生化实验-蛋白质含量测定

实验一蛋白质含量的测定实验一：蛋白质含量测定方法的研究非蛋白物质的可能干扰及其干扰程度的研究分析摘要：本次实验通过分别利用三种方法（Folin-酚法，考马斯亮蓝（G-250），紫外法）平行测定纯蛋白溶液和生物材料中蛋白的含量，分别计算和比较每种材料通过三种方法测定结果的差异性。再利用同时进行的11组实验的数据进行整合分析。最后通过比较两种待测液在三种方法测定下的差异性来分析非蛋白质干扰因素对三种方法的影响及影响程度。关键字：比色法，蛋白质含量测定，非蛋白质干扰因素，差异比较与分析研究背景及目的实验室测定蛋白质含量的方法多种，且依照不同的应用方向，依照不同的原理有多种蛋白质含量的测定方式。目前蛋白质含量测定的主要应用方法是比色法，但是由于实验操作以及设备存在误差，所以蛋白质溶液的真实浓度难以知晓，因此不能直接恒量各种方法在不同测定环境中的差异性。同时在实际的测量中，由于生物样品的复杂性，目标溶液中往往存在着诸多非蛋白干扰因素。因此需要实验者通过多种方法，有一定的数据支持，从可依靠的数据的线性变化中寻求合理的数理参照，从而对非蛋白干扰因素的影响程度做以分析和比较。原理 本次实验选取三种实验方法——Folin-酚法，考马斯亮蓝（G-250）法和紫外法：Folin-酚法的原理利用是蛋白质中含有酚基的氨基酸数与蛋白质浓度呈正比，从而对特殊残基的测定来确定蛋白质含量；考马斯亮蓝法的原理是在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质与色素结合物在595nm波长下光的吸收与浓度呈正比，故可用于蛋白质的测定；紫外法的原理是：蛋白质在紫外光下，吸收高峰在280nm左右，在此波长范围内蛋白质溶液的光密度值与浓度呈正比。本次实验测定的对象为纯蛋白溶液（BSA，牛血清白蛋白）和生物材料（绿豆芽下胚轴蛋白的提取液），分别作为无非蛋白质干扰和非蛋白质干扰的两个实验组。通过分别对两种溶液利用三种方法进行测定。用数理处理和分析来衡量三种方法在测定中的波动，比较两待测液即纯蛋白和生物组织提取液之间的波动情况的差异。通过两组数据的标准差之间的差异，来分析非蛋白干扰因素对不同实验方法测定的影响是否存在以及影响程度的大小。仪器试剂3.1仪器722-光栅分光光度计（上海精密科学有限公司分析仪器厂），JP-100架盘药物天平（北京天平物华医疗仪器有限责任公司），UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）。3.2试剂1mg/mlBSA（牛血清蛋白）标准溶液，Folin-酚法试剂甲，Folin-酚法试剂乙，考马斯亮蓝G-250溶液。3.3材料待测液一：未知浓度牛血清蛋白；新鲜豆芽下胚轴。3.4其他设备50ml烧杯三个；50ml容量瓶一个；移液枪四只（200ul,1000ul*2,5000ul，大龙牌）；具塞试管44只；研钵、玻璃漏斗、玻璃棒、滴管各一个。实验步骤4.1标准曲线母液的配置使用移液枪将1mg/mlBSA原液分别在刻度的具塞试管配置250μg/mlBSA标准液15ml，100μg/mlBSA标准液15ml。作为标准曲线绘制中使用的母液，备用。4.2生物样品待测液二的配置用托盘天平称取1.5g绿豆芽下胚轴（掐头去尾），再用研钵研磨至匀浆状态，少量多次用蒸馏水转至50ml容量瓶，并且直接定容，颠倒浸提5分钟后，用漏斗过滤，所得滤液即为待测液2。4.3Folin-酚法标准曲线绘制及待测液测量按照下表标记试管，分别加入试剂及材料，并用722-光栅分光光度计在650nm下用测定吸光度建立标准曲线。管号12345678910111225000.20.40.60.81.0待测液1各0.2ml待测液2各1ml蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20各0.8试剂甲各5ml，混匀，RT（室温）10min试剂乙各0.5ml，立即混匀，RT：30min(2小时之内稳定)4.4考马斯亮蓝（G-250）法标准曲线绘制及待测液测量按照下表标记试管，分别加入试剂及材料，并用722-光栅分光光度计在595nm下用测定吸光度建立标准曲线。（注意！G-250对玻璃器皿有吸附，使用后需要用乙醇彻底清洁）管号12345678910111210000.20.40.60.81.0待测液1各0.1ml待测液2各1ml蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20各0.9mlG-250溶液各5ml，混匀，RT（室温）2min(1小时之内稳定)4.5紫外法标准曲线绘制及待测液测量按照下表标记试管，分别加入试剂及材料，并用UV9600紫外分光光度计在280下用测定吸光度建立标准曲线。并在280nm和260nm的波长下，测定待测液1和待测液2吸光度。