研究生讲课肿瘤干细胞课件

肿瘤干细胞高全立河南省肿瘤医院生物治疗科1编辑ppt肿瘤干细胞1编辑ppt干细胞生物学特性干细胞有自我复制更新能力：通常情况下只有干细胞具有分裂产生子代干细胞的能力干细胞有定向分化为功能细胞能力已经定向分化的细胞一般情况下不能逆转化为干细胞2编辑ppt干细胞生物学特性2编辑ppt干细胞分类根据来源分类

胚胎干细胞成体干细胞根据分化潜能分类：全能干细胞多能干细胞单能干细胞3编辑ppt干细胞分类根据来源分类3编辑ppt胚胎干细胞培育过程4编辑ppt胚胎干细胞培育过程4编辑ppt干细胞的再编程核移植如克隆羊多莉细胞融合基因转染：iPS

OCT4,SOX2,KLF4,c-MYC小分子化合物诱导：5编辑ppt干细胞的再编程核移植如克隆羊多莉5编辑ppt多能干细胞多向分化图

横向分化亚全能干细胞？6编辑ppt多能干细胞多向分化图肿瘤的异质性—肿瘤干细胞Reya,T.,etal.Nature.2001.414.105-1117编辑ppt肿瘤的异质性—肿瘤干细胞Reya,T.,etal.Nat肿瘤干细胞的起源由正常干细胞经多基因多步骤突变累积而来由骨髓来源的干细胞与基因发生改变的组织细胞融合而来由基因发生改变已分化的细胞逆转化而来8编辑ppt肿瘤干细胞的起源由正常干细胞经多基因多步骤突变累积而来8编辑CancerstemcellsshouldbethetherapytargetReya,T.,etal.Nature.2001.414.105-1119编辑pptCancerstemcellsshouldbeth肿瘤干细胞的特性维持肿瘤生长的基础具有自我更新和多向分化的能力肿瘤组织中含量极低对常用的治疗方法耐药：如化疗、放疗、分子靶向治疗。免疫治疗如何？10编辑ppt肿瘤干细胞的特性维持肿瘤生长的基础10编辑pptABC转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用ABC转运子示意图(通过水解ATP将多种化疗药物泵出细胞外）

11编辑pptABC转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用ABC转运子示意图肿瘤干细胞的可变性易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维细胞的特性非肿瘤干细胞可通过EMT转变为肿瘤干细胞12编辑ppt肿瘤干细胞的可变性易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维细胞的EMT-表皮细胞向间质细胞转化

MET-间质细胞向表皮细胞转化13编辑pptEMT-表皮细胞向间质细胞转化

MET-间质细胞向表皮细胞转肿瘤干细胞的间质细胞学特性EMT（表皮细胞向间质细胞转化）是肿瘤侵袭和转移的主要机制之一，肿瘤干细胞易于侵袭和转移。多个实验证实肿瘤干细胞具有间质细胞的生物学特性。乳腺上皮细胞系通过EMT可产生乳腺癌干细胞。14编辑ppt肿瘤干细胞的间质细胞学特性EMT（表皮细胞向间质细胞转化）是肿瘤干细胞的表面分子标记CD44：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，大肠癌

CD133：脑胶质瘤，大肠癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，恶性黑色素瘤，卵巢癌CD90：肝癌，肺癌CD24：胰腺癌阳性，乳腺癌阴性CD117：卵巢癌CD278：恶性黑色素瘤15编辑ppt肿瘤干细胞的表面分子标记CD44：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌肿瘤干细胞表面标记与预后CD44：头颈部鳞癌的预后不良标记。乳腺癌中12个研究中的898例meta分析，CD44为预后不良的标记。大肠癌中存在争议。CD133：脑胶质瘤高表达预后差。大肠癌高表达预后差，肺癌有争议。外周血CD133mRNA的表达水平与预后相关（JClinOncol,201129(12):1547-55).

