Bio-RadProteaniefCell中文简易操作手册

PROTEANIEFCellReadyPrep2-DStarterKit中文簡易操作手冊汎泰儀器.IEFCell規格輸入電源保險絲電源線電源輸出電壓電流功率設定時間輸入電源保險絲電源線電源輸出電壓電流功率設定時間10A,250V,SLO-BLOW,3ABCeramicBody3-wire;grounded50—0,000V,1Vincrements024mA,0.01Aiincrements0-24Watts00:01£9:00hours:minutesor0—9,999volt-hours聚焦盤材質Polycarbonate可使用膠條大小7,11,17,18,24cm容量12stripspertray7cm17cm電極長度64.5mm162mm可使用膠條長度82.3mm181mmPeltier平臺聚焦盤容量 一個24cm,18cm,17cm,11cmtray或兩個7cmtrays溫度範圍 10-25°±0.5C@max.ambientof30C15-25C±0.5C@max.ambientof35C°水合/平衡盤材質Polystyrene容量12stripspertray可容納膠條長度80mmfor7cmtray,186mmfor17cmtray環境需求 Forindooruseonly.Foruseataltitudesupto2000meters.Tobeoperatedbetween10Cand35Cambient.Tobeoperatedwithamaximumrelativehumidityor90%fortemperaturesupto35C.°用電規範 CE,EN61010-1大小 28(W)x30(D)x14(H) cm重量 12.5lb.(5.7kg)使用介面 Controlpanel12keyalpha-numerickeypadwith4soft-keysand3functionkeys.Graphicsdisplay,4linesx21charactersProgrammableRehydrationandfocusingtime,platformtemperature,parameterscurrentlimitperIPGstrip,voltageandvoltagerampingtypeforeachstep.VoltageRampingProfilesSlow,LinearorRapidProtocolcapacity3semi-programmable,pre-loadedmethods.10programmablemethodswithuptoten(10)steps.DatacollectionRS232serialportandoptionalthermalprinter.根本介紹切〔t炬浮Al|>hafiumEr1ckeypadControlkepIndiciterlightIEFCell正面圖Controlkeys控制rehydration/Focusing程式開始，暫停及停止匡開始固停止更暫停AlphanumerickeypadCE:去除輸入文字EXIT:回前一頁或跳出CE:去除輸入文字[=^numbe-rlat)dRS232serialport-UnIv枣numbe-rlat)dRS232serialport-UnIv枣zlpow已十亠entfymcduteFanc-:*o?r反面圖Pi&^vuiiefateUdP<>li^dratk-n^qulllbfjtlontdyFocusingTray(FocusingTray(聚焦盤)Rehydration/EquilibrationTray(拋棄式水合盤)■VotageRamping方法VOLTAGEMOVVOLTAGEMOV三.藥品準備及樣品前處理■ReadyPrep2-DStarterKit(163-2105)內容物KitComponentsR^adyPr^pE*coliProteinSampleOneviaLLyoi^hilizcd.EachofioconstitLitcdRoadyPrt?口Ecolt口lotcinsanphconlars2.7tqoftotalpratoinataGcncentrationol1.35R^adyPr^pR«hydration/Sompl^Dirff#nOnnxial.Lyopl1ilized.Each.uniclrnccn^ftnulodrehv^fationbuffercontins10mlof8Mur«o.CH^S,3tMdiihiothrfiilol(DTO,0.2%知MBb'Lyt^^10ampholytes,andBrQTiophetidBlue(trace).Nanopur* OnahoHlsoorri^niigtHotsterilenaropunev^iier.Ec|UlllbrfiUoiiBirff^rI.T>/o 耳玄ficorlainiih\畀^Urb^t,LyrfI.曰uhViilolrsiDonslitLJl-odaquRibratbnbufferIcontains20mlof6Muraa,2%SDS,0,375MTris^HCI(pH&rSJh20%gl^aerol.and2伯DTT,EquilibrationBufferII.T/jovials,eachccntaininq』stirbar.Lyophilized.EachMaio(reecnsti-tuled^quilibrcitjoributterIIconLains2Gmlof6Murea,2%SDS.0.375M7ris*HCI(pH8.8).and20%glvcefol.30%GlycerolSolution.Onotollleoonldjfkir>j|TOrnlofstorilo3Or：t.ly.Viq^oriJ.lo<loacMamj<i^.Twovols.Eachvialcontains0.5grofaniilrapjir』grvidc*ofodcacot^Tiido.OvvrlnyAgaro$».Onobctilocoriahhg50mlof03%IctwmolingpohtagaiDSGIn25mM1ri&,192niMqlycins,C\1SDS,andjtraceofBruiicpiiefiolSlue.

