皮肤储存新技术及临床应用课件

皮肤储存新技术及临床应用课件1皮肤储存新技术及临床应用课件2前言

据统计，目前世界每年大约有100万人因各种原因而烧（烫）伤。尤其大面积深度烧伤病人，治疗是一个漫长而复杂的过程。通常需要通过异体（种）皮片移植来覆盖创面，而皮源的缺乏往往成为治疗的关键问题之一前言据统计，目前世界每年大约有1003皮库的意义

54年前英国人Pickerill写下了这样一段话：“毫无争议，创伤整复手术成功的关键之一是有可供给的皮源覆盖因创伤带来的大面积皮肤缺损。实际上在某种情况下，对皮源需要超越一切。因此这启示我们应该注重皮肤的储存与临床应用。”皮库的意义54年前英国人Pickerill写下了4我院皮库简介：自1973年创建皮库以来，分别运用了4℃、-20℃和-80℃低温冰箱皮肤保存法以及液氮储皮方法1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用

我院皮库简介：自1973年创建皮库以来，分别运用了4℃、-25我院皮库简介：每年异体尸体皮采集及储存40余具深低温速冻异体皮保存方法的改进使保存皮片活力稳定保持在70%以上，皮片移植成活率达95%以上成为亚洲最大的皮库之一，已储存了3000余具活力良好的尸体皮，供全国30个省市300多家医院使用每年创利润数百万元，经济效益显著我院皮库简介：每年异体尸体皮采集及储存40余具6我院皮库简介：科研方面曾获国家自然科学基金，首都医学科技发展基金，八五、九五、十五、十一五全军科研基金20余项；出版相关专著10余部，发表学术论著100余篇；培养进修生、研究生数百人获国家科技进步二等奖1项，军队科技进步二等奖6项我院皮库简介：科研方面曾获国家自然科学基金，首都医学科技发展7皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长*与新鲜皮片组相比，P<0.未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白1主要分布于颗粒细胞层，－20℃组，4℃组阳性反应明显减弱。0150.移植皮片3-4天转红，1-2周异体皮色泽近似正常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活的自体微粒皮。皮肤β1整合素及相关蛋白冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接浸入液氮4℃储存皮肤FN免疫组化染色×360皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点异种皮以猪皮多见。0190.-196℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360保存时间(d)3-74512个月理论无限期D/K组呈簇状不均匀分布，空隙增大，解聚断裂；目前临床应用较多的是第二种方法两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响（平均积分光密度,X±SD，n=6）目前临床应用较多的是第二种方法第一部分皮肤的低温储存皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长第一部分皮8

皮肤储存的基础知识皮肤的结构皮肤的功能皮肤低温储存的重要意义皮肤低温储存的理论依据皮肤的低温损伤机制皮肤储存的基础知识皮肤的结构9皮肤的结构

皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分组成皮肤附件作为特化的表皮结构也属于皮肤的重要结构，其中包括汗腺、皮脂腺、毛发、指甲皮肤的结构皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分10皮肤的结构

表皮

从上到下又分为角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层

真皮

分为乳头层、网状层。主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。此外皮肤附件，血管、淋巴管、神经末梢皮肤的结构表皮从上到下又分为角质层、透明层、颗粒层11皮肤的主要功能：保护作用感觉作用体温调节作用分泌和排泄作用吸收作用皮肤的主要功能：保护作用12水分电解质皮肤缺失热量蛋白质病原体

贫血低蛋白血症创面脓毒症MODS死亡水分电解质皮肤缺失热量蛋白质病原体贫血低蛋白血症13大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起：

体液的丢失有害介质释放侵袭性感染的滋生地机体超高代谢多器官功能衰竭及并发症大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起：体液的丢失14皮肤储存的必要性：当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%时，自体供皮受限临床实践证明：具有活力的异体皮仍是目前最为理想的创面覆盖物异体皮来源时间受限皮肤储存的必要性：当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%15皮片的来源及种类自体皮

烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受到供皮区的限制异种皮以猪皮多见。取材方便，但移植后排斥时间短，有时难以达到覆盖创面的目的同种异体皮主要来源于成人新鲜尸体，其次为新鲜死婴皮

