马昌杯 第16章 RNA的生物合成 2014-11-26课件

1第十六章RNA的生物合成（转录）RNABiosynthesis(Transcription)2中南大学生命科学学院生物化学系马昌杯35吉尔伯特是“RNA世界”一词的提出者。此外，他也创造了外显子与内含子两个名词，来区分mRNA分子中的两个部分

转录（transcription）

生物体以DNA为模板合成RNA的过程

。

转录RNADNA

6逆转录：以RNA为模板在逆转录酶的作用下合成DNA的过程。都是酶促的核苷酸聚合过程都以DNA为模板都需依赖DNA的聚合酶聚合过程都是核苷酸之间生成磷酸二酯键都从5’至3’方向延伸聚核苷酸链都遵从碱基配对规律转录与复制的相似点7复制转录模板两股链均复制模板链转录（不对称转录）原料dNTPNTP酶DNA聚合酶RNA聚合酶产物子代双链DNA(半保留复制）mRNA，tRNA,rRNA等配对A-T、G-CA-U、G-C、T-A引物需要不要转录和复制的区别8一、原核生物转录的模板DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因(structuralgene)。

DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链，称为模板链(templatestrand)，也称作有意义链或Watson链。相对的另一股单链是编码链(codingstrand)，也称为反义链或Crick链。105335模板链编码链编码链模板链结构基因转录方向转录方向不对称转录(asymmetrictranscription)

在DNA分子双链上，一股链用作模板指引转录，另一股链不转录；模板链并非总是在同一单链上。12重点DNA聚合酶在启动DNA链延长时需要RNA引物存在，而RNA聚合酶不需要引物就能直接启动RNA链的延长。14

(NMP)n+NTP→(NMP)n+1+PPi（二）RNA聚合酶由多个亚基组成

大肠杆菌（E.coli）RNA聚合酶：4种亚基、、’、组成的五聚体蛋白质，分子量480kD。

亚基分子量亚基数目功能

36512

2决定哪些基因被转录150618

1催化聚合反应’155613

1结合DNA模板，双螺旋解链70263

1辨认起始点，结合启动子15核心酶（coreenzyme）：*2’

能独立催化模板指导的RNA合成，在转录延长全过程中均起作用全酶（holoenzyme）：*2’

，即亚基+核心酶

亚基的功能是辨认转录起始点，细胞内的转录起始需要全酶Acompleteenzymeconsistingtheapoenzymeportionplusthecofactorcomponent16Holoenzyme：

RNA聚合酶全酶及核心酶电泳图谱有证据表明，大肠杆菌RNA聚合酶还有第五个亚基（ω亚基）的存在，但功能不详。17RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合1820类风湿性关节炎

1959NobelPrizewinnerinPhysiologyorMedicineDNApolyArthurKornberg1918-2007RNApolySeveroOchoa1905-199321转录是不连续、分区段进行的；原核生物一个转录区段可视为一个转录单位，称为操纵子(operon)，包括若干个结构基因及其上游(upstream)的调控序列。

5335结构基因调控序列RNA-polRNA聚合酶结合模板DNA的部位，称为启动子(promoter)。三、RNA聚合酶结合到DNA的启动子上启动转录23RNA聚合酶保护法242627282.DNA双链打开，形成开放转录复合体(opentranscriptioncomplex)；1.RNApol识别并结合启动子，形成闭合转录复合体(closedtranscriptioncomplex)；RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3转录起始复合物:30一、转录起始需要RNA聚合酶全酶转录起始过程：3.RNA

pol催化生成第一个磷酸二酯键（GTP，ATP）：5-pppG-OH+NTP5-pppGpN-OH3+ppi31RNApol(2)-DNA-pppG/ApN-OH3转录起始复合物：二、RNApol核心酶独立延长RNA链1.第一个磷酸二酯键生成后，σ亚基即从转录起始复合物上脱落，并离开启动子，进入延长阶段。

2.RNApol核心酶留在DNA模板上，并沿DNA链不断前移，催化RNA链的延长。(NMP)n+NTP(NMP)n+1+PPi32RNA-pol（核心酶）

····DNA

····RNA33转录延长特点：核心酶负责延长反应；5’向3’延长；酶沿着模板链的3’端向5’方向前进；存在8bp的RNA-DNA杂合双链；模板DNA的双螺旋结构随着核心酶的移动发生解链和再复合的动态变化3453DNA核糖体RNARNA聚合酶在同一DNA模板上，有多个转录同时在进行；mRNA链上结合多个核糖体（转录尚未完成，翻译已在进行）转录过程中的羽毛状现象：35三、原核生物的转录延长与蛋白质的翻译同时进行E.coli的转录起始和延长

36依赖Rho(ρ)因子的转录终止非依赖ρ因子的转录终止四、原核生物转录终止指RNA聚合酶在DNA模板上停顿下来不再前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来。分类371、依赖ρ因子的转录终止