■配製所需Reagent取Nanopurewater6.1ml参加Rehydration/SampleBuffer中形成A瓶〔可搖晃與隔水加熱以加速均勻混合〕取A瓶2ml参加E.coliProteinSample中〔原有2.7mg〕,此時會配置成1.35mg/ml的Buffer形成B瓶=SampleTable1.StripLengthSampleVolumeProteinLoaded7cm 11StripLengthSampleVolumeProteinLoaded125pl 185pl 300pl169ng 250|jg 405 pg■参加聚焦盤的每一個well中所需Sample量7cmIPGStrip11cmIPGStrip17cmIPGStripMinimumrehydrationvolumeRehydrationstriptoagelThicknessof0.5mmandgelCompositionof4%T/3%C125ul185ul300ulMaximumrehydrationvolumeIncreasedrehydrationvolumeallowsforlagerproteinsampleload,facilitatesentryoflargerprotein,Andminimizesproteinsolubilityproblems250ul365ul600ul■準備上機取ddH20先大概沖過FocusingTray,再用拭鏡紙擦乾Tray的每一個well與電極絲〔電極絲尤其要擦乾！〕以7cm為例，取Sample125ul，平均置入FocusingTray的每一個well中,儘量將sample注入兩邊電極以內的位置〔可將Tray稍微墊高，使注入的溶液可以緊靠每一well的下緣〕取Wicks二片，使用二次水潤濕，置於兩個電極上方，小心不要有氣泡產生〔探a.因為E.coliProteinSample已經非常純，故可以省略此步驟b.放wicks目的：可吸附雜質及鹽類，防止污染物損壞電極和影響實驗〕〔rehydration步驟前放置wicks〕—此為實驗進行過程中，無pause的步驟,即rehydration步驟〔12hr〕結束後，機器直接進入Focusing步驟直到S4-HoldStep結束。〔rehydration後,於focusing前放入wicks〕—此為實驗過程進行時，有 pause的步驟,即rehydration步驟〔12hr〕結束後，機器會先pause使用者可在此時放入wicks後，再按run，機器才會繼續進行Focusing反應直到S4-HoldStep結束。4.帶上手套，使用兩支原廠專用鑷子，小心夾住膠條兩側，迅速撕去strip膠條上的保護膜，將IPGStripGel之面朝下，緩慢放入FocusingTray中。〔注意事項：使用ReadyPrep2-DStarterKit請選擇pH4-7的strip勿讓手直接碰觸到膠條，因為手溫會影響膠條注意不要有氣泡產生，因為氣泡會影響聚焦的結果請留意Tray&Strip的正負極放置方向 〕5.最後取1ml之礦物油，平均加在Strip上，注意一定要完全覆蓋整個 Strip，以防止Buffer之蒸發而乾掉燒焦StripLength 7cm 11cm 17cmMineralOil 1ml 1.5ml 2.5ml6.將上蓋蓋好，將tray置於IEFCell上之正確位置〔留意正負極擺放位置〕REHYDRATIONBUFFERWrtficutproteinsampleRHHYDRATIONBUFFERWithproteinsemph呂REHYDRATIONBUFFERWrtficutproteinsampleRHHYDRATIONBUFFERWithproteinsemph呂98MU阳才 4.3 5,6gf10ml0.5%CHAPS 50mg^icml10mMDTT 15m^lOml(Dilhiothreitol)□r,2mMlTributylphosphine'"00.2%(w/v)Bio丄ytesi0.0019&OrangeGorEromoph^nolSlue8-9,eMUrea* 4.85.8g/ioml1-4%CHAPS< 100-400mg/IOmlliS-ICOmMDIT 23150mg/l0ml(Dithrithreitol)or.2mLlfriLuivlijIiosp^iiiie"0-0.2%(wN)BimLyieT0001%OrangaGorBrormpfien口1Blu«ITurjrDJiiitiof1ui.i.ILVlXDEI.are-JiljpjndmdicSimple<^lubiJih'1be.imouiiIth口!xihdTuj-jpcFirstDimensionj. ^iiuhLiitIhfLfMim.ilreiT).i1r3ik>Eihtril^rcmnp lurjuch hpe料be型MejtituiiixImkptncdh**Trih■刖pbo»ne初*a&emtmei■訥疋■电吧曲仙OTT5''''pll-int3iTW|F・EhliiiiFhiIKj^inpLridiji]l四、PROTEANIEFCell 操作步驟■預設程式(PresetMethod)打開IEFCell背部電源,可見到以下畫面,按下預設之程式(PRESETMETHOD)依指示完成設定，依strip長度，選擇Focuingstep。