分子生物学实验流程及相关课件

分子生物学实验流程及相关试剂、仪器概述GENECOMPANYLTD分子生物学实验概述生物样品（细胞、组织、细菌）细胞调节神经科学分子诊断DNA分离RNA分离质粒DNA噬菌体DNA基因组DNA总RNAmRNAcDNA重组DNAPCR遗传鉴定DNA测序DNA标记突变基因表达分子生物学实验概述（续）基因表达报告基因载体基因转化报告基因检测真核转录体外转录翻译蛋白蛋白分析蛋白分离实验起始材料的选取和准备常规材料组织器官原生质体\细胞细菌\真菌\酵母特殊材料少量起始材料特殊病变组织亚细胞结构实验起始材料的选取和准备水稻卵细胞的分离分离准备工作材料的速冻长期保存人工气候箱、制冰机超净工作台、显微操作系统RNase-free耗材、液氮罐超低温冰箱RNase抑制剂卵细胞mRNA的提取、纯化Oligotex系列试剂盒细胞裂解匀浆去蛋白和细胞残渣温浴并结合洗脱去盐和回收旋涡混匀器离心机恒温水浴锅离心机、旋涡混匀器200℃烘箱DEPC、RNase-freeDNaseI、RNase-free耗材目标片段的克隆和分析利用SMARTcDNA文库构建试剂盒构建水稻卵细胞cDNA文库目标基因的获得通过噬菌体载体自切割或T-Vector、平末端载体克隆获得目标质粒利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因测序目标基因的克隆利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文库目标基因的筛选利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出目标基因通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的目标基因利用PCR技术获得目标基因利用GSP，以文库为模板通过PCR扩增出目标基因，并通过电泳、凝胶成像系统检测利用文库载体序列和已知的目标基因的序列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并通过电泳、凝胶成像系统检测包含有目标基因的质粒的获得对于通过筛库技术获得的目标基因通过噬菌体载体的自切割作用生成目标质粒对于通过PCR技术获得的目标基因通过回收纯化后利用T载体等克隆并转化细菌铺板培养后通过蓝白斑，原位裂解杂交分离出含有目标质粒的单个菌落对于通过PCR技术获得的目标基因PCR或RACE电泳凝胶成像系统长波紫外观察箱切胶胶回收试剂盒T载体、平末端载体转化细菌并铺板培养筛选目标菌落提取目标质粒对于通过PCR技术获得的目标基因PCR或RACE琼脂水平电泳凝胶成像系统、手提紫外灯长波紫外观察箱PCR回收试剂盒胶回收试剂盒PCR仪电泳仪器恒温水浴锅、离心机Taq酶、薄壁管、矿物油琼脂糖对于通过PCR技术获得的目标基因（续）纯化产物PCR产物测序T载体、平末端载体连接细菌转化、铺板培养蓝白斑筛选、菌落原位杂交质粒提取、酶切分析、测序测序仪低温冰箱杂交箱、恒温摇床、低温冰箱超净工作台、电转化仪离心机、恒温水浴锅感受态细胞、培养基、抗生素X-gal、IPTG、尼龙膜和探针限制性内切酶质粒提取、分析常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙醇沉淀质粒DNA质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利用过滤柱纯化出质粒DNA质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制性内切酶在水浴锅中进行酶切电泳，用凝胶成像系统分析测序水稻各器官TotalRNA的提取、纯化和分析分离所需的水稻各器官组织，并利用Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA：将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电泳检测总RNA的质量利用特异性的探针，通过Northernblotting检测目标基因在各器官的表达情况Southernblotting和NorthernblottingSouthernblotting基因组DNA完全消化探针制备琼脂水平电泳比活性测定印迹转膜DNA交联限制性内切酶、恒温水浴锅手提紫外灯、电泳仪器真空转膜仪紫外交联仪同位素检测仪探针制备试剂盒尼龙膜克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功能分析

克隆化基因的表达表达蛋白的纯化

功能分析克隆化基因的表达基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一致的DNA片段（通过测序确证）体内表达：选择合适的表达载体插入目标片段。利用化学方法或电转化仪等手段转入细胞表达体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等目标蛋白功能分析抗体的制备：多抗、单抗DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交系统、噬菌体表面展示技术等蛋白体内表达研究Westernblotting：利用抗原-抗体反应，对蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定量免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织细胞内的表