ρ因子是rho基因的产物，广泛存在于原核和真核细胞中，由6个亚基组成，结合在新生的RNA链上，由5’端向3’端的方向移动。协助RNA聚合酶识别新生RNA链上的终止信号，停止转录ρ因子有ATP酶的活性和解螺旋酶的活性38Rho因子与RNA结合后，Rho因子和RNA聚合酶发生构象变化，聚合终止；ATP酶及解螺旋酶使DNA/RNA杂化链拆离，利于产物从转录复合物中释放。39Rho因子结合RNARho因子作用原理402、非依赖Rho因子的转录终止DNA模板上靠近终止部位，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。转录产物的3’－末端常有多个连续的U，其上游的一段特殊碱基序列又可形成鼓槌状的茎环或发夹形式的二级结构。41茎环结构使转录终止的机理5´pppG5335RNA-pol②RNA产物3’端往往形成特殊的茎环结构，该结构使RNA聚合酶变构，阻碍RNA聚合酶前移，转录停顿。③转录产物中有密集的G-C配对，形成茎环结构，使得RNA/DNA杂化链更不稳定，转录复合物趋于解体。①转录产物的3’-末端发现多个连续的U，所有碱基配对中，rU:dA最不稳定。42真核生物RNA的生物合成RNABiosynthesisinEukaryote

第三节43一、真核生物有三种DNA依赖的RNA聚合酶44环八肽毒素种类IIIIII转录产物rRNA的前体45SrRNAmRNA前体hnRNA,miRNA5SrRNA,tRNA,snRNA对鹅膏蕈碱的反应耐受敏感高浓度下敏感细胞内定位核仁核内核内三种真核RNA聚合酶都由两个不同的大亚基和12-15个小亚基构成45RNA聚合酶Ⅱ最大亚基（RBP1）的羧基末端有一段共有序列为Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

的重复片段序列，称为CTD，是该酶起始RNA转录所必需的。转录起始阶段会出现CTD中Ser（丝氨酸）、Tyr(酪氨酸）及Thr（苏氨酸）的磷酸化。羧基末端结构域(Carboxyl-terminaldomain,CTD)46Science,2001,186347二、转录因子在真核生物转录起始中具有重要作用真核生物的基因转录过程：起始阶段、延长阶段、转录终止；显著不同的是，起始和延长过程都需要众多相关的蛋白质因子参与，这些因子被称为转录因子或反式作用因子。481、转录前起始复合体的形成不同物种、不同细胞或不同的基因，转录起始点上游都有不同的特异DNA序列，包括启动子、增强子等，统称为顺式作用元件(cis-actingelement)。49增强子是能够结合特异基因调节蛋白，促进邻近或远隔特定基因表达的DNA序列。50能直接或间接识别和结合启动子及其上游调节序列等顺式作用原件的蛋白质属于转录因子(transcriptionfactor,TF)，其中直接或间接结合RNA聚合酶，为转录起始前复合体装配所必需的，又称为通用转录因子或基本转录因子。51转录因子参与RNA-polⅡ转录的TFⅡ的作用

52转录前起始复合体转录起始时，真核生物RNApol不直接识别和结合模板的起始区，而是依靠转录因子识别并结合起始序列，生成转录前起始复合体

(preinitiationcomplex,PIC)。5354真核RNA聚合酶II与通用TF的作用过程55少数几个反式作用因子之间相互作用，再与基本转录因子、RNA聚合酶搭配而有针对性地结合并转录相应的基因。拼板理论(piecingtheory)2、少数几个反式作用因子的搭配启动特定基因的转录

三、转录延长过程中没有转录与翻译同步的现象真核生物转录延长过程与原核生物大致相似，但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。RNApol的前移处处都遇上核小体。通过体外转录实验可以观察到转录延长中核小体移位和解聚现象。56RNApolRNApolRNApol核小体转录延长中的核小体移位转录方向575------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点55333加尾AAAAAAA······3mRNA四、转录终止和加尾修饰同时进行58真核生物RNA的加工和降解第四节59转录的直接产物→初级RNA转录物加工

成熟的RNA（mRNA、tRNA、rRNA）加工主要在细胞核中进行605pppGp…5GpppGp…pppGppi鸟苷酸转移酶5m7GpppGp…甲基转移酶SAM（一）前体mRNA在5’-端加入“帽”结构5ppGp…磷酸酶Pi61一、核不均一RNA经首、尾修饰和剪接后成为mRNA帽子结构7-甲基鸟嘌呤62movie63（二）前体mRNA在3’-端特异位点断裂并加上多聚腺苷酸尾结构★