(7cm為例)—/Linear△V—REHYDRATION:yesGELLENGTH:07—REHYDRATIONSTEP:active50V—INSERTPAUSEAFTERREHYDRATIOIN:NO—S1250V15minS24000V「2hr〔即2hr後會從250V拉到4000V〕—S34000V〞20000VHOURS〔即達到4000V之後，會使S3的時間換算累積到20000V*Hr〕—S4500V/HOLD:yes—ENTER#OFGELS:2—PRESSTOSTART

■自行設定方法(NEWMETHOD)般設定方法步驟'/OLTAiit'/OLTAiitR(Rehydration)：水合反應,Active50V,12hr,目的是將rehydractionbuffer及sample混合並吸入IPGStrip膠條中(ConditionStep)：設定250V,15mins,其作用在於移去鹽類離子及污染物(VoltageReagent)建議使用線性模式(Linear)將電壓提升到FocusingVoltageS3-FinalFocusing：此步驟為真正等電聚焦設定，其設定之設定值如下：VoltageIPGStrip累積V*hr數值4000V7cm20000V*hr8000V11cm40000V*hr10000V17cm60000~80000V*hrS4-HoldStep：設定500V,以防止過度反應怪當反應完成後即可進行平衡反應以便做 2nddimensionSDS分析)■平衡buffer配置&strip平衡7cmIPGStrip11cmIPGStrip17cmIPGStripEquilibrationbufferI2.5MLP4ML6MLEquilibrationbufferII2.5ML4ML6ML取13.35ml30%GlycerolSolution参加EquilibrationbufferI瓶中形成C瓶(二BufferI)準備適當之容器，將Strip取出後，先以背膠面〞在濾紙上稍做滴油的動作，再把 Strip過ddH2O—至兩次，把底部的水及礦物油使用濾紙大致去除，然後將膠條面朝上放在拋棄式水合盤中，注入C瓶2.5ml之BufferI，於shaker中進行搖晃20分鐘。〔此為平衡一的局部〕取13.35ml30%GlycerolSolution與0.5克的lodoacetamide参加EquilibrationbufferII瓶中形成D瓶(=BufferII)(探可先取5mlGlycerol参加Iodoacetamide中,溶解後倒入EquilibrationbufferII瓶中,再將剩下的8.35mlGlycerol参加EquilibrationbufferII瓶中)平衡一做好後，將Strip取出，再以背膠面〞在濾紙上滴乾殘餘的BufferI，然後將膠條面朝上放在拋棄式水合盤中的另一個well中，注入D瓶2.5ml之BufferII，再於shaker中進行搖晃20分鐘。〔此為平衡二的局部〕完成後將Strip取出，即完成Strip平衡之程序。再將Strip置於SDS膠片上進行2ndDimensionAnalysiso〔假设當天不打算進行2nddimension則IPGstrip可在IEF結束之後，先不必進行平衡反應,而將Strip放在拋棄式水合盤中連同Lid，至於-80C冰箱中保存。〕EqiiillihratlonhiifferiniiiitdLMitdv[HhirtoSlep1: ■百millineqnilibrivtiihn 1FqiHIjhraltonButTer【1(Pri'iMirv priisrLithavi1:KIISminis hiiffcrII6MUran3.6g.LDnil6MUrea3.6e'10mlA賂SDS0.2pLOmlSOS0.2学10mlO.375MTripMCIpHW.W2.5nil1.5MTris-HCM.pEl8.8/IOmlO.375MTris-HCIpHK.S2.5mil卡MTrb-H<I,pH .'lOml2Oh-,,(ilyceroI2ml1OnilMSCilycervil2nillhnil130niMDJT200mt：10ml1niMlo(LoacHaniid«250nisj10ml五、2-DSDS電泳分析■鑄膠(7cm使用Mini-PROTEAN川;17cm使用PROTEANIIXL,1.5mm)以7cm為例，先將1.5mmSpacerPlates&ShortPlates用酒精擦拭乾淨,將大、小玻璃置入注膠架時，底部必須在同一平面，再將玻璃架於注膠台上2.