皮片的来源及种类自体皮烧伤治疗中最为常用的皮片，其16皮肤的低温储存

皮肤的低温储存17低温储存理论依据

理论上，储存温度越低，储存物活力保持的时间越长，细胞组织代谢越低，污染的细菌也不易繁殖低温储存理论依据理论上，储存温度越低，储存物活力保持的18异体皮来源受到极大的限制；通常需要通过异体（种）皮片移植来覆盖创面，而皮源的缺乏往往成为治疗的关键问题之一0150.环而显色2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗涤。方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗涤。皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×3604℃组桥粒出现断裂，结构模与新鲜组皮肤比较，*P<0.-80℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360（平均积分光密度,X±SD，n=10）皮肤低温储存的理论依据右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小（平均积分光密度,X±SD，n=10）新鲜皮肤LN免疫组化染色×360培养进修生、研究生数百人两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响E-cadherin免疫组化染色结果保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力表１

皮肤储存方法比较项目4℃-20℃-80℃-196℃

费用少少较贵贵（补液氮）

保存时间(d)3-74512个月理论无限期最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70异体皮来源受到极大的限制；表１皮肤储存方法比较项目19低温损伤机制：

低温保存关键在于解决低温损伤对生物组织的影响。经典的低温生物学认为在低温条件下，细胞主要受到来自两种因素的损伤即溶质性损伤和胞内冰损伤，即“两因素”学说低温损伤机制：低温保存关键在于解决低温损伤对生物组20“两因素”学说胞内冰晶损伤

胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率较快时引起损伤的主要原因溶质性损伤（高渗性损伤）

细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤，是降温速率较慢时引起损伤的主要原因“两因素”学说胞内冰晶损伤21“两因素”学说“两因素”学说22皮肤结构与储存的关系

皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和真皮构成的复合组织，由于皮肤内的各种主要细胞成分的结构与功能的复杂性，各种细胞代谢与营养条件不同,对环境改变的适应性亦有所不同。因此皮肤的低温损伤是一个更为非常复杂的过程皮肤结构与储存的关系皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和23皮肤低温损伤的其他因素

近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切皮肤低温损伤的其他因素近年来的研究发现，表皮细胞低温24

低温损伤的干预：玻璃化储皮方法的发展抗冻液的使用

低温损伤的干预：25玻璃化的基础知识玻璃化的基础知识26玻璃化的概念

玻璃化是一个物理学的概念，是指当水或溶液在极快降温到或低于-100～-110℃的温度范围时，形成一种具有高黏度的界于液态和固态之间、非晶体态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态玻璃化的概念27玻璃化储存的特点：

玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。这种玻璃态的物理性能与晶体态不同，是一种既可以避免或减轻冷冻过程组织的损伤，又是同时可长期保存组织的良好方法玻璃化储存的特点：玻璃化储存生物组织和细胞28皮肤低温储存的理论依据异体皮来源受到极大的限制；大张异体皮+微粒皮制备方法量基本与新鲜组相似4℃储存皮肤LN免疫组化染色×360最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70皮肤低温储存的理论依据目前较为成熟抗冻液配方玻璃化速冻时冰晶的形态异体皮发黑变干脱落创面愈合新鲜皮肤LN免疫组化染色×360玻璃化对皮肤抗原性影响未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合7天14天-196℃豚鼠皮朗格汉斯细胞数量明显减少、树突变短用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况-196℃储存皮肤E-cadherin免疫组化染色×360新型抗冻剂海藻糖的发现，可进一步优化低温抗冻液配方近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切目前较为成熟抗冻液配方H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇），以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染色×360总结：玻璃化储存皮肤的步骤项目4℃-20℃-80℃-196℃右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。7天21天4℃储存皮肤E-cadherin免疫组化染色×360（平均积分光密度，X±SD，n=10）新鲜皮肤基底膜完整、密度正常，连续性好，半桥粒结构清晰可见，分布均匀；2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，与新鲜组皮肤组织比较，﹡P<0.EC(电子偶联反应体系)结合,将H结合到各温度组皮肤组织α-actinin表达通过488/520nm激发，在荧光显微镜下观察有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程组别组别以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×360皮肤低温储存的理论依据主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。两种方法的比较慢降温速率冰晶形态玻璃化速冻时冰晶的形态皮肤低温储存的理论依据新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染29皮肤的玻璃化储存

