细胞免疫荧光技术课件

细胞免疫荧光技术细胞免疫荧光技术1实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理2实验原理原位检测抗原抗体特异反应间接法间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记的抗抗体激发光显示荧光Hela细胞Vinculin实验原理原位检测间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记3实验用品试剂:固定液:4%PFA细胞通透:0、2%TritonX封闭试剂:10%正常山羊血清一抗:小鼠源抗Vinculin单克隆抗体二抗:AlexaFluor555标记的山羊抗小鼠IgGDAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)PBS洗涤缓冲液:PH7、4材料:Hela细胞细胞培养皿仪器:荧光显微镜实验用品试剂:材料:4实验步骤一,细胞制备与细胞固定将细胞铺在24孔板中将细胞培养至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗涤PBS洗涤实验步骤一,细胞制备与细胞固定将细胞铺在将细胞培养加5实验步骤二,细胞免疫荧光ICC染色0、2%TritonX处理5min封闭室温30min4℃过夜37℃1-2小时37℃5-10min荧光显微镜观察加入一抗加入二抗加入DAPI复染PBS洗涤PBS洗涤PBS洗涤实验步骤二,细胞免疫荧光ICC染色0、2%封6实验结果三,观察

humanHeLacells实验结果三,观察

humanHeLacells7实验中应注意的问题

细胞不要铺的过密:60-70%防止细胞污染

固定时间不要太长,一般10-30min

TrionX处理时间不宜过长,膜蛋白可不必处理选择合适的封闭液二抗孵育后,一定要洗干净必要时用恒温摇床摇洗实验中应注意的问题细胞不要铺的过密:60-70%8

1、免疫荧光技术

2、免疫酶技术

3、免疫亲与技术

4、胶体金技术

标记物

使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质免疫细胞化学技术1、免疫荧光技术标记物免疫细胞化学技术9免疫细胞化学技术注意事项选择合适的方法材料要留好选择抗体选择标记酶封闭液的选择设定对比实验免疫细胞化学技术注意事项选择合适的方法10考虑题检测Hela细胞中蛋白A定位情况,考虑应选择什么方法,用什么仪器观察？A考虑题检测Hela细胞中蛋白A定位情况,考虑应选择什么方法,11疑难解答一,缺乏染色

可能的原因无抗原抗体失效固定不充分过度固定抗原修复无效不兼容的二抗和一抗漏用试剂或未按正确的顺序加入试剂相应的措施用原位杂交方法检测蛋白表达按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融增加固定时间或改用不同的固定剂减少固定时间;抗原修复增加修复时间或更换修复液使用可以与一抗结合的二抗重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序疑难解答一,缺乏染色可能的原因相应的措施12二,高背景二,高背景13

可能的原因一抗或二抗的浓度过高一抗和/或二抗与组织的非特异性结合组织过于干燥试剂粘附在旧的或未制备好的玻片上相应的措施预实验摸索最佳浓度一抗孵育前封闭(最好是二抗来源的血清)在染色过程中避免组织干燥用新鲜制备或购买的玻片进行实验可能的原因相应的措施14三,细胞/组织的形态被破坏三,细胞/组织的形态被破坏15

可能的原因抗原修复方法过于剧烈组织切片从玻片上脱落组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡组织形态难以分辨组织固定不充分,自发裂解

相应的措施预实验摸索合适的修复条件增加固定时间;烤片;使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水及时固定;增加固定时间;提高固定剂/组织的比例;

将组织切得较小可能的原因相应的措施16四,染色不正确

可能的原因固定方法对于抗原不合适抗原修复方法不合适没有及时固定引起抗原的扩散

相应的措施尝试不同的固定剂或增加固定时间尝试改变抗原修复条件立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换有机(醇类)固定剂四,染色不正确可能的原因相应的措施17感谢您的聆听！感谢您的聆听！18细胞免疫荧光技术细胞免疫荧光技术19实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理20实验原理原位检测抗原抗体特异反应间接法间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记的抗抗体激发光显示荧光Hela细胞Vinculin实验原理原位检测间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记21实验用品试剂:固定液:4%PFA细胞通透:0、2%TritonX封闭试剂:10%正常山羊血清一抗:小鼠源抗Vinculin单克隆抗体二抗:AlexaFluor555标记的山羊抗小鼠IgGDAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)PBS洗涤缓冲液:PH7、4材料:Hela细胞细胞培养皿仪器:荧光显微镜实验用品试剂:材料:22实验步骤一,细胞制备与细胞固定将细胞铺在24孔板中将细胞培养至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗涤PBS洗涤实验步骤一,细胞制备与细胞固定将细胞铺在将细胞培养加23实验步骤二,细胞免疫荧光ICC染色0、2%TritonX处理5min封闭室温30min4℃过夜37℃1-2小时37℃5-10min荧光显微镜观察加入一抗加入二抗加入DAPI复染PBS洗涤PBS洗涤PBS洗涤实验步骤二,细胞免疫荧光ICC染色0、2%封24实验结果三,观察

humanHeLacells实验结果三,观察

humanHeLacells25实验中应注意的问题

细胞不要铺的过密:60-70%防止细胞污染

固定时间不要太长,一般10-30min

TrionX处理时间不宜过长,膜蛋白可不必处理选择合适的封闭液二抗孵育后,一定要洗干净必要时用恒温摇床摇洗实验中应注意的问题细胞不要铺的过密:60-70%26

1、免疫荧光技术

2、免疫酶技术

3、免疫亲与技术

4、胶体金技术

标记物

使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质免疫细胞化学技术1、免疫荧光技术标记物免疫细胞化学技术27免疫细胞化学技术注意事项选择合适的方法材料要留好选择抗体选择标记酶封闭液的选择设定对比实验免疫细胞化学技术注意事项选择合适的方法28考虑题检测Hela细胞中蛋白A定位情况,考虑应选择什么方法,用什么仪器观察？A考虑题检测Hela细胞中蛋白A定位情况,考虑应选择什么方法,29疑难解答一,缺乏染色

可能的原因无抗原抗体失效固定不充分过度固定抗原修复无效不兼容的二抗和一抗漏用试剂或未按正确的顺序加入试剂相应的措施用原位杂交方法检测蛋白表达按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融增加固定时间或改用不同的固定剂减少固定时间;抗原修复增加修复时间或更换修复液使用可以与一抗结合的二抗重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序疑难解答一,缺乏染色可能的原因相应的措施30二,高背景二,高背景31

可能的原因一抗或二抗的浓度过高一抗和/或二抗与组织的非特异性结合组织过于干燥试剂粘附在旧的或未制备好的玻片上相应的措施预实验摸索最佳浓度一抗孵育前封闭(最好是二抗来源的血清)在染色过程中避免组织干燥用新鲜制备或购买的玻片进行实验可能的原因相应的措施32三,细胞/组织的形态被破坏三,细胞/组织的形态被破坏33

可能的原因抗原修复方法过于剧烈组织切片从玻片上脱落组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡组织形态难以分辨组织固定不充分,自发裂解

相应的措施预实验摸索合适的修复条件增加固定时间;烤片;使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水及时固定;增加固定时间;提高固定剂/组