配置10%之SDS-PolyacrylamideGel7诃17词a.取一支50c.c離心管b.参加30%Acrylamide/Bis29:1Solution(161-0156) 6.7ml39.6mlc.参加1.5M(pH=8.8)之Tris-HCl(161-0798)5.0ml30mld.参加10%SDSsolution(161-0416)0.2ml1.2mle.参加10%APSsolution(161-0700)0.2ml1.2mlf.参加TEMEDsolution(161-0800)0.008ml0.048mlg.参加ddH2O加水到所需量加水到所需量2片Gel共計溶液20ml 120ml將溶液参加大、小玻璃夾縫中，Load入的溶液高度約從玻璃上緣算起0.5-1.0cm,於上層参加75or95%之酒精壓平〔假设不使用酒精，亦可放置 1.5mmPrep/2-DComb〕，小心不要有氣泡產生〔假设需参加標準品可在一小濾紙上滴上 standard,同樣放入Gel上即可〕大約等待1-3hr後，膠片即凝結完成，再往下進行電泳局部〔可放至4C冰箱中幫助凝膠〕■跑電泳〔RunSDS〕先將OverlayAgarose〔此為lowmelting〕用微波爐預熱使其溶化，置於一旁冷卻後，稍後可以封膠使用。gel凝結後，先將酒精層倒出來並儘量以拭鏡紙吸乾，再換水層参加該空隙中， 〔此步驟是為了讓strip放入玻璃片時能夠迅速滑到定位〕。

將Strip〞膠面朝前〞小心放入膠片之上緣空隙中，使其與 gel面接觸，此時要特別小心:strip與gel的接觸面處絕對不可以有氣泡產生，然後將水層倒出來再取一些溶化好的LowmeltingAgarose加滿整片膠片的上緣，即完成封膠之步驟，等到Agarose凝固後，strip也固定不再移動，方可跑電泳。〔可放至4C冰箱中幫助Agarose凝固〕跑膠用之緩衝溶液為1X之Tris/Glycine/SDS之RunningBuffer〔可使用10X之Tris/Glycine/SDS161-0732做10倍稀釋〕，参加電泳槽內之緩衝溶液原則上外部 Buffer量要超過膠片玻璃之下緣三分之一，而上層 Buffer量要蓋過白金絲之高度。蓋上電泳槽上蓋，插上電源，固定電壓100V蓋上電泳槽上蓋，插上電源，固定電壓100V跑90分鐘即完成SDS之程序(17cm設定條件：16mA/gelfor30min,then24mA/gelfor~5hr)完成後，要小心取下膠片〈可於水中完成此動作〉，然後將膠片置於容器中，即可準備進行染色之動作。■染色與退染(Stain&Destain)方法〔一〕將膠片置於適當之容器中，倒入CoomassieBrilliantBlueR-250Stain的溶液,量的多寡以蓋過整個膠片為主。染色進行約30分鐘。〔依照當時的染劑新鮮程度來稍做調整〕染色後，將膠片取出，置於退染之溶液中 〔50%水+10%AceticAcid+40%Methanol〕，退染至肉眼可見膠片之結果為主。方法〔二〕1.將膠片置於適當之容器中，倒入Bio-RadBio-SafeCoomassieStain的溶液,量的多寡以蓋過整個膠片為主。染色進行約30分鐘〔依照當時的染劑新鮮程度來稍做調整〕染色後，將膠片取出，直接置於水中做退染的動作，退染至肉眼可見膠片之結果為主,約2-3小時後可以看到結果。

※依照以上之步驟，即可完成2-DGel之膠體實驗，而後可依個人之後續研究以及運用，搭配其他儀器或方法，作更詳細之實驗步驟。六、故障排除與附件ProblemIniiidltworzeivernemCause Solution•ProblemIniiidltworzeivernemCause Solution•[XwrconkwibetwyenIPGsnipsand»IncQinpleiecontactbetweentmvdectnodesaid卩ROTKANIEFCel]cannectionj.Checkconiaclbetween[PG^Lripsandeljetrode.Miikesurethefocusingtra>lidhplacedcoireeIIv.Checkplacement01focusingLmytciiisuit?properbetweentravel<MralesDndPROTEANIEFCdJcdddk-tlolis.