皮肤在－196℃的深低温环境中，其组织和细胞内各种酶的活力及代谢很低甚至近乎零，即所谓的“生命悬持状态”。在此温度下保存的皮肤理论上可无限期储存皮肤的玻璃化储存皮肤在－196℃的深低温环境中，30

玻璃化的理想条件

理论上说，体积很小的1微升纯水要用106-107℃/s降温速率才能形成玻璃态

玻璃化的理想条件

理论上说，体积很小的1微升纯水要用31皮肤玻璃化储存的途径

以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。目前只能采用各种方法实现部分玻璃化，抑制冰晶形成和长大，避免细胞严重损伤皮肤玻璃化储存的途径以水为主要成分的生物组织,实现完全玻32皮肤玻璃化储存的途径冷源问题

目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降温速率可达2160℃/min皮肤玻璃化储存的途径冷源问题33皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来冷源温度传导困难和储存不便，因此可设计成皮卷形式皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来34皮肤玻璃化储存的途径降温速率冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接浸入液氮预冷铜板示意图皮肤玻璃化储存的途径降温速率预冷铜板示意图35抗冻剂的应用抗冻剂的应用36抗冻液的作用及机制：

深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否则皮肤将受到严重的损伤抗冻剂的作用机制有以下两点：有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害抗冻液的作用及机制：深低温储存组织离不开抗冻液的保护，37目前较为成熟抗冻液配方

H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇），以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液

一般10000cm2面积的皮肤约需抗冻液3000ml目前较为成熟抗冻液配方H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇）3830分钟6小时内皮片新洁尔灭生理盐水H抗冻液玻璃化储皮及使用步骤临床使用液氮复温40℃15’30’皮卷生理盐水生理盐水30分钟6小时内皮片新洁尔灭生理盐水H抗冻液玻璃化储皮及使用39总结：玻璃化储存皮肤的步骤异体皮的采集消毒皮肤的修整抗冻液的处理包装快速降温液氮容器的管理总结：玻璃化储存皮肤的步骤异体皮的采集40细胞膜的影响降低细胞的流动性细胞骨架受损表皮细胞黏附率降低基底膜的破坏玻璃化对皮肤结构和功能的影响细胞膜的影响降低细胞的流动性玻璃化对皮肤结构和功能的影响41玻璃化对皮肤抗原性影响皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长低温储存后皮片抗原性降低，可能与皮肤内朗格汉斯细胞（LS）数量降低有关保存温度越低，抗原性越弱，移植后存活时间越长玻璃化对皮肤抗原性影响皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新42低温对朗格汉斯细胞的影响新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞数量较多、呈树突状轮廓-196℃豚鼠皮朗格汉斯细胞数量明显减少、树突变短低温对朗格汉斯细胞的影响新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞数量较43新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密集分布。4℃储存皮肤FN免疫组化染色×360E-cadherin免疫组化染色结果-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×360E-cadherin免疫组化染色结果保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。新鲜皮肤桥粒结构清晰、-196℃组中桥粒结构、数新鲜皮肤桥粒结构清晰、量基本与新鲜组相似每年异体尸体皮采集及储存40余具与新鲜组皮肤比较，*P<0.防止创面干燥，减少水分及热量丧失皮肤在－196℃的深低温环境中，其组织和细胞内各种酶的活力及代谢很低甚至近乎零，即所谓的“生命悬持状态”。每年异体尸体皮采集及储存40余具大张异体皮+微粒皮制备方法2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，到供皮区的限制与新鲜组皮肤组织比较，﹡P<0.保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力溶质性损伤（高渗性损伤）异体皮匀浆免疫扩散电泳图右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小

新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密44异体皮匀浆免疫火箭电泳图上图为新鲜皮匀浆电泳结果下图为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果异体皮匀浆免疫火箭电泳图上图为新鲜皮匀浆电泳结果45皮肤活力的鉴定皮肤活力的鉴定46常用的皮肤活力的鉴定方法皮肤氧耗量测定法琥珀酸钠脱氢酶测定法四氮唑盐WST-1法SYTO/EB双重染色法常用的皮肤活力的鉴定方法皮肤氧耗量测定法47皮肤氧耗量测定法