5’-末端的帽结构：m7G-5ppp5’-Np保护RNA免受核酸外切酶的水解促进核糖体与mRNA的结合、加速翻译的起始速度★

3’-末端的polyA结构:增强mRNA的稳定性，提高翻译效率参与mRNA从核内向胞质的转移真核生物mRNA的特点

（阅读框）64重点外显子（exon）

在断裂基因及其初级转录产物上出现，并表达为成熟RNA的核酸序列。结构基因中有表达活性的编码序列。

内含子（intron）

隔断基因的线性表达而在剪接过程中被除去的核酸序列。结构基因中无表达活性的非编码序列。65（三）前体mRNA的剪接主要是去除内含子前体mRNA分子有剪接和剪切两种模式

剪接就是去除初级转录产物上的内含子，把外显子连接为成熟的RNA；内含子区段弯曲，使相邻的两个外显子靠近而利于剪接，称为套索RNA（lariatRNA）；剪接过程的化学反应称为二次转酯反应；66

剪切就是剪去某些内含子，然后在上游的外显子3’端直接进行多聚腺苷酸化，不进行相邻外显子之间的连接反应。(ppG,pppG-OH)U-OHGpUpA第一次转酯反应第二次转酯反应UpAGpU外显子1内含子外显子2G-OHUpUpA剪接过程的二次转酯反应

(twicetransesterification)剪接体（spliceosome）是内含子剪接场所；68杂化核RNA：hetero-nuclearRNA,hnRNA

核小RNA：smallnuclearRNA,snRNA多种蛋白质

5种核小核糖核蛋白颗粒(snRNP)5种snRNAsnRNP与hnRNA结合成为剪接体

69Publishedonline20April2014“一对手拉手的情侣”活细胞内单个mRNA剪接变体的定量成像Averagenumberofexonspergenedoesvarywithorganism.酿酒酵母果蝇哺乳动物70

从酵母到哺乳动物，基因的大小差异极大，主要取决于内含子的大小。71Y:percentX:sizeofgene(kb)鸡卵清蛋白基因hnRNA首、尾修饰hnRNA剪接成熟的mRNA卵清蛋白基因及其转录、转录后修饰72卵清蛋白成熟mRNA与DNA模板链杂交电镜示意图DNAmRNA7374（四）mRNA编辑是对基因的编码序列进行转录后加工RNA编辑（RNAediting):

有些基因的蛋白质产物的氨基酸序列与基因的初级转录物序列并不完全对立，mRNA上的一些序列在转录后发生了改变，称为RNA编辑。二、真核rRNA前体经过剪接形成不同类别的rRNA转录45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA内含子内含子28S5.8S18S75三、前体tRNA的加工包括核苷酸的碱基修饰tRNA前体RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA761、剪切核糖核酸酶77tRNA核苷酸转移酶、连接酶ATPADP2、加上CCA-OH的3’-末端78（2）还原反应如：UDHU

（3）核苷内的转位反应如：Uψ（4）脱氨反应如：AI

如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）3、碱基修饰为稀有碱基79四、RNA催化一些真核和原核基因内含子的自剪接具有酶促活性（酶的活性）的RNA称为核酶。核酶(ribozyme)Ribonucleicacidwithcatalyticabilitywhosesubstrateisribonucleicacid8081四膜虫rRNA内含子的二级结构四膜虫rRNA的剪接采用内含子自我剪接方式5´-端核苷酸序列82最简单的核酶二级结构——锤头结构(hammerheadstructure)底物部分通常为60个核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份组成锤头结构

核酶能起作用的结构要求，至少含有3个茎（RNA分子内配对形成的局部双链），1至3个环（RNA分子局部双链鼓出的单链）和至少有13个一致性的碱基位点。83核酶研究的意义核酶的发现，对中心法则作了重要补充；核酶的发现是对传统酶学的挑战；利用核酶的结构设计合成人工核酶。84人工设计的核酶粗线表示合成的核酸分子细线表示天然的核酸分子X表示一致性序列箭头表示切断点85NatureBiotechnology,2001,5686脱氧核酶（DNAzyme)1.脱氧核酶在肿瘤治疗中的应用研究

脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的短片段单链DNA…

2.脱氧核酶分子诊断系统及其在肿瘤靶向治疗中的应用研究

肿瘤的个体化靶向治疗已成为临床肿瘤治疗的重要手段之一…

3、新型脱氧核酶DeliverySystem的研究

脱氧核酶将高效的催化降解能力与反义的靶向识别能力结合，能够特异地针对靶标从mRNA水平关闭靶基因，从而调控目标蛋白质的表达，是一种高效特异的靶向基因治疗的新策略…

脱氧核酶的基础和应用研究8788SunLQ,etal(CSU)Inamousetumorxenograftmodel,thecomplexwasshowntobedeliveredefficientlytotumortissue,downregulatingexpressionofLMP1andsuppressingtumorgrowth.TheseresultssuggestthatArg-nHAPmaybeanefficientvectorfornucleicacid-baseddrugswithpotentialclinicalapplication.肿瘤异种移植模型ACSNANO,2012,915089Importa