血红素加氧酶1的表达对实验性肝硬化内毒素血症大鼠的影响

血红素加氧酶1的表达对实验性肝硬化内毒素血症大鼠的影响

【摘要】nbsp;nbsp;目的：探讨血红素加氧酶1(HO1)的表达对实验性肝硬化内毒素血症大鼠的影响。方法：32只健康雄性wistar大鼠，随机分为4组，正常＋脂多糖(LPS)(对照组)、肝硬化＋生理盐水对照组(TAA组)、肝硬化＋LPS组(TAA＋LPS组)、肝硬化＋LPS＋hemin(

作者：刘晓华，师水生

作者单位：(山西医科大学第二医院，山西太原030001)【摘要】

目的：探讨血红素加氧酶1(HO1)的表达对实验性肝硬化内毒素血症大鼠的影响。方法：32只健康雄性wistar大鼠，随机分为4组，正常＋脂多糖(LPS)(对照组)、肝硬化＋生理盐水对照组(TAA组)、肝硬化＋LPS组(TAA＋LPS组)、肝硬化＋LPS＋hemin(氯化高铁血红素)(HM组)。用硫代乙酰胺(TAA)诱导肝硬化模型时间共计10周，对照组自由饮清水。于模型造成后，向对照组、TAA＋LPS组、HM组大鼠腹腔内注入LPS3mg/kg；TAA组大鼠腹腔内注入等量的生理盐水；HM组于注射LPS12h前，腹腔注射HM(40mg/kg)，并在注入LPS6h后，各组动物经腹主动脉穿刺采全血观察血浆中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨基酸转移酶(AST)、一氧化氮(NO)及丙二醛(MDA)的表达。留肝组织用免疫组织化学法观察HO1的表达。结果：对照组、TAA组、TAA＋LPS组、HM组血浆中的ALT/AST、MDA、NO依次升高差异有显著性(P＜0.05)，对照组、TAA、TAA＋LPS、HM组各组大鼠的灰阶值显著依次降低，且有明显差别(P＜0.05)。结论：在实验性的肝硬化内毒素中尽管HO1的表达增加，但它未起到保护作用，它与内毒素对机体的损伤有关。【关键词】

血红素加氧酶1；氯化高铁血红素；肝硬化内毒素血症

Roleofhemeoxygenase1expressioninendoxtoxemiccirrhoticrats

LIUXiaohua，SHIShuisheng

(TheSecendHospitalofShanxiMedicalUniversity，Taiyuang030001，China)

Abstract

Objective：Toobservethepathologicalroleofhemeoxygenase1(HO1)inlipopolysaccharide(LPS)treatedcirrhoticrats.Methods：ThirtytwomalewistarratswererandomlydividedintoLPStareatnormalgroup，cirrhoticgroup，LPStartedcirrhoticratsgroup，heminandLPStartedcirrhoticratsgroup，eachgrouphad8rats.Livercirrhosiswasproducedbytheadministrationofthioacetamideforaperiodof10weeks.Attheendofthisperiod.Cirrhoticratsweresacrificed6hafterLPSinjection(3mg/kg，intraperitoneally).Plasmatransaminaseactivitiestotalnitrite(NO)andmalondialdehyde(MDA)levelsaswellasexpressionofliverHO1weredetermined.Results：LPSadministrationtocirrhoticratscausedfurtherincreasesinplasmatransaminaseactivities，andplasmatotalnitriteandMDAlevelsascomparedtooirrhoticrats.HeminandLPSadministrationtocirrhoticratscausedincreasesplasmatransaminaseactivitiesandplasmatotalnitriteandMDAlevelsascomparedtocirrhoticrats.HeminaugmentdamagesofliverinducedbyLPS.Conclusion：OurresultsindicatethatincreasedHO1mayhaveasynergisticeffectinLPSaugmentedhepatotoxicityincirrhoticrats.