原理：有活力的组织均有代谢耗氧恒温营养液内微电极（铂、银电极）与有活力的皮肤接触，表面氧分压下降，通过放大器测下降程度，推算出皮肤的活力，操作可在1h内完成皮肤氧耗量测定法原理：有活力的组织均有代谢耗氧48我院自行设计的测氧仪外观我院自行设计的测氧仪外观49琥珀酸脱氢酶测定法测定原理琥珀酸钠+红四氮唑延胡索酸+甲琥珀酸脱氢酶H+月替琥珀酸脱氢酶测定法测定原理琥珀酸脱氢酶H+月替50琥珀酸脱氢酶测定法示意图

皮片氮气琥珀酸钠+红四氮唑37℃水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力单位）琥珀酸脱氢酶测定法示意图琥珀酸钠+红四氮唑37℃水浴1h乙51四氮唑盐WST-1法

原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮唑反应体系(RS),作用在亚细胞呼吸链反应中的还原型辅酶Ⅰ

(NADH)、NAD+(辅酶Ⅰ)脱氢反应与细胞组织中的呼吸链EC(电子偶联反应体系)结合,将H结合到WST-1的甲氮唑苯环上,打开其四氮唑苯环而显色四氮唑盐WST-1法原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀52四氮唑盐WST-1法琥珀酸四氮唑反应体系(RS)琥珀酸脱氢酶H+呼吸链WST-1显色反应四氮唑盐WST-1法琥珀酸四氮唑琥珀酸脱氢酶H+呼吸链WST53SYTO/EB双重染色法

为一种敏感、快速的皮肤活力检测法,采用新型穿透性核酸染色剂SYTO和EB方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30’

后PBS洗涤。通过488/520nm激发，在荧光显微镜下观察SYTO/EB双重染色法

为一种敏感、快速的皮肤活力检测法,54玻璃化对皮肤活力的影响

通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力较慢冻法提高了将近20%玻璃化对皮肤活力的影响通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活55速冻玻璃化储皮的优点及效果：该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70%，较以往的慢速冷冻法提高活力近20%采用该法保存的皮肤临床具有质地柔软、植皮后转红快、成活率高（95%左右）、存活期长等优点速冻玻璃化储皮的优点及效果：该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻56第二部分

临床实际应用第二部分

临床实际应用57冷冻异体皮的适用范围开放性创面、深度烧伤创面和切痂创面的暂时性覆盖用于邮票、网状或自体微粒皮的覆盖移植，保证下方自体微粒皮成活用于自体皮源紧张的烧伤后期整形重建手术，作为自体微粒皮的支架用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况冷冻异体皮的适用范围58异体皮覆盖创面的意义防止创面干燥，减少水分及热量丧失防止电解质、蛋白质及血细胞丢失减少创面污染，减轻患者疼痛有利于关节部位早日活动保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力低温储存后抗原性降低，创面覆盖时间延长异体皮覆盖创面的意义防止创面干燥，减少水分及热量丧失59应用方法大张异体皮嵌植小块自体皮大张异体皮自体微粒皮移植目前临床应用较多的是第二种方法应用方法大张异体皮嵌植小块自体皮60大张异体皮+微粒皮制备方法

第一步复温大张异体皮+微粒皮制备方法61大张异体皮+微粒皮制备方法第二步微粒皮的制备大张异体皮+微粒皮制备方法第二步62大张异体皮+微粒皮制备方法第三步漂皮大张异体皮+微粒皮制备方法63创面处理前

