BHK―21细胞生物反应器悬浮培养参数研究

BHKH21细胞生物反应器悬浮培养参数研究摘要：使用国产BC-7L生物反应器对BHK-21细胞悬浮培养参数进行了初步研究。通过对培养液血清含量、pH、溶氧和搅拌转速逐一进行优化研究，最终确定了BHK-21细胞悬浮培养的最佳参数为：血清浓度为5%,pH为7.40、DO为50%,搅拌转速为100r/min。关键词：生物反应器；BHK-21细胞；悬浮培养动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用。近几十年来，随着生物工程和组织工程学的发展，相应的生物反应器水平也在不断提高，现已研制由多种不同用途、型号的动物细胞生物反应器，其性能也日趋完善，种类越来越多，规模越来越大，在国外，已放大到5000-10000L。悬浮培养技术最大优势是通过更为精确有效的工艺控制手段，在获得最大产量的同时能稳步提高产品的质量。由于动物细胞在悬浮培养过程中对培养基和培养条件要求很高，不易达到最佳生长状态，故本研究对生物反应器悬浮培养BHK-21细胞的培养条件进行了研究，以期使BHK-21细胞达到最佳生长状态，为后续规模化生产提供参考。1材料和方法实验材料BHK-21细胞，新生牛血清（四季青），DMEM（GBIC。,NaHC03,消泡齐I」。仪器设备BC-7L生物反应器，为广州齐志生物工程设备有限公司产品。实验方法BHK-21悬浮细胞制备取BHK-21贴壁细胞种进行复苏，待细胞长满单层并生长状态良好时，用0.25%胰酶消化，之后用移液管轻轻吹打成单个细胞悬浮液，以0.5X106个/mL的密度接种300-1000mL摇瓶中，于90r/min恒温摇床培养。连续培养5代后，进行上罐培养。血清含量对悬浮细胞培养的影响将摇瓶BHK-21细胞以0.5X106个/mL的密度接种至5生物反应器中进行培养，培养过程中血清含量分别调整2%、5%、10%三个浓度进行培养，培养过程中对各浓度细胞取样计细胞数并观察细胞形态。培养液pH对悬浮细胞培养的影响在保持其它培养条件不变的情况下，分别设置DMEM培养液pH为7.0-7.2、7.4、7.4-7.6、7.6-7.8进行平行实验。37c培养48h后，取样进行细胞计数并观察细胞形态。.4培养液溶氧（DO）对悬浮细胞培养的影响在保持其它参数不改变的情况下，分别设置溶氧为40%、50%、60%、70%、80%,同样培养48h后取样计细胞数并观察细胞形态。.5搅拌转速对悬浮培养细胞的影响在同样其它的参数条件下，只通过改变搅拌的转速来观察，转速对细胞形态的影响。分别设置转速为40r/min、70r/min、100r/min。2结果血清含量对悬浮BHK-21生长的影响对三个血清浓度下培养的细胞进行取样观察和细胞计数结果显示：2%血清浓度下，细胞生长极其缓慢，细胞密度显著低于另外两组；血清浓度为5%时，细胞生长良好，细胞密度显著高于2%组，但田M氐于10%血清浓度；10%血清浓度组，细胞生长好，细胞数最多。培养液pH对悬浮BHK-21生长的影响pH在一定小范围内变化，对细胞生长并不会产生大的影响，但如果变动幅度较大，则会造成细胞生长缓慢，状态不好。实验结果显示pH为7.4时，细胞生长最佳。DO对悬浮BHK-21生长的影响溶氧低，不足以维持细胞生长，溶氧高会增加02通入量，造成生产成本提高。从实验结果分析，50%的溶氧效果最好。搅拌转速对BHK-21生长的影响40r/min条件下，转速不足以提供足够的力量使细胞悬浮起来，观察到反应器底部沉积了较多的细胞；将转速提高至70r/min,细胞虽然不会再沉积到反应器底部，但是取样观察发现有较多的细胞聚集成团；继续提高转速至100r/min,细胞聚团情况得到解决，细咆生长良好。100r/min为最佳搅拌转速。3结论与分析1）实验过程中，发现摇瓶转接生物反应器的时候，细胞密度不可过低，从本实验结果显示，如果当细胞密度低于2X105个/mL时，细胞生长则十分缓慢，有资料显示如果培养基与细胞的容积比例大于2000:1,生长物质弥散到细胞外过多，将使细胞内浓度低于最小限度的浓度，此时细胞不能再增殖，培养基的pH值变碱，抑制细胞生长，甚至引起细胞死亡等。2）虽然血清浓度为10%时，细胞数高、状态好，但是与血清浓度为5%时相比，差异并不太大，综合考虑生产成本，应选择血清浓度为5%为最佳血清浓度。另外，所使用的血清质量也会影响细胞的生长状态，一般质量较好的血清在融化后呈透明、淡黄色，并且无支原体、病毒及其它微生物污染。血清浓度高有利于细胞分裂，细胞生长较快，但是高浓度的血清成分比较复杂，对后续的纯化不利，且价格较高，质量不稳定，因此选择开发和使用低血清培养基和无血清培养基成为未来的需求。3）细胞聚集成团对细胞生长状态具有严重影响。如果结团严重，处于细胞团中间的细胞则会吸收营养物质不足，生长速度降低，从而