大肠杆菌质粒DNA的提取 (碱法)课件

实验

一

大肠杆菌质粒DNA的提取(碱法)背景知识质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb到200kb。大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型遗传因子。其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。质粒特点：质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体，是细菌有性繁殖的性因子.１９５２年由Lederburg正式命名为质粒。质粒类型：按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒质粒的应用大多数基因工程使用松弛型质粒。严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。一、实验目的1.了解碱法提取质粒的原理；2.掌握碱法提取质粒的方法。二、实验原理

使蛋白质或脂类等菌体成分变性基因组DNA产生缺刻，变成线状，并解离成单链（变性）由于质粒DNA较小，仍为环状变性区虽大，但不分离

利用强碱（或加热）及表面活性剂(SDS)裂解菌体中和或恢复至室温变性的质粒DNA按原互补配对结构复性基因组DNA随机复性，与蛋白质等菌体成分结合在一起离心分离质粒DNA存在于上清中，回收苯酚/氯仿/异戊醇抽提，乙醇沉淀纯化二、实验原理

碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们的。在碱性pH，DNA变性，当恢复中性并在高盐离子浓度时，绝大多数质粒DNA可以准确复性，留在上清中；而线性染色体DNA不能准确复性，相互交联缠绕附着在细胞壁碎片上与蛋白质发生沉淀。离心后获得含有大量质粒的上清液，利用亲水性有机溶剂（乙醇、异丙醇、PEG8000）使质粒DNA脱水，离心后收集。碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：超螺旋、开环和线状平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫）

注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀TE缓冲液：溶解DNA三、实验仪器、材料与试剂

四、操作步骤6、上清液（700μl左右）移入干净EP管中,加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25:24:1),振荡混匀,4℃下12000g离心5min。7、将水相（上清）（500μl左右）移入干净EP管中,加入2倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中15分钟，然后4℃下12000g离心10分钟。8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml70％乙醇洗沉淀一次。9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20μlTE缓冲液或者灭菌水(pH8.0，含20μg/mlRNaseA)中，储于-20℃冰箱中。

五、注意事项——材料准备使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）五、注意事项——细胞裂解菌体量适当。培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。对于细胞壁较厚的菌（如酵母菌）质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁。五、注意事项——核酸分离、纯化采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法五、注意事项——核酸沉淀、溶解当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）若长期储存建议使用TE缓冲液溶解（TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2