创面处理前64切削痂后创面切削痂后创面65以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。自体皮烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受胞外区与基质蛋白相连，胞内区与细胞骨架相连，介导细胞内外双向信息传递0150.海藻糖对低温保存皮肤后β-肌动蛋白的实验研究新鲜皮肤β-catenin免疫组化染色×360海藻糖对低温保存皮肤β1整合素的实验研究皮肤低温储存的重要意义缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害随着皮肤低温储存研究的不断发展，从而更为有效的提高异体皮活力，同时通过对皮肤替代物研究的加强，相信大面积烧伤患者皮源匮乏的问题将得到进一步解决大张异体皮+微粒皮制备方法异体皮来源受到极大的限制；该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70%，较以往的慢速冷冻法提高活力近20%-196℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360β1整合素位于皮肤基底细胞表面，维系表皮、真皮之间的连接，对维持细胞膜完整性及功能起着重要的作用（平均积分光密度,X±SD，n=10）抗冻剂的作用机制有以下两点：1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害-80℃储存E-cadherin免疫组化染色×36001，T/D、D/P组间比较，△P<0.大张异体皮覆盖创面

以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。66微粒皮植皮注意事项植皮面积与微粒皮比例自体微粒皮与异体皮的比例为1:10～1:15较好.自体皮源极度缺乏时甚至可达1:20微粒皮正反面问题微粒皮均匀分散微粒皮植皮注意事项植皮面积与微粒皮比例67临床变化异体皮发黑变干脱落创面愈合

移植皮片3-4天转红，1-2周异体皮色泽近似正常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活的自体微粒皮。4-6周异体皮坏死成干痂，但仍附着牢固，此时微粒皮融合成片，以后异体皮完全变干脱落，创面修复完成。未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合临床变化异体皮发黑变干脱落创面愈合68临床病例Ⅲ°创面临床病例Ⅲ°创面69临床病例术中削痂后覆盖异体皮临床病例术中削痂后覆盖异体皮70临床病例术后4w异体皮排斥术后45d创面基本愈合临床病例术后4w异体皮排斥术后45d创面基本愈合71皮肤低温储存的基础研究进展皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点新型抗冻剂海藻糖的发现，可进一步优化低温抗冻液配方皮肤低温储存的基础研究进展皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白72细胞微环境略图细胞微环境略图73黏附连接缝隙连接紧密连接桥粒各种细胞连接示意图黏附连接缝隙连接紧密连接桥粒各种细胞连接示意图74海藻糖分子结构示意图海藻糖分子结构示意图75FN免疫组化染色结果

FN免疫组化染色结果76新鲜皮肤FN免疫组化染色×360-196℃储存皮肤FN免疫组化染色×360-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×3604℃储存皮肤FN免疫组化染色×360新鲜皮肤FN免疫组化染色×360-196℃储存皮肤FN免疫77LN免疫组化染色结果

LN免疫组化染色结果78新鲜皮肤LN免疫组化染色×360-196℃储存皮肤LN免疫组化染色×3604℃储存皮肤LN免疫组化染色×360-80℃储存皮肤LN免疫组化染色×360新鲜皮肤LN免疫组化染色×360-196℃储存皮肤LN免79表2低温储存对皮肤表皮FN和LN含量的影响（平均积分光密度，X±SD，n=10）标本组别FNLN新鲜皮肤144.1±43.6156.5±40.7-196℃组121.3±38.4127.8±37.3-80℃组68.9±17.9*85.9±16.4*

-20℃组31.4±8.7*54.8±9.3*

4℃组22.8±4.6*22.4±7.6**与新鲜皮片组相比，P<0.01表2低温储存对皮肤表皮FN和LN含量的影响标本组别FNLN80E-cadherin免疫组化染色结果

E-cadherin免疫组化染色结果81新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染色×3604℃储存皮肤E-cadherin免疫组化染色×360-80℃储存E-cadherin免疫组化染色×360-196℃储存皮肤E-cadherin免疫组化染色×360新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染色×3604℃储存82β-catenin免疫组化染色结果β-catenin免疫组化染色结果83新鲜皮肤β-catenin免疫组化染色×360-196℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360

-80℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×3604℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360新鲜皮肤β-catenin免疫组化染色×360-196℃84表3低温储存对皮肤表皮E-cadherin和β-catenin含量的影响