管号12345678910111213141mg/mlBSA原液(ml)00.51.01.52.02.53.04.0待测液1各4ml待测液2各2ml蒸馏水(ml)4.03.53.02.52.01.51.002ml数据整理与计算5.1Folin-酚法表格5.1Folin-酚法测定结果试管序号F1F2F3F4F5F6待测液1(稀释后）（F7-F9)待测液2（稀释后）(F10-F12)蛋白质浓度μg/ml050100150200250110.435115.652109.565148.696147.391148.696OD65000.1620.2420.3660.4650.5310.2540.2660.2520.3420.3390.342平均浓度μg/ml559.420(稀释前）593.043(稀释前）豆芽下胚轴蛋白质含量（%）0.49图5.1Folin-酚法测定标准曲线5.2考马斯亮蓝（G-250）法表格5.2考马斯亮蓝法测定结果试管序号G1G2G3G4G5G6待测液1(稀释后）（G7-G9)待测液2（未稀释）(G10-G12)蛋白质浓度μg/ml02040608010052.44254.30255.00016.62815.81415.581OD59500.2260.3940.5930.6750.7830.4510.4670.4730.1430.1360.134平均浓度μg/ml539.147（稀释前）16.008（未稀释）豆芽下胚轴蛋白质含量（%）0.05图5.2考马斯亮蓝法测定标准曲线5.3紫外法表5.3.1紫外法测定结果试管编号Z1Z2Z3Z4Z5Z6Z7Z8浓度μg/ml01252503755006257501000OD28000.0810.1720.2480.3220.4040.480.632表5.3.2紫外法测定待测液结果试管编号待测1(Z9-Z11)待测2(Z12-Z14)OD2800.3360.340.3320.3070.30.303OD2600.2130.2150.2070.3380.3280.33OD280/OD2601.5771.5811.6040.9080.9150.918蛋白质浓度μg/ml560566.667553.33511.667500505平均值560505.556豆芽下胚轴蛋白质含量（%）1.50注：待测液一没有使用校正公式，待测液二使用了校正公式，浓度结果为校正后结果。图5.3紫外法测定标准曲线结果计算与讨论分析6.1原始数据的处理6.1.1Q检验：平行实验中的极端值可以通过Q检验舍去。按以下步骤来确定可疑值的取舍：（1）将各数据按递增顺数排列：X1，X2，X3，…，Xn-1，Xn。（2）求出最大值与最小值的差值（极差）Xmax-Xmin.（3）求出可疑值与其最相邻数据之间的差值的绝对值。（4）求出Q（Q等于（3）中的差值除以（2）中的极差）。（5）根据测定次数n和要求的置信水平（如95%）查表（见下）得到值（6）判断：若计算Q>Q表，则舍去可疑值，否则应予保留。测定次数nQ（90%）Q（95%）Q（99%）30.900.970..9940.760.840.9350.640.730.8260.560.640.7470.510.590.6880.470.540.6390.440.510.60100.410.490.57本次实验中的三种方法所得原始数据中可疑数据均已使用Q值检验法进行检测，其中，没有发现极端值的存在。6.1.2离散程度的比较由于样本值大小的差异，不同样本之间不能直接通过上述三个参数进行比较，需要进行平权。即通过计算相对值来进行比较。即需要使用相对极差、相对标准差和相对平均差。即将极差、标准偏差、平均差三者除以各自样本的算术平均值。之后可以直接比较，来对比两样本之间的波动程度。6.2实验结果与离散度分析(同组同学：于茗骞)6.2.1小组实验数据汇总与离散程度分析表6.2-1小组实验数据汇总方法待测液1浓度μg/ml待测液2浓度μg/ml豆芽蛋白含量（%）Foling-酚法559.42148.260.49考马斯亮蓝（G—250）法539.15160.053紫外法560450.2581.5表6.2-2小组实验数据离散程度分析方法待测液1浓度/ug/ml待测液2浓度/ug/mlFoling-酚法559.42148.26考马斯亮蓝—G250法539.1516紫外法560450.258平均值552.857204.839离散程度分析极差20.85434.258标准差9.695181.743平均差9.138163．612相对极差0.0372.120相对标准差0.017536180240.8872480338相对平均差0.016528686440.798734616通过表6.2-2，可以明显看出，三个用于恒量数据离散程度的参数，待测液2的数值都远大于待测液1。计算可得，我们有把握认为二者存在明显的显著性差异。 分析待测液1和待测液2的差异，我们可以认为非蛋白质因素会对蛋白质测量造成一定影响。其影响程度可以参考此表。