分解纤维素的菌的分离与提纯

关于分解纤维素的菌的分离与提纯第一页，共十五页，2022年，8月28日目的意义实验用品实验方法与流程实验结果分析与讨论致谢第二页，共十五页，2022年，8月28日目的意义

能源危机、环境污染日益严重，在迈入21世纪今天，已成为人类面临的两大难题。寻找新能源，减少环境污染，越来越显得重要。纤维素是植物光合作用的主要产物，利用微生物可将纤维材料转化为能源、饲料、化工等原料。

筛选出降解纤维素的菌株有助于投入生产，在能源、工业生产等作为理论参考。第三页，共十五页，2022年，8月28日实验用品培养基：羧甲基纤维素钠培养基（初筛培养基）：CMC-Na3.0g(NH4)2SO42.0gK2HPO41.0gMgSO4﹒7H2O0.5g胰蛋白胨1.0g琼脂20g刚果红培养基（复筛培养基）：CMC-Na3.0g(NH4)2SO42.0gK2HPO41.0gMgSO4﹒7H2O0.5g胰蛋白胨1.0g琼脂20g刚果红0.0692g水1000mlPH7.0

发酵产酶培养基：CMC-Na10.0g(NH4)2SO44.0gKH2PO42.0MgSO4.7H2O0.5gH2O1000mlPH6.0主要仪器：紫外分光光度计UV-2550型高速离心机HC-2518型主要试剂：3,5-二硝基水杨酸羧甲基纤维素钠第四页，共十五页，2022年，8月28日实验方法与流程样品采集初筛复筛酶活力测定取文汇山落叶覆盖下的腐殖土、延河河泥将土样按浓度梯度配置成菌悬液，取1ml涂布到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的平板上，与培养箱中培养，多次平板划线分离纯化得到纯菌株。将初筛得到的菌株点样于刚果红培养基上进行复筛，,培养2d。采用十字交叉取平均值法，测量降解圈及菌落直径R1，R2。根据R1/R2的值，筛选出比值最大的几株菌。还原糖测定为DNS试剂法540nm处有最大吸光值，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强弱成比例关系。根据产生葡萄糖的量间接作为酶活力衡量标准。第五页，共十五页，2022年，8月28日标准曲线的绘制配置1mg/mL的葡萄糖标准液，取9只具塞试管，分别编号0、1、2、3、4、5、6、7、8，按下表加量：项目012345678葡萄糖标准液/ml00.20.40.60.81.01.21.41.6相当于葡萄糖量/mg00.20.40.60.81.01.21.41.6蒸馏水/ml2.01.81.61.41.21.00.80.60.4DNS试剂/ml1.51.51.51.51.51.51.51.51.5酶活力测定具体步骤:粗酶液的提取

取10mL试管，加入6mL1.0%羧甲基纤维素钠溶液，再加入不同菌株提取的粗酶液，50℃水浴中酶解30min，加2.0mLDNS溶液，沸水浴8min，取出于冷水中冷却至室温，定容10.0mL，在540nm下测吸光值

混匀后，放入沸水中，准确沸水浴8分钟，取出冷却至室温，加入21.5ml蒸馏水，以0号为对照在540nm下测定其OD值，绘制葡萄糖标准曲线用接种环从试管里取一环活化后的菌株，加入到产酶发酵培养基上培养，每隔一天取一定培养液，离心（8000r/min,10min）取上清液，即为粗酶液。第六页，共十五页，2022年，8月28日实验结果经过多次分离纯化，共分离出9株菌；接种到刚果红培养基上筛选名称ML-1SX-2WZ-3WX-4WD-5LT-6LH-7BF-8ZP-9降解圈直径R1(cm)1.61.21.451.52.11.351.351.651.55菌落直径R2(cm)0.350.40.360.350.30.320.320.320.42R1/R24.573.004.034.277.004.224.225.163.69十字交叉法测得菌落及降解圈的直径如下表：由表中数据，挑选出ML-1，WD-5,BF-8R1/R2比值最大的三株菌第七页，共十五页，2022年，8月28日对所筛出的三株菌进行镜检得到图片如下：ML-1WD-5BF-8ML-1WD-5BF-8革兰氏染色结果阴性（红色)阳性(蓝紫色)阴性(红色)细菌形态杆状杆状杆状WD-5BF-8WD-5WD-5BF-8WD-5WD-5BF-8WD-5WD-5BF-8WD-5第八页，共十五页，2022年，8月28日生理生化实验结果ML-1WD-5BF-8VP实验-+-MR实验+++吲哚实验---产酸+++产气---淀粉实验+++第九页，共十五页，2022年，8月28日葡萄糖标准曲线如下图：第十页，共十五页，2022年，8月28日酶活力测定结果：由图可知ML-1菌株在第五天时，酶活力最强，为0.20099；WD-5菌株在第二天时酶活力最强，为0.1860；BF-8菌株在第四天时酶活力最强，为0.1935。据此分析WD-5酶活下降较快，ML-5菌株酶活力最强

第十一页，共十五页，2022年，8月28日分析与讨论：

本次试验由于时间等方面条件限制，只做了单一株菌的酶活力测定，但我们很清楚纤维素酶是一种复合酶系，自然状态下,纤维素的彻底降解是在微生物体系中多种微生物长时间相互作用的结果，微生物种群间存在着协同作用。所以降解纤维素菌株混合优化培养是个需要深入研究的课题。

通常认为产生较大透明圈的菌株,降解纤维素能力也较高,但本试验结果表明溶解圈大小不能完全代表菌株的纤维素酶活力,ML-1菌种降解圈不是最大，但是其酶活力却是最高的。这也说明仅以溶解圈大小作为纤维素酶活力大小的定量指标是不太可靠的,其原因可能是多方面的,如固体和液体培养条件不同;同一发酵时间和酶作用温度不一定是每一株菌的最佳产酶时间和最适作用温度,不同菌株具有不同的纤维素酶系等。第十二页，共十五页，2022年，8月28日分析与讨论：

由酶活力曲线可以看出,每天测一次酶活力,实验时间较长,对酶活力的精确测定有影响,以后测酶活可将时间间隔定位12小时或更短时间,把酶活力测得更为精确，这也是我们操作技术有待进一步提高，实验思想需要改进的地方。目前，处理农作物秸秆的方式还只是简单作为牲畜饲料、燃料等初步利用的阶段。利用微生物降解纤维素的方法还未推广开来，这样就造成了很大的资源浪费及环境污染。因此寻求高效能纤维素降解菌，必将成为今后很长一段时间内需要研究的方