主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第十七章流式细胞仪分析技术及应用

资料收集于网络，如有侵权请联系网站删除资料收集于网络，如有侵权请联系网站删除只供学习与交流只供学习与交流第十七章流式细胞仪分析技术及应用流式细胞术化特性进行多参数定量分析和分选的新技术。流式细胞仪的发展综合了激光技术、计算机技术、显微荧光光度测定技术、流体喷射技术、分子生物学和免疫学等多门学科的知识。第一节概述可对细胞悬液中的单个细胞或特定细胞或其超微结构进行多参数快速分析，带分选系统的流式细胞仪还可按实验设计要求分选出具相同特征的同类型细胞，用于培养或进一步研究。流式细胞术所具有的分析和分选功能主要涉及光学原理、光电转换原理和测试原理三部分。一、工作原理利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析的精确性。散射光的测定散射光信号的产生是细胞在液柱中与激光束相交时向周围360强弱与细胞的大小、形状、光学同性、胞内颗粒折射有关，与接收散射光的方向也有关。流式细胞仪中涉及的散射光信号分为前向散射光和侧向散射光。（一）前向散射光激光束照射细胞时，光以相对轴较小的角度向前方散射讯号。在FSFS（二）侧向散射光激光束照射细胞时，光以9090信号的强弱与细胞或其他颗粒形状及粒度成正比。SS用于检测细胞内部结构属性，可获得有关细胞内超微结构和颗粒性质的参数。二、荧光测量定一个细胞上的多个不同特征。三、细胞分选5000/秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。该得率与分选的速度密切相关，当分选速度过高，会使部分目的细胞漏检，使得率下降；分选速度降低，目的细胞信号被检时间增加，得率增加。学特性密切相关。分选收获率：是指设定通过测量点的分选细胞与实际收获的分选细胞之间的比率。收获率的高低同样求分选的细胞纯度高，收获率相对低，当被要求分选的细胞收获率高，其纯度就相对降低。第二节数据的显示与分析一、参数（一）前向散射光（FS）：反映颗粒的大小。（二）侧向散射光（SS）：反映颗粒内部结构复杂程度、表面的光滑程度。（三）荧光（FL）：反映颗粒被染上荧光部分数量的多少。二、数据显示方式（一）单参数直方图：一维资料中最多使用的图形，由一维参数（荧光或散射光）反映同样荧光强度的颗粒数量的多少，可用于定性、定量资料的分析。（二）测细胞的两个测量参数，根据这两个测量参数，就可确定细胞在双参数散点图上的表达位置。（三）能，这意味着这一类散点图的三维坐标均为参数（散射光或荧光）方式，同样可以做全方位旋转以便仔细观察。（四）光信号和散射光信号可以根据需要进行组合分析以获得所需的信息，这就是流式细胞仪的多参数分析。第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备（一）新鲜实体组织单细胞悬液的制备：最常用的方法有机械法、酶处理法、化学试剂处理法和表面活性剂处理法等方法。（二）聚甲醛保存法。二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色，荧光信号来自料的选择和标记染色都是保证荧光信号产生非常关键的技术指标。（一）免疫荧光标记最常用的荧光染料和藻红蛋白类（phycoerythrin，PE）罗丹明。异硫氰酸荧光素（FITC）：FITC德州红：与生物素偶联的抗体有很强的亲和力，产生红色荧光。藻胆蛋白类：用于荧光分析和标记各类抗体的最常用荧光染料，主要包括藻红蛋白白（PC）、别藻青蛋白（APC）三类。多发生橙色至红色荧光。（二）免疫荧光标记通常应用的标记染色为直接免疫荧光染色和间接免疫荧光染色两种方法。（三）细胞自发荧光三、免疫胶乳颗粒技术的应用“液相芯片”技术是胶乳颗粒在流式细胞分析中的应用，流式微球阵列表。第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析（一）T淋巴细胞及其亚群的分析外周成熟的T细胞特有的标志TCR和CD3是重要的表面抗原，再按CD分子表达不同将T细胞分为CD4+和CD8+两大亚群，又称为辅助性T细胞（Th）和细胞毒性T细胞（Tc）。采用三色标记单克隆荧光抗体，用FCM检测，可对T细胞及亚群作出精确分类。（二）B淋巴细胞及其亚群的分析外周血中成熟的B细胞特有的重要标志为BCR，即膜表面免疫球蛋白（Smlg），属于B细胞特有或涉及B细胞的CD分子有29种。成熟的B细胞主要表达CD19、CD20、CD21、CD22分子，同时检测CD5分子，可进一步将外周成熟的休止B细胞分为B细胞和B细胞。1 2（三）NK细胞分析正常人外周血中成熟的NK细胞约10%左右，目前临床上常用三色荧光抗体标记将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞确定为NK细胞。二、淋巴细胞功能分析需采用细胞内细胞因子测定或体外培养后细胞的标记染色进行淋巴细胞检测，如：细胞介导细胞毒性试验细胞内细胞因子测定三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型FCM在淋巴瘤及血液病的发病机制、诊断、治疗和预后判断方面都具有重要的价值。四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中的应用艾滋病又称获得性免疫缺陷综合征是由人类免疫缺陷病毒T淋巴细胞亚群中的CD4+T辅助细胞，使ThAIDS患者的一个特征性免疫诊断指标表现为：T淋巴细胞总数减少，T细胞亚群CD4Th/CD8Tc比例倒置，Th/Tc＜1.0，Th细胞数量显著下降甚至测不出，而Tc细胞数量可正常或增加，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则处于正常范围。HIVThHIVTcTc者，其体内CD4+Th细胞水平下降迅速，条件致病微生物的感染率也同时增加，对TcCD4+ThAIDSAIDSTh1Th2HIVAIDS。六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析HLA-B27七、移植免疫中的应用移植免疫中的FCM应用主要包括流式细胞术的交叉配型（FCXM）和群体反应性抗体（PRA）检测。下列英文缩写代表辅助性T细胞的是A.TsB.ThC.TcD.TdE.Tcs『正确答案』B『答案解析』辅助性T细胞