生物发光共振能量转移

生物发光共振能量转移生物发光共振能量转移生物发光共振能量转移资料仅供参考文件编号：2022年4月生物发光共振能量转移版本号：A修改号：1页次：1.0审核：批准:发布日期：BRET生物发光共振能量转移技术简介：生物发光共振能量转移（BRET）技术是近10年来出现的一种新的检测蛋白质-蛋白质相互作用的技术.它的最大优势是能在活细胞中实时进行检测，因此能够进行相互作用动力学的研究。在应用这个系统研究感兴趣的蛋白前，首先需要将Rluc或者EYFP融合到每个蛋白或者他们的辅蛋白上。在细胞中，融合蛋白共表达，然后和荧光素酶和其底物腔肠素反应，当能量供体Rluc，能量受体EYFP之间距离比较近的时候(10-100Å)，那么光将从Rluc(峰值480nm发射)传递到EYFP，形成它的激发，并且发射一个波长在530nm的发射光，BRET量化的程度以发射光530nm和480nm的比率表示。实验流程1、用于BRET的表达质粒构建；2、融合蛋白表达检测；3、BRET实验；4、实验结果分析及提交实验报告客户提供1、目的基因cDNA（也可由我公司提供基因克隆）2、用于实验细胞（如果我公司细胞库有可不需提供）公司提供详细实验步骤、使用仪器、及结果分析等详细实验报告。服务周期和价格具体咨询本公司荧光共振能量转移（FRET）荧光共振能量转移-FRET（FluorescentResonanceEnergyTransfer）

指两个荧光发色基团在足够靠近时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向邻近的受体分子转移。

（1）FRET发生条件：

能量匹配：供体分子的发射光谱可以被受体分子吸收并产生荧光信号。供体分子的发射光谱应与受体分子的激发光谱必须有显著重叠（>30%）；

作用距离：供体分子与受体分子的作用距离为1-10nm；

FRET效率公式：用于计算分子/基团间作用距离R

偶极-偶极作用：供体分子与受体分子作用时的向量必须满足一定条件。

（2）FRET的应用：

通过FRET技术可以获得有关两个蛋白分子之间相互作用的空间信息（作用距离、作用方向、能量传递效率）。常用于解决如下问题：蛋白分子的共定位；蛋白分子聚合体；转录机制；转化途径；分子运动；蛋白折叠等生物学问题。

（3）FRET常见的供体-受体荧光分子对：荧光蛋白类：

染料类：

FRET检测HIV附属蛋白与细胞膜CD分子相互作用

摘自：AFlowCytometry-BasedFRETAssaytoIdentifyandAnalyseProtein-ProteinInteractionsinLivingCells

CarinaBanning,Jo¨rgVotteler,etal.

图释：流式细胞仪FACSAria检测FRET信号。（a）活的293T细胞分别单独转入CFP、YFP、CFP/YFP、CFP/YFP融合蛋白作为对照，确定最好的圈门方式为CFP/FRET。（b）293T细胞经过2%PFA处理后，YFP荧光强度出现明显下降。

筛选有相互作用的未知蛋白质的流程

图释：流式细胞仪FACSAria进行FACS-FRET高通量筛选感兴趣蛋白相互作用的未知蛋白。（a）FACS-FRET筛选流程。（b）在活的293T细胞中转入Vpu-YFP作为诱饵，与等量的CFP融合蛋白（蛋白的cDNA库）相互作用36小时后，分选FERT+细胞。

FRET研究蛋白酶功能

摘自：DetectionofInfectivePoliovirusbyaSimple,Rapid,andSensitiveFlowCytometryMethodBasedonFluorescenceResonanceEnergyTransferTechnology

JasonL.Cantera

etal.Appliedandenvironmental

microbiology,Jan.2010,p.584-588

图释：流式细胞仪FACSAria检测脊髓灰质炎病毒（PV1）10倍感染BGM-PV细胞，8小时后上机检测。A~C病毒浓度分别为0.4~0.004，D为阴性对照。双分子荧光互补技术BiFC（BimolecularFluorescenceComplementation）