6.2.2全班实验数据汇总与离散程度分析表6.2-3全班实验数据汇总方法待测液1浓度μg/ml待测液2浓度μg/ml豆芽蛋白含量（%）Foling-酚法561.24149.790.49考马斯亮蓝（G—250）法556.0419.690.06紫外法541.64368.271.21表6.2-4全班实验数据离散程度分析方法待测液1浓度/ug/ml待测液2浓度/ug/mlFoling-酚法561.24149.79考马斯亮蓝—G250法556.0419.69紫外法541.64368.27平均值552.973179.25离散程度分析极差19.6348.58标准差8.290143.823平均差7.556126.013相对极差0.0351.94相对标准差0.0149922040.802364226相对平均差0.0136635080.703003254注：根据Q检验，舍去王俐颖和梁雨溪组考马斯亮蓝法待测液1的数据。根据表6.2-4，去除个体实验的差异。待测液1和待测液2两组数据的离散程度有明显的差异。通过显著性检验，我们有把握认为两种待测液的测定有着显著的差异。同6.2-2我们可以认为非蛋白质因素会对三种实验方法的测定带来明显的干扰。其干扰程度可参考此表。结论与展望7.1非蛋白质干扰因素对实验方法的影响根据小组以及全班的最终的离散度分析和比较，我们确实有把握认为由生物组织未知性带来的非蛋白质因素的干扰会对蛋白质含量的测定带来一定程度的干扰。而且通过三种方法，用三种表现离散程度的参数——极差、标准差、平均差的相对值都有着相同的规律，即待测液2测量值的波动程度显著大于待测液1的测量值。因此，我们能够认为，非蛋白质干扰因素对实验中所使用的三种实验方法的测定有一定的影响，因此同一类甚至同一物种的测定需要有多种。7.2减小误差操作的结果 为了减小误差，在最终的数据处理中，我们采用了使用班级11组数据来进行误差的消除。同时通过两次Q检验，一次去除小组中极端数据的出现以及班级汇总数据中极端数据的出现。参考与最终的实验结果及7.1的结论来看，我们预计待测液1的波动程度会比较小，增加实验组后波动程度会更趋近于比较小的离散。比较小组数据和班级数据中的标准差、极差、平均差的数据来看，数据组的增加确实降低了待测液1测定样本的离散程度，对误差的降低有着一定的意义。同时说明了，多组重复实验的重要性。7.3朗伯-比尔定律的适用范围表7.3测定朗伯-比尔定律适用范围数据结果试管编号G1’G2’G3’G4’G5’G6’1000μg/mlBSA原液（ml）即考马斯亮蓝法中的G10.20.40.60.81.0蒸馏水（ml）0.80.60.40.20G-250溶液各5ml混匀，室温2minOD5950.0001.0881.4361.5591.5811.612图7.3朗伯-比尔定律标准曲线我们尝试了使用高浓度的蛋白质为标准曲线的测定点。实验结果表明，标准曲线中的散点，不能近似的作为线性标准曲线。说明在实际的测量中，利用比色法测定蛋白质浓度，有一定的浓度试用范围，一旦测量超出范围的蛋白质溶液或利用超出范围的标准蛋白绘制标准曲线，都会对最后总测定的蛋白质的测定结果的准确度有一定的影响。思考题请分析比色法中生物材料的处理上合适的稀释倍数是如何确定的以及对测定结果的影响。在之前考马斯亮蓝高浓度实验已经表明说明在实际的测量中，朗伯-比尔定律具有一定的浓度试用范围，一旦测量超出范围的蛋白质溶液或利用超出范围的标准蛋白绘制标准曲线，都会对最后总测定的蛋白质的测定结果的准确度有一定的影响。因此若要想能够较为准确的测定出蛋白质的含量，我认为需要做预实验，测量出较适用于朗伯-比尔定律的浓度范围，再在此范围内进行蛋白质含量的测定。比色法实验结果最主要的误差来源是什么？为什么？如何消除？我认为是统一标准曲线下的不同待测物与显色剂反应时间不同，导致蛋白和色素结合不均而造成的误差。要消除这种误差，就要严格统一操作标准，操作时间，严格控制变量，来尽量减小误差。在Folin--‐酚法中试剂甲的作用是什么？为什么需要此步设计？试剂甲相当于双缩脲试剂，在碱性条件下与蛋白质发生双缩脲反应，生成蓝色络合物。其作用有两点：一是双缩脲反应的引入提高了反应的灵敏程度；二是减少了氨基酸组成差异对测定结果的影响。试剂乙是酚试剂，依赖于含有酚基的氨基酸，所以蛋白质的氨基酸组成的不同会引起显色的偏差，双缩脲反应的引入会使这种偏差相对减小。在Folin--‐酚法中为什么加入试剂乙后要立刻混匀？否则将会如何影响测定结果？试剂乙的作用是在碱性的条件下被蛋白质中的酚羟基还原成蓝色。但是试剂乙的主要成分是磷钼酸、磷钨酸等，在碱性条件下不稳定，试剂甲的pH值为10，试剂乙加入后，其中的酸性物质会很快与氢氧根反应，造成试剂的损耗。这样就会造成与酚羟基的反应不充分，所得的蛋白质含量偏低。所以在加入试剂乙之后要立即混匀，尽量减少误差。标准蛋白用牛血清白蛋白（BSA）是否合理？为什么？如果认为不合理，那你分析应该用什么？为什么？我认为不太合理，因为BSA为动物蛋白，其中蛋白质构成以酪蛋白为主，而待测液2为绿豆芽下胚轴蛋白质的提取液，属于植物蛋白，缺少赖氨酸。因此两种蛋白的组成存在加大差异，在比色法中会造成误