Keywords

hemeoxygenase1；hemin；endoxtoxemiccirrhotic

肝硬化是我国常见病，肝硬化患者Kupffer细胞功能明显下降，肠道菌群失调及肠黏膜通透性增加是形成内毒素血症重要原因，内毒素不仅加重原有的肝损害，而且可诱导全身代谢和血流动力学紊乱。本研究以腹腔注射脂多糖(LPS)以增强肝硬化内毒素血症，观察血红素加氧酶1(HO1)的表达对肝硬化大鼠的影响。

1

资料与方法

1.1

实验动物与模型复制

健康雄性wistar大鼠，体重(300±20)g(由山西医科大学生理教研室提供)。对照组自由饮清水，其余各组自由饮加有硫代乙酰胺(TAA)的水，0.03％的TAA诱导饲喂5周时间，再改为0.04％的TAA诱导饲喂5周。

1.2

药品与试剂

HO1的诱导剂氯化高铁血红素(hemin)购自sigma公司、精制大肠杆菌内毒素(LPS)购自Sigma公司、丙二醛(MDA)及一氧化氮(NO)试剂盒购自南京建成生物医学工程研究所。

1.3

动物分组与给药

将32只大鼠随机分为：正常＋LPS(对照组)、TAA组、TAA＋LPS组、HM组。除TAA组外其余各组腹腔注射LPS(3mg/kg)，TAA组给等容量的生理盐水；HM组于注射LPS12h前，腹腔注射hemin(40mg/kg)。并于注射LPS6h后，各组动物用7％水合氯醛5mL/kg麻醉后，用采血针与真空采血管经腹主动脉穿刺采全血，高速离心机离心(3500r/min)后，血浆置于－80℃冰箱冷冻备检。采血后，迅速取出肝脏，冲净余血，将肝组织迅速投入4％的多聚甲醛中浸泡固定24h，做石蜡切片以备用。

1.4

检测指标及方法

1.4.1

组织学检查

肝组织切片分别做HE染色，光镜下观察肝脏病理变化、胶原分布情况及假小叶的生成。

1.4.2

免疫组织化学

采用SABC法。结果判定：在显微镜下观察肝组织免疫组织化学切片中HO1染色阳性细胞的分布和着色情况。为区别肝组织中HO1表达差异，用BI2000图像分析系统，测定HO1阳性细胞的着色灰度值。灰度值越小，说明着色越深，反映细胞内HO1蛋白表达量越多。以灰度值来进行量化后的统计学分析。

1.4.3

肝功能指标检测

采用常规生化法测天门冬氨基酸转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)。

1.4.4

硫代巴比妥酸法(TBA)测血浆中MDA含量

用硝酸还原酶法测血浆NO浓度，按试剂盒说明操作。

1.4.5

统计学处理

数据表示用±s，应用SPSS12.0软件，采用单因素方差分析，取P＝0.05为显著性检验水准。

2

结

果

2.1

组织学观察结果

除对照组外，其余3组肝组织均符合肝硬化的病理学改变。余3组肝细胞增生，胞体大，细胞核深染，细胞排列紊乱，肝小叶结构破坏，汇管区和增生的肝细胞周围纤维组织增生，分割形成假小叶，小叶中央静脉扩张。对照组肝组织正常。

2.2

肝组织HO1灰阶值测定结果(见表1)表1

实验性肝硬化内毒素血症大鼠HO1、NO、MDA的变化

方差分析表明：对照组、TAA组、TAA＋LPS组、HM组大鼠的灰阶值显著依次降低，且相邻两组差异有显著性(P＜0.05)，表明LPS可以使HO1的表达进一步增强。HM可以诱导HO1的表达。

2.3

血浆ALT、AST、MDA、NO2＋NO3的变化

对照组、TAA组、TAA＋LPS组、HM组的血浆中的ALT与AST(见表2)、MDA、NO依次升高(见表1)，且各组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。表2

实验性肝硬化内毒素血症大鼠ALT及AST的变化

3

讨

论

HO1是一种应激蛋白基因，是血红素降解过程中的限速酶。迄今为止，已发现3种HO同工酶，其中HO1为诱导型，广泛分布于肝脏、脾脏、网状内皮系统和骨髓等组织，可被炎症因子、氧化应激、热应激、重金属及内毒素等所诱导。HO1可催化血红素降解，生成等摩尔的胆绿素、CO和铁，胆绿素在其还原酶的催化下变为胆红素。近年来认为，内源性CO和NO一样是一种气体信号传导分子和神经递质，由于低剂量CO在多种疾病中表现出抗凋亡、抗增殖、抗炎症、抗移植排斥反应等生物学效应，因而备受关注，因此与HO一起称为HO/CO系统。HO1催化产物的抗氧化损伤的作用也越来越受到人们的重视［1］。