（平均积分光密度,X±SD，n=10）*

与新鲜皮片组相比，P<0.01标本组别E-cadherinβ-catenin新鲜皮肤76.6±18.5100.2±23.9-196℃组61.8±23.487.8±17.3-80℃组23.9±11.4*65.9±18.4*-20℃组24.4±8.7*34.8±9.3*4℃组18.8±5.6*22.4±7.6*表3低温储存对皮肤表皮E-cadherin和β-caten85新鲜皮肤表皮层细胞结构清晰，排列正常，胞核圆形或椭圆形，－196℃皮肤结构基本正常，有少量胞质水肿，淡染，胞核缩小。(HE×400)

低温冷冻对皮肤组织β-肌动蛋白表达的影响新鲜组－196℃组新鲜皮肤表皮层细胞结构清晰，排列正常，胞核圆形或椭圆形86新鲜皮肤组织β-actin主要分布于细胞质，颜色均匀分布,阳性反应强，－196℃组阳性反应减弱，但结构清晰，胞质染色基本呈红色。(SP×200)

新鲜组－196℃组低温冷冻对皮肤组织β-肌动蛋白表达的影响新鲜皮肤组织β-actin主要分布于细胞质，颜色均匀分87透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织微丝的影响

新鲜组较粗,束状广泛均匀分布。-80℃组大片束状结构解聚，空隙增大，见断裂和分叉；4℃组分布不均，细丝样物质明显减少，结构松散，粗细不等。-196℃组分布较广泛，呈束状(×20K，电镜）

新鲜组

-80℃

4℃

-196℃透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织微丝的影响新鲜组较粗,88新鲜皮肤颜色均匀，阳性反应强，T/D组近似，但有少量细胞质水肿，胞核缩小。D/P组呈淡黄色，DMEM组呈阴性反应。（SP×200，光镜）

T/DD/PDMEM新鲜组海藻糖对低温保存皮肤后β-肌动蛋白的实验研究新鲜皮肤颜色均匀，阳性反应强，T/D组近似，但有少量89透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤后微丝的影响

新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密集分布。D/K组呈簇状不均匀分布，空隙增大，解聚断裂；DMEM组大部分已解聚断裂，无明显束状结构。

（×25K，电镜）

新鲜T/DD/KDMEM透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤后微丝的影响新鲜组90皮肤β1整合素及相关蛋白免疫组化染色结果

皮肤β1整合素及相关蛋白91基质蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白关系模型laminin基质蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白关系模型laminin92整合素是一类位于细胞表面黏附分子，属跨膜糖蛋白胞外区与基质蛋白相连，胞内区与细胞骨架相连，介导细胞内外双向信息传递β1整合素位于皮肤基底细胞表面，维系表皮、真皮之间的连接，对维持细胞膜完整性及功能起着重要的作用整合素（Integrin）示意图整合素是一类位于细胞表面黏附分子，属跨膜糖蛋白整合素（Int93新鲜组－196℃组-20℃组4℃组低温冷冻对皮肤组织β1整合素表达的影响新鲜正常皮肤组织β1integrin分布基底细胞细胞膜或胞浆新鲜组－196℃组-20℃组4℃组低温冷冻对皮肤组织β1整合94低温冷冻对皮肤层粘连蛋白laminin表达的影响新鲜正常皮肤组织laminin表达在真皮和表皮连接处新鲜组－196℃组－20℃组4℃组低温冷冻对皮肤层粘连蛋白laminin表达的影响新鲜正常皮肤95低温冷冻对皮肤层踝蛋白talin表达的影响新鲜正常皮肤组织talin分布于基底细胞新鲜组－196℃组－20℃组4℃组低温冷冻对皮肤层踝蛋白talin表达的影响新鲜正常皮肤组织t96低温冷冻对皮肤α-辅肌动蛋白表达的影响各温度组皮肤组织α-actinin表达新鲜组－196℃组4℃组－80℃组低温冷冻对皮肤α-辅肌动蛋白表达的影响各温度组皮肤组织α-a97低温储存对皮肤表皮β1integrin、