16编辑ppt肿瘤干细胞表面标记与预后CD44：头颈部鳞癌的预后不良标记。肿瘤干细胞高表达胚胎干细胞相关基因Oct4Sox2NANOGKlfBmi1C-Myc17编辑ppt肿瘤干细胞高表达胚胎干细胞相关基因Oct417编辑ppt胚胎干细胞基因与肿瘤预后的关系Oct4：肺癌及乳腺癌中高表达分化差，预后差Sox2：口腔鳞癌、食管癌高表达预后差，而肺鳞癌中高表达预后良好的指标。NANOG：口腔鳞癌中高表达预后差，大肠癌中的表达与预后无关。c-Myc：与多种肿瘤的预后不良相关。18编辑ppt胚胎干细胞基因与肿瘤预后的关系Oct4：肺癌及乳腺癌中高表达EMT相关基因与肿瘤的预后的关系E-cadherinN-cadherinVimentin尽管存在争议，一些文章支持与肿瘤的预后相关19编辑pptEMT相关基因与肿瘤的预后的关系E-cadherin19编辑肿瘤干细胞其它功能基因与预后ALDH1（乙醛脱氢酶1）：ALDEFLUOR的试剂来分选ALDH-1阳性细胞。其表达与多种肿瘤的预后明显相关。ABC转运子家族蛋白：MDR1，ABCG2，ABCB5等，其功能与SP细胞相关。其表达于预后的关系不明确。20编辑ppt肿瘤干细胞其它功能基因与预后20编辑ppt肿瘤干细胞是否存在的争议正常组织的干细胞所占比例很低，而某些肿瘤含有很高比例的肿瘤干细胞。非肿瘤干细胞很容易通过EMT转变为肿瘤干细胞。21编辑ppt肿瘤干细胞是否存在的争议正常组织的干细胞所占比例很低，而某些免疫标记技术22编辑ppt免疫标记技术22编辑ppt抗原抗体反应23编辑ppt抗原抗体反应23编辑ppt免疫组化技术基本原理常用酶标抗体间接法24编辑ppt免疫组化技术基本原理24编辑ppt免疫组化的优缺点优点：特异性敏感性定位性缺点：假阳性率高设计好对照是关键：阴性对照、阳性对照、自身对照25编辑ppt免疫组化的优缺点优点：特异性敏感性定位性25编辑ppt26编辑ppt26编辑ppt免疫荧光基本原理27编辑ppt免疫荧光基本原理27编辑ppt28编辑ppt28编辑ppt流式细胞仪的工作原理29编辑ppt流式细胞仪的工作原理29编辑ppt流式细胞仪30编辑ppt流式细胞仪30编辑ppt流式细胞仪的应用细胞生物学肿瘤些免疫学血液学药物学31编辑ppt流式细胞仪的应用细胞生物学31编辑ppt流式细胞结果分析（散点图）32编辑ppt流式细胞结果分析（散点图）32编辑ppt33编辑ppt33编辑ppt流式细胞分析34编辑ppt流式细胞分析34编辑ppt肺癌干细胞的分离鉴定

35编辑ppt肺癌干细胞的分离鉴定35编辑pptTUMORSAMPLEDIGESTION:-CollagenaseI37ºC-2hours-Washing

SINGLECELLSUSPENSIONCULTURING:Serumfreemedium原代肺癌细胞培养36编辑pptTUMORSAMPLEDIGESTION:SINGLEC原代培养建立的肺癌细胞系

Wehaveestablished5squamouscarcinoma(B),4adenocarcinoma(D),1largecelllungcancer(C),1smallcelllungcancer(A),and1lungcarcinoidcelllines.37编辑ppt原代培养建立的肺癌细胞系37编辑ppt原代培养的肺癌细胞在NOD/SCID小鼠能形成肿瘤38编辑ppt原代培养的肺癌细胞在NOD/SCID小鼠能形成肿瘤38编辑原代培养的肺癌细胞中含有一小群CD44强阳性的细胞Smallcelllungcancer(LC004),largecelllungcancer(LC006)havecd44strongpositivepopulationcells.39编辑ppt原代培养的肺癌细胞中含有一小群CD44强阳性的细胞39编CD44强阳性细胞具有较强的增值能力

Whenseeded500cells/well,therewasnoobviousdifferencebetweentheCD44++andCD44+/-cells(figureA),butwhenseeded150cells/well,CD44++cellsmuchstrongerproliferativeability(figureB).40编辑pptCD44强阳性细胞具有较强的增值能力40编辑pptCD44++细胞具有较强的克隆形成能力A:largecelllungcancercellline(LC006)B:smallcelllinecellline(LC004)41编辑pptCD44++细胞具有较强的克隆形成能力41编辑ppt只有CD44++的细胞可以形成holocloneWhensinglecellseededinto96wellplate,onlyCD44++CD+cellscouldformholoclone,100CD44++CD90+cellscouldformabout1-3holoclones.42编辑ppt只有CD44++的细胞可以形成holoclone42编辑pp只有CD44++的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球A&C:cellspheresformedbyCD44++cellsofLC-006andLC021.B&D:

no

cellsphereformedbyCD44++cellsofLC-006andLC021.43编辑ppt只有CD44++的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球43编辑部分原代培养的肺癌细胞表达CD90A:watchedbybluefluorescentlight,B:watchedbyredfluorescentlight,C:watchedbywhitelight,D:overlapofAandB44编辑ppt部分原代培养的肺癌细胞表达CD90A:watchedby肺癌细胞表达CD44++CD90+4maintypesoflungcancer,adenocarcinoma(LC007),squamouscarcinoma(LC021),smallcelllungcancer(LC004)andlargecelllungcancer(LC006)allhadtheCD44++CD90+smallpopulationcells.45编辑ppt肺癌细胞表达CD44++CD90+45编辑ppt大细胞肺癌中的CD44++CD90+和CD44++CD90-细胞具有间质细胞的形态A:CD44++CD90+.B:CD44++CD90-C:CD44+CD90+D:CD44+CD90-46编辑ppt大细胞肺癌中的CD44++CD90+和CD44++CD9大细胞肺癌中的CD44++CD90+细胞高表达胚胎干细胞和间质细胞相关的基因47编辑ppt大细胞肺癌中的CD44++CD90+细胞高表达胚胎干细胞和间鳞癌细胞CD44++CD90+和CD44++CD90-具有间质细胞的形态A:LC021-P3beforesorting.B:CD44++CD90+.C:CD44++CD90-.D:CD44+CD90+.E:CD44+CD90-.48编辑ppt鳞癌细胞CD44++CD90+和CD44++CD90-具CD44++CD90+的鳞癌细胞具有最强的细胞球形成能力和X线抵抗能力

49编辑pptCD44++CD90+的鳞癌细胞具有最强的细胞球形成能力和X

CD44++CD90+的大细胞肺癌具有最强的细胞球形成能力和X线抵抗能力50编辑pptCD44++CD90+的大细胞肺癌具有最强的细胞球形成能力TGF-β1对肿瘤细胞的作用

抑制肿瘤细胞的生长。使肿瘤细胞恶性程度增强。诱导肿瘤细胞产生EMT。51编辑pptTGF-β1对肿瘤细胞的作用抑制肿瘤细胞的生长。51编辑

TGF-β1对CD44++CD90+大细胞肺癌抑制能力最弱52编辑pptTGF-β1对CD44++CD90+大细胞肺癌抑制能TGF-β1诱导肺癌细胞产生EMT53编辑pptTGF-β1诱导肺癌细胞产生EMT53编辑pptTGF-β1增加CD44++CD90+大细胞肺癌细胞的比例54编辑pptTGF-β1增加CD44++CD90+大细胞肺癌细胞的比例5TGF-β1处理过的CD44++CD90+同样具有最强的X线照射抵抗能力

55编辑pptTGF-β1处理过的CD44++CD90+同样具有最强的XlungcancercellscouldpartlyreturnoriginalcharactersafterretreatingTGF-β156编辑pptlungcancercellscouldpartlyTGF-β1对CD44++CD90+的鳞癌细胞抑制能力最弱57编辑pptTGF-β1对CD44++CD90+的鳞癌细胞抑制能力TGF-β1选择性地增加CD44++CD90+鳞癌细胞的比例58编辑pptTGF-β1选择性地增加CD44++CD90+鳞癌细胞Tumorcellsformedby“Tip-SP”cellsinNOD/SCIDmicemaintainstableSPratio59编辑pptTumorcellsformedby“Tip-SP”60编辑ppt60编辑ppt肿瘤干细胞高全立河南省肿瘤医院生物治疗科61编辑ppt肿瘤干细胞1编辑ppt干细胞生物学特性干细胞有自我复制更新能力：通常情况下只有干细胞具有分裂产生子代干细胞的能力干细胞有定向分化为功能细胞能力已经定向分化的细胞一般情况下不能逆转化为干细胞62编辑ppt干细胞生物学特性2编辑ppt干细胞分类根据来源分类

胚胎干细胞成体干细胞根据分化潜能分类：全能干细胞多能干细胞单能干细胞63编辑ppt干细胞分类根据来源分类3编辑ppt胚胎干细胞培育过程64编辑ppt胚胎干细胞培育过程4编辑ppt干细胞的再编程核移植如克隆羊多莉细胞融合基因转染：iPS