*IncoiripleieIPG^triprehydmticra*NTakesuretluittheIPGstripsancompletelyandevenlyre-hydried「h出krehvdi^ik)nv<ilmresand[diydrutionlimes.Vclhiyeisnot ■nJfr^iwaww AtoAtem ItaWfitMKM*1*M-MM PM|»MM0■nJfr^iwaww AtoAtem ItaWfitMKM*1*M-MM PM|»MM0!^-^1.1.ITJilJMLttMNlAlttflfeMMtt>吕匹巾二电赳咖嘈1曲任航fla-ymHt卩鼻闕冷TT.Fl* £S却iBraztuMLKSinrnff Ak mrf?rriJ3k MbM. &»was>T3iFDr*i>nirkA «*WW1釘Emm/俭*■祁El沧再If帀緒冋旳5如r4/U4£i>t；_..fjLW■mt比■那*1聊他科■斗■他f■■剛金iciruig ■唧—ttciWth皿 frirr»mo*mnmj%v«*r<w m«f*r«nv«njfnvmitmcbntXorrjM i% MBl*MlM KTWfflW^HlMWWfWP■MtoMr4»QMHn»*t»OCWHTffbar員伽z湖甩口n-gwufltimtmi■■it■■再Lf<«科用・• 血疔山抽•祈屁血和宀•胭%^OTfTVJiCI %K4/ZH7rfXIWWW 他*1760“個IM5M3TISWOdmR|4«NB5S5T C聲网毎百ST誓朗SlKrMtf円IrST^TFWSi.I%H^TTA.iSUMMHlOWOrinMRrCHWFJSPT"increasingduri])piglMeerampingsleps.*Checkwli<uncenirationandorckssMtsjnple.V。】尉绊V。】尉绊ck)e*iwtreachprcc；rammedvalua,armsximiim\olt3ijcisrejchod\eiyslovlyLaruetluchlatlDnsInv山昭diidccmeni.■.11^■re<]sLiikeojfi>['incssairedisplLr.^1Bio-l.yifcoiKentraii^iitoohighSetvcltag^loohighforIPGstripsizeandp]lpRulient.Excesssampleduriri?re-hydmtiondidni4oniL?i屮?】“orIPCi^e]sove[swelledwithsampleReduceRiol.^teeoncentraticiito0.2"；>iv.v)iPivgr^invclt-kiurjiforfbcusnjsteptoInaireconnpldlet'oaisincol'sainpk.ITgitfidernkinrtcotunieiidedsamplevoluncsareusdclsureallc*ttsample阳mter<dge】*on'i\MTioAeexcesssamplepriortofbcusirig"■Checkreliydrationvolumea\]>]lioie,Mtike也】¥wliy-ctialLonsclutionisevenlydistributedduringich^dratinn.Wereeommendtiatiidiilimiiof5'.1\i\strip.Makesun?UieconectnnnberoflPGstripswasentered.BurningofstripswillcauseUrpefk]dilationsinitsistanceresulliii^intheresisianccerrormessage.)Cunenllimittoohigh.[P(rsripstaxadriedout.kkchudewickstcouetorcontiiniiiicomKleIeetr.idesolution.R^livdraticinblifterconipusitioiiincornecl.saltconcentratiGnloohigh.1WereconmididacurrenlIbnil>0jiA^Mrip,MakesurethecorrectnumberofIPGsiripsVr'ssenlerfd.MjkesureIPGstripsareuuiveredwtlhmineraloildiequivalenttopreventdrying□ntMakesuretheekclrcdewicksconlatnde-icnizedwaiteronly□ndare(h]Tip,nol^el.I'heckRihydcaticii]bn濮rc^nctfiitnili^n.Reirukebuflerififnecessary-Product4000PROTEANIEFSystem,complete,iriclude^ba^cunit,17and7cmlocusingtrayswiihli-:l,