laminin、talin含量的影响

（平均积分光密度,X±SD，n=10）与新鲜组皮肤组织比较，﹡P<0.05,**P<0.01标本组别β1integrinlaminin

talin新鲜皮肤0.256±0.016

0.265±0.016

0.216±0.012

-196℃组0.245±0.0210.247±0.025

0.194±0.013*

-80℃组0.232±0.012﹡0.238±0.020﹡

0.179±0.009**

-20℃组0.165±0.015**

0.176±0.013**

0.163±0.010**4℃组0.135±0.011**

0.147±0.015**

0.152±0.017**

低温储存对皮肤表皮β1integrin、laminin、98低温储存对皮肤组织基底膜影响新鲜组－196℃组4℃组新鲜皮肤基底膜完整、密度正常，连续性好，半桥粒结构清晰可见，分布均匀；-196℃组中基底膜结构基本与新鲜组相似；4℃组基底膜变薄，出现断裂，结构模糊不清，半桥粒明显减少低温储存对皮肤组织基底膜影响新鲜组－196℃组4℃组新鲜皮肤99海藻糖对低温保存皮肤β1整合素的实验研究T/D-7d组D/P-7d组T/D-14d组D/P-14d组14天时两组染色程度均降低，D/P组染色强度降低较明显海藻糖对低温保存皮肤β1整合素的实验研究T/D-7d组D/P100两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响

（平均积分光密度,X±SD，n=6）与新鲜组皮肤比较，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P组间比较，△P<0.05,△△P<0.01组别

7天14天新鲜组T/D组D/P组0.296±0.019

0.296±0.0190.287±0.0150.279±0.0100.284±0.0140.249±0.018**两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响与101桥粒透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤基底膜的影响T/D-7d组D/P-7d组T/D-14d组D/P-14d组2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，桥粒透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤基底膜的影响T/D-7102桥粒芯糖蛋白1、2免疫组化染色结果桥粒芯糖蛋白1、2103锚着在桥粒斑上的细胞骨架细丝胞质桥粒斑蛋白细胞间空隙桥粒芯蛋白相邻细胞膜桥粒结构示意图锚着在桥粒斑上的细胞骨架细丝胞质桥粒斑蛋白细胞间空隙桥粒芯蛋104新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白1主要分布于颗粒细胞层，－20℃组，4℃组阳性反应明显减弱。(SP×400)

低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白1表达的影响-20℃新鲜组-196℃4℃新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白1主要分布于颗粒细胞层，－20105新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白2主要分布于基底细胞层，－20℃组，4℃组阳性反应明显减弱。(SP×400)

低温冷冻对皮肤组织桥粒芯糖蛋白2表达的影响新鲜组-196℃4℃-20℃新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白2主要分布于基底细胞层，－20106表3低温储存对皮肤表皮Dsg1和Dsg2含量的影响

（平均积分光密度,X±SD，n=10）*

与新鲜皮片组相比，P<0.05标本组别Dsg1Dsg2新鲜皮肤0.287±0.0080.254±0.007-196℃组0.283±0.0050.247±0.006-80℃组0.272±0.007*0.239±0.007*-20℃组0.235±0.018*0.164±0.008*4℃组0.203±0.012*0.115±0.021*表3低温储存对皮肤表皮Dsg1和Dsg2含量的影响*与新107新鲜皮肤桥粒结构清晰、完整、数量较多-196℃组中桥粒结构、数量基本与新鲜组相似

4℃组桥粒出现断裂，结构模糊不清，数量明显减少新鲜组-196℃4℃桥粒桥粒桥粒透射电镜下观察低温冷冻对皮肤组织桥粒的影响新鲜皮肤桥粒结构清晰、新鲜组-196℃4℃桥粒桥粒桥108海藻糖对低温保存皮肤桥粒芯糖蛋白1的实验研究D/P-21d组T/D-21d组T/D-7d组D/P-7d组海藻糖对低温保存皮肤桥粒芯糖蛋白1的实验研究D/P-21d109表3两种低温保护剂对皮肤组织Dsg1表达变化影响

（平均积分光密度,X±SD，n=6）与新鲜组皮肤比较，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P组间比较，△P<0.05,△△P<0.01组别