OCT4,SOX2,KLF4,c-MYC小分子化合物诱导：65编辑ppt干细胞的再编程核移植如克隆羊多莉5编辑ppt多能干细胞多向分化图

横向分化亚全能干细胞？66编辑ppt多能干细胞多向分化图肿瘤的异质性—肿瘤干细胞Reya,T.,etal.Nature.2001.414.105-11167编辑ppt肿瘤的异质性—肿瘤干细胞Reya,T.,etal.Nat肿瘤干细胞的起源由正常干细胞经多基因多步骤突变累积而来由骨髓来源的干细胞与基因发生改变的组织细胞融合而来由基因发生改变已分化的细胞逆转化而来68编辑ppt肿瘤干细胞的起源由正常干细胞经多基因多步骤突变累积而来8编辑CancerstemcellsshouldbethetherapytargetReya,T.,etal.Nature.2001.414.105-11169编辑pptCancerstemcellsshouldbeth肿瘤干细胞的特性维持肿瘤生长的基础具有自我更新和多向分化的能力肿瘤组织中含量极低对常用的治疗方法耐药：如化疗、放疗、分子靶向治疗。免疫治疗如何？70编辑ppt肿瘤干细胞的特性维持肿瘤生长的基础10编辑pptABC转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用ABC转运子示意图(通过水解ATP将多种化疗药物泵出细胞外）

71编辑pptABC转运蛋白在肿瘤干细胞多药耐药中的作用ABC转运子示意图肿瘤干细胞的可变性易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维细胞的特性非肿瘤干细胞可通过EMT转变为肿瘤干细胞72编辑ppt肿瘤干细胞的可变性易于转化为间质样细胞，表达许多成纤维细胞的EMT-表皮细胞向间质细胞转化

MET-间质细胞向表皮细胞转化73编辑pptEMT-表皮细胞向间质细胞转化

MET-间质细胞向表皮细胞转肿瘤干细胞的间质细胞学特性EMT（表皮细胞向间质细胞转化）是肿瘤侵袭和转移的主要机制之一，肿瘤干细胞易于侵袭和转移。多个实验证实肿瘤干细胞具有间质细胞的生物学特性。乳腺上皮细胞系通过EMT可产生乳腺癌干细胞。74编辑ppt肿瘤干细胞的间质细胞学特性EMT（表皮细胞向间质细胞转化）是肿瘤干细胞的表面分子标记CD44：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，大肠癌

CD133：脑胶质瘤，大肠癌，胰腺癌，肺癌，肝癌，恶性黑色素瘤，卵巢癌CD90：肝癌，肺癌CD24：胰腺癌阳性，乳腺癌阴性CD117：卵巢癌CD278：恶性黑色素瘤75编辑ppt肿瘤干细胞的表面分子标记CD44：乳腺癌，头颈部鳞癌，胰腺癌肿瘤干细胞表面标记与预后CD44：头颈部鳞癌的预后不良标记。乳腺癌中12个研究中的898例meta分析，CD44为预后不良的标记。大肠癌中存在争议。CD133：脑胶质瘤高表达预后差。大肠癌高表达预后差，肺癌有争议。外周血CD133mRNA的表达水平与预后相关（JClinOncol,201129(12):1547-55).

76编辑ppt肿瘤干细胞表面标记与预后CD44：头颈部鳞癌的预后不良标记。肿瘤干细胞高表达胚胎干细胞相关基因Oct4Sox2NANOGKlfBmi1C-Myc77编辑ppt肿瘤干细胞高表达胚胎干细胞相关基因Oct417编辑ppt胚胎干细胞基因与肿瘤预后的关系Oct4：肺癌及乳腺癌中高表达分化差，预后差Sox2：口腔鳞癌、食管癌高表达预后差，而肺鳞癌中高表达预后良好的指标。NANOG：口腔鳞癌中高表达预后差，大肠癌中的表达与预后无关。c-Myc：与多种肿瘤的预后不良相关。78编辑ppt胚胎干细胞基因与肿瘤预后的关系Oct4：肺癌及乳腺癌中高表达EMT相关基因与肿瘤的预后的关系E-cadherinN-cadherinVimentin尽管存在争议，一些文章支持与肿瘤的预后相关79编辑pptEMT相关基因与肿瘤的预后的关系E-cadherin19编辑肿瘤干细胞其它功能基因与预后ALDH1（乙醛脱氢酶1）：ALDEFLUOR的试剂来分选ALDH-1阳性细胞。其表达与多种肿瘤的预后明显相关。ABC转运子家族蛋白：MDR1，ABCG2，ABCB5等，其功能与SP细胞相关。其表达于预后的关系不明确。80编辑ppt肿瘤干细胞其它功能基因与预后20编辑ppt肿瘤干细胞是否存在的争议正常组织的干细胞所占比例很低，而某些肿瘤含有很高比例的肿瘤干细胞。非肿瘤干细胞很容易通过EMT转变为肿瘤干细胞。81编辑ppt肿瘤干细胞是否存在的争议正常组织的干细胞所占比例很低，而某些免疫标记技术82编辑ppt免疫标记技术22编辑ppt抗原抗体反应83编辑ppt抗原抗体反应23编辑ppt免疫组化技术基本原理常用酶标抗体间接法84编辑ppt免疫组化技术基本原理24编辑ppt免疫组化的优缺点优点：特异性敏感性定位性缺点：假阳性率高设计好对照是关键：阴性对照、阳性对照、自身对照85编辑ppt免疫组化的优缺点优点：特异性敏感性定位性25编辑ppt86编辑ppt26编辑ppt免疫荧光基本原理87编辑ppt免疫荧光基本原理27编辑ppt88编辑ppt28编辑ppt流式细胞仪的工作原理89编辑ppt流式细胞仪的工作原理29编辑ppt流式细胞仪90编辑ppt流式细胞仪30编辑ppt流式细胞仪的应用细胞生物学肿瘤些免疫学血液学药物学91编辑ppt流式细胞仪的应用细胞生物学31编辑ppt流式细胞结果分析（散点图）92编辑ppt流式细胞结果分析（散点图）32编辑ppt93编辑ppt33编辑ppt流式细胞分析94编辑ppt流式细胞分析34编辑ppt肺癌干细胞的分离鉴定

