光免疫技术培训课件整理47标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种：铕(Eu)、钐（Sm)、镝(Dy)、锝(Te)镧系元素荧光特点：荧光寿命极长镧系元素螯合物（60~900us)<铕：714us>普通荧光免疫中荧光团：1~100us样本中蛋白质荧光：1~10us，易猝灭。Stokes位移大（大约290nm）铕：发射光613nm、激发光340nm，荧光素的Stokes位移为28nm荧光特异性强。（发射光谱带很窄：615±5nm）解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍标记物为具有独特荧光特性的稀土金属---镧系元素镧系元素共有48利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0时间分辨荧光免疫原理图利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧49利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的又一保障发射光谱与激发光谱间存在的巨大Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。利用镧系元素光谱特点，将发射荧光与激发荧光分辨开来，零本底的50DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间分辨光谱分辨特异性荧光与非特异性荧光分离发射荧光与激发荧光分离零背景、高特异性解离-增强荧光性大大提高稳定的荧光螯合物线性范围更宽重复性更好原子标记标记位点多，可达20个对标记物结构及活性影响小无衰变受环境影响小高稳定性，高精确度试剂保质期至少一年标准曲线保留时间长同一批次只需两点定标多标记单，双，三，四标记同一试剂盒可同时测多个项目DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术特点检验先进性时间51灵敏度更高，检测范围更广以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书试剂 DELFIA ImmuliteACS-180 AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L

TSH 0.005-100μU/ml 0.002-75μU/ml 0.03-150μU/mlFSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml

Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/ml

灵敏度更高，检测范围更广52时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5125102050100200500 U/L51002000Cps.103DELFIAhFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，0.5153放射性免疫分析法（RIA）应用放免自60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。缺点放射性（125I），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）125I的半衰期短而导致其试剂有效期短。标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。操作繁琐，出报告时间长。无法保存备用。放射性免疫分析法（RIA）应用缺点54酶免疫分析法（ELISA）应用酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。试剂有效期较长。衍生技术：荧光酶免疫分析增强化学发光酶免疫技术曾经一度被认为是取代放免的检测手段。缺点灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性不好。酶免疫分析法（ELISA）应用缺点55化学发光免疫分析法（CLIA）应用单个样本检测速度快，适合做急诊。灵敏度较高。自动化程度高。分类：以丫啶酯直接标记—ACS180系统以HRP标记，鲁米诺为发光底物—Amerlite系统以AP为标记物，AMPPD为发光底物—Immulite系统缺点发光过程短，样品不能重复检测。本底较高，易受环境物质干扰。仪器故障率较高。试剂稳定性较差，需多次定标。检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。非开放性试剂；试剂价格高。化学发光免疫分析法（CLIA）应用缺点56电化学发光免疫分析法（ECL）应用80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。基本原理：根据三联吡啶钌[Ru(bpy)3]和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。缺点非开放性试剂系统、不能做科研。试剂价格过高。电化学发光免疫分析法（ECL）应用缺点57时间分辨荧光免疫的试剂种类内分泌科检查甲状腺系列： TSH，UltraTSH，T3，T4，FT3，FT4，TBG，TG糖尿病系列： Insulin，C-Peptie生长激素类： hGH其他： Cortisol妇产科检查FSH，LH，HCG，ProlactinE2，E3，Testo，Prog，SHBG肿瘤科检查AFP，CEA，PSA，hTG，β-2Micro，NSE，PAP，PSA（Free/Total），PSAEQM，CA-50，CA-125，CA-199，CA-153*，CA-724*，CY-211*遗传科检查产前筛查： hAFP/HCG，PAPPA新生儿筛查： Neo-TSH，Neo-T4，Neo-IRT，Neo-17a-OHProg，PKU核酸探针及基因杂交检测，多标记定量PCR检测。肝炎系列甲肝，乙肝，丙肝血液科检测贫血检查： Ferritin，VitB12，Folicacid白血病： 免疫细胞分型等细胞学检查细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目酶类检测