是将荧光报告蛋白按照规则分成没有荧光的两段，分别与诱饵蛋白和捕获蛋白融合，只有在诱饵蛋白和捕获蛋白发生相互作用的情况下，两段不完整的荧光报告蛋白才会形成完整的报告蛋白，发出荧光。活细胞收集后，在流式细胞仪中的检测是实时进行的，只要细胞中有荧光产生就会被捕捉到信号，因此，不论是亲和力较弱的结合还是暂时性的结合都不会被遗漏。

双分子荧光互补技术原理示意图(a)诱饵和捕获蛋白分别携带CYFP和NYFP两段YFP荧光蛋白片段(b)诱饵和捕获蛋白结合同时CYFP与NYFP形成YFP(c)形成的YFP发出荧光

（1）BiFC检测的特点：

活细胞分析；

可以用于研究2种或2种以上的启动子调控之下的蛋白质相互作用；

具有很高的信噪比，弱蛋白相互作用也可以检测到（>7nm）。

（2）可用于BiFC的荧光蛋白：

GFP、BFP、CFP、YFP，生理条件可用的黄色的Venus和citrine，青色的cerulean；

红色系统：mRFP2Q66T、mCherry；

Venus（EYFP的变体）是目前用于BiFC分析最多的荧光蛋白，因为其荧光强且背景敏感度降低，是BiFC分析理想的荧光蛋白。

常见的用于双分子荧光互补技术的荧光蛋白

BiFC研究复合体中亚基间的相互作用

摘自：DetectionandCharacterizationofInfluenzaAVirusPA-PB2InteractionthroughaBimolecularFluorescenceComplementationAssay

JosephN.Hemerka,DanWang,etal.JOURNALOFVIROLOGY,Apr.2009,p.3944-3955

图释：流式细胞仪FACSCalibur检测流感病毒复合体中亚基PA-PB2间的相互作用。（B）流式检测同时转入PA/PB2的COS-1细胞及单转入PA-VC的细胞的Venus荧光信号，显示转入24小时后的荧光强度。（C）萤火虫荧光蛋白酶显示，转入单或双质粒的细胞，萤火虫荧光蛋白酶活性一致。

BiFC研究信号传导通路中蛋白质间的相互作用

摘自：Characterizationofthelatentmembraneprotein1signalingcomplexofEpstein-Barrvirusinthemembraneofmammaliancellswithbimolecularfluorescencecomplementation

PoojaTalaty,AmandaEmery,etal.VirologyJournal2011,8:414

图释：流式细胞仪FACSLSRII检测BiFC信号。LMP1-NYFP和LMP1-NYFP突变体分别与CYFP-TRAF2、CYFP-TRAF3转入细胞内，检测其相互作用。曲线蓝色部分为出现YFP的荧光阳性表达，表明LMP1与CYFP、CYFP均存在相互作用。科普一下SCI

《科学引文索引》（ScienceCitationIndex,简称SCI）于1957年由美国科学信息研究所（InstituteforScientificInformation,简称ISI）在美国费城创办，是由美国科学信息研究所(ISI)1961年创办出版的引文数据库。SCI(科学引文索引)、EI(工程索引)、ISTP(科技会议录索引)是世界著名的三大科技文献检索系统，是国际公认的进行科学统计与科学评价的主要检索工具。

1976年，ISI在SCI基础上引出期刊引用报告（journalcitationreport,JCR），提供了一套统计数据，展示科学期刊被引用情况、发表论文数量以及论文的平均被引用情况。在JCR中可以计算出每种期刊的影响因子（ImpactFactor,IF）。影响因子的高低，在一定程度上可以反应一个期刊的影响力。

（百度百科）

期刊的影响因子(Impactfactor；IF)计算方式：

IF2014=(该杂志2012-2013年发表文章在2014年被引用的次数/

(该杂志2012-2013年发表文章的总数)

附件是最近两年的SCI期刊列表，2014年植物学类我红色标注了部分，不过期刊名都是缩写，2013年的是全称期刊名。影响因子从高到低排列，大体代表了期刊的水平档次。

三大国际顶尖期刊CNS，指CELL，NATURE，SCIENCE。

国际植物学专业期刊中，最好的研究论文期刊是PlantCell（IF2004=9.338），当然今年新创刊的NATUREPLANTS估计不久的