95编辑ppt肺癌干细胞的分离鉴定35编辑pptTUMORSAMPLEDIGESTION:-CollagenaseI37ºC-2hours-Washing

SINGLECELLSUSPENSIONCULTURING:Serumfreemedium原代肺癌细胞培养96编辑pptTUMORSAMPLEDIGESTION:SINGLEC原代培养建立的肺癌细胞系

Wehaveestablished5squamouscarcinoma(B),4adenocarcinoma(D),1largecelllungcancer(C),1smallcelllungcancer(A),and1lungcarcinoidcelllines.97编辑ppt原代培养建立的肺癌细胞系37编辑ppt原代培养的肺癌细胞在NOD/SCID小鼠能形成肿瘤98编辑ppt原代培养的肺癌细胞在NOD/SCID小鼠能形成肿瘤38编辑原代培养的肺癌细胞中含有一小群CD44强阳性的细胞Smallcelllungcancer(LC004),largecelllungcancer(LC006)havecd44strongpositivepopulationcells.99编辑ppt原代培养的肺癌细胞中含有一小群CD44强阳性的细胞39编CD44强阳性细胞具有较强的增值能力

Whenseeded500cells/well,therewasnoobviousdifferencebetweentheCD44++andCD44+/-cells(figureA),butwhenseeded150cells/well,CD44++cellsmuchstrongerproliferativeability(figureB).100编辑pptCD44强阳性细胞具有较强的增值能力40编辑pptCD44++细胞具有较强的克隆形成能力A:largecelllungcancercellline(LC006)B:smallcelllinecellline(LC004)101编辑pptCD44++细胞具有较强的克隆形成能力41编辑ppt只有CD44++的细胞可以形成holocloneWhensinglecellseededinto96wellplate,onlyCD44++CD+cellscouldformholoclone,100CD44++CD90+cellscouldformabout1-3holoclones.102编辑ppt只有CD44++的细胞可以形成holoclone42编辑pp只有CD44++的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球A&C:cellspheresformedbyCD44++cellsofLC-006andLC021.B&D:

no

cellsphereformedbyCD44++cellsofLC-006andLC021.103编辑ppt只有CD44++的细胞在超低粘附的培养板中形成细胞球43编辑部分原代培养的肺癌细胞表达CD90A:watchedbybluefluorescentlight,B:watchedbyredfluorescentlight,C:watchedbywhitelight,D:overlapofAandB104编辑ppt部分原代培养的肺癌细胞表达CD90A:watchedby肺癌细胞表达CD44++CD90+4maintypesoflungcancer,adenocarcinoma(LC007),squamouscarcinoma(LC021),smallcelllungcancer(LC004)andlargecelllungcancer(LC006)allhadtheCD44++CD90+smallpopulationcells.105编辑ppt肺癌细胞表达CD44++CD90+45编辑ppt大细胞肺癌中的CD44++CD90+和CD44++CD90-细胞具有间质细胞的形态A:CD44++CD90+.B:CD44++CD90-C:CD44+CD90+D:CD44+CD