本实验的结果显示，肝硬化内毒素血症时，肝脏HO1活性升高，应用HO1活性诱导剂hemin后，HO1的表达明显升高，但是ALT与AST也进一步升高，说明肝脏损伤进一步增加。HO1在很多情况下是起保护作用的，但是本实验却显示与肝脏损伤有关。国外Melley等［2］在对动脉碳氧血红蛋白与危重患者预后的临床研究调查结果显示：尽管HO1在很多情况下是起保护作用的，但是过度表达或许是有害的，HO1的表达有一个最佳适合范围。Kvam等［3］提出HO1表达有一个阈值，适度的HO1水平有利于机体抵抗氧化应激损伤，而HO1的过度表达会对机体有损伤作用。国内李玉明等［4］在研究脓毒血症时，大鼠肝脏血红素加氧酶的变化及作用，发现在脓毒血症晚期，肝脏HO1活性虽依然保持高水平，MDA含量却较早期进一步升高，推测HO1的作用可能与其浓度和活性相关。

MDA含量可反应体内过氧化的程度，间接反应细胞损伤的程度。MDA反应机体氧化的指标。本实验的结果显示，肝硬化内毒素血症时，肝脏HO活性升高，由于内毒素等毒性物质的作用致NO、MDA含量增加；应用HO活性诱导剂hemin后，HO1的表达明显升高、NO、MDA含量进一步增加，ALT与AST也进一步升高。其机制可能与HO1与一氧化氮合酶(iNOS)的相互促进作用，造成体内NO的过量生成有关。有研究表明炎症条件下诱导型iNOS的过量表达会使NO水平升高，产生细胞毒性，造成病理损伤。活性氧(ROS)存在下，NO衍生得到的活性氮(RNS)，如过氧亚硝酸根离子(ONOO－)等，是导病理损伤作用的重要环节。ONOO－可使酪氨酸(Tyr)或蛋白质酪氨酸残基发生硝化反应，生成3硝基酪氨酸3NT，并提出内源性硝化剂可导致体内蛋白质的损伤。3NT已作为RNS介导的氧化应激的相关生物标志［5］。DogruAbbasoglu等［6］研究发现在实验性肝硬化内毒素血症时，血浆中的MDA、3NT是增加的，同时发现HO1的表达也是增加的。他们认为在肝硬化内毒素血症时机体的氧化与抗氧化系统失衡与内毒素的毒性一起影响肝硬化的预后。Sarady等［7］研究发现，低剂量CO暴露的大鼠对LPS引起的急性肝损伤均有明显的保护作用，主要表现在与iNOS的关系上。在肝CO促进肝脏iNOS的诱导和NO的生成。NO通过诱导转录和稳定HOmRNA而提高HO1的表达［8］。HO1/CO与iNOS/NO在调节机体内环境平衡方面相互作用，即NO可诱导HO1生成CO，在肝脏CO又正反馈促进iNOS产生NO，二者形成复杂的代谢环路。由于NO与ROS－反应的速度是正常状态下超氧化物歧化酶与ROS反应速度的3倍，使得NO首先捕捉ROS以极快的速度反应生成ONOO－［9］。推测诱导HO1可能通过促进iNOS表达，进而产生NO在局部聚集的毒性作用，参与肝硬化内毒素血症损伤机制，提示促进iNOS/NO效应是HO1肝硬化内毒素血症损伤机体的原因。

总之，本研究表明，在实验性的肝硬化内毒素时，肝脏HO1的表达增加，尽管HO1在很多情况下是起保护作用的，但是过度表达是有害的。为肝硬化伴内毒素的治疗提供了新的思路。

【参考文献】

［1］StockerR，PerrellaM.Hemeoxygenase1：anoveldrugtargetforatheroscleroticdiseases［J］.Circulation，2006，114(20)：21782189.〖1〗［2］MelleyDD，FinneySJ，ElINA，etal.Arterialcarboxyhemoglobinlevelandoutcomeincriticallyillpatients［J］.CareMed，2007，35(8)：18821887.〖1〗［3］KvamE，HejmadiV，RytersS，etal.Hemeoxygenaseactivitycausestransiethypersensitivitytooxidativeultravioletaradiationthatdependsonreleaseofironfromheme［J］.FreeRadicBiolMed，2000，28(8)：11911196.〖1〗［4］李玉明，刘俊昌.脓毒血症时大鼠心血管系统血红素加氧酶的变化［J］.北京医科大学学报，1999，31：497500.〖1〗［5］池泉，黄开勋.蛋白质酪氨酸硝化的研究［J］.化学进展，2006，18(8)：10191024.〖1〗［6］DogruAbbasogluS，ParildarKarpuzogluH，