7天21天新鲜组T/D组D/P组0.287±0.008

0.287±0.008

0.285±0.0060.284±0.0040.282±0.0040.275±0.005**△表3两种低温保护剂对皮肤组织Dsg1表达变化影响与新鲜组皮110T/D-7d组D/P-7d组桥粒桥粒透射电镜下观察CPA对低温保存皮肤桥粒的影响桥粒D/P-21d组T/D-21d组桥粒T/D-7d组D/P-7d组桥粒桥粒透射电镜下观察CPA对111皮肤替代物的研究表皮替代物表皮细胞膜片的培养真皮替代物脱细胞异体真皮、人工聚合材料复合皮自体表皮+真皮替代物皮肤替代物的研究112结语

深低温皮肤储存的技术为临床救治大面积烧伤病人创面覆盖工作的顺利开展提供了有力的支持。但目前仍有一些不可忽视的问题存在，如降温速率并不十分满意，抗冻剂的进一步筛选；异体皮传播肝炎病毒、HIV的可能性；异体皮来源受到极大的限制；排斥问题的存在，排异组织溶痂及加重病情等结语深低温皮肤储存的技术为临床救治113结语

随着皮肤低温储存研究的不断发展，从而更为有效的提高异体皮活力，同时通过对皮肤替代物研究的加强，相信大面积烧伤患者皮源匮乏的问题将得到进一步解决结语随着皮肤低温储存研究的不断发114谢谢！谢谢！115皮肤玻璃化储存的途径冷源问题

目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降温速率可达2160℃/min皮肤玻璃化储存的途径冷源问题116皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来冷源温度传导困难和储存不便，因此可设计成皮卷形式皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来117抗冻液的作用及机制：

深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否则皮肤将受到严重的损伤抗冻剂的作用机制有以下两点：有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害抗冻液的作用及机制：深低温储存组织离不开抗冻液的保护，118大张异体皮覆盖创面

大张异体皮覆盖创面119临床病例Ⅲ°创面临床病例Ⅲ°创面120基质蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白关系模型laminin基质蛋白-整合素-踝蛋白-骨架蛋白关系模型laminin121低温储存对皮肤表皮β1integrin、

laminin、talin含量的影响

（平均积分光密度,X±SD，n=10）与新鲜组皮肤组织比较，﹡P<0.05,**P<0.01标本组别β1integrinlaminin

talin新鲜皮肤0.256±0.016

0.265±0.016

0.216±0.012

-196℃组0.245±0.0210.247±0.025

0.194±0.013*

-80℃组0.232±0.012﹡0.238±0.020﹡

0.179±0.009**

-20℃组0.165±0.015**

0.176±0.013**

0.163±0.010**4℃组0.135±0.011**

0.147±0.015**

0.152±0.017**

低温储存对皮肤表皮β1integrin、laminin、122两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响

（平均积分光密度,X±SD，n=6）与新鲜组皮肤比较，*P<0.05,**P<0.01，T/D、D/P组间比较，△P<0.05,△△P<0.01组别

7天14天新鲜组T/D组D/P组0.296±0.019

0.296±0.0190.287±0.0150.279±0.0100.284±0.0140.249±0.018**两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响与123皮肤储存新技术及临床应用课件124皮肤储存新技术及临床应用课件125前言

据统计，目前世界每年大约有100万人因各种原因而烧（烫）伤。尤其大面积深度烧伤病人，治疗是一个漫长而复杂的过程。通常需要通过异体（种）皮片移植来覆盖创面，而皮源的缺乏往往成为治疗的关键问题之一前言据统计，目前世界每年大约有100126皮库的意义

54年前英国人Pickerill写下了这样一段话：“毫无争议，创伤整复手术成功的关键之一是有可供给的皮源覆盖因创伤带来的大面积皮肤缺损。实际上在某种情况下，对皮源需要超越一切。因此这启示我们应该注重皮肤的储存与临床应用。”皮库的意义54年前英国人Pickerill写下了127我院皮库简介：自1973年创建皮库以来，分别运用了4℃、-20℃和-80℃低温冰箱皮肤保存法以及液氮储皮方法1987年开始速冻玻璃化储皮方法储存的实验研究和临床应用

我院皮库简介：自1973年创建皮库以来，分别运用了4℃、-2128我院皮库简介：每年异体尸体皮采集及储存40余具深低温速冻异体皮保存方法的改进使保存皮片活力稳定保持在70%以上，皮片移植成活率达95%以上成为亚洲最大的皮库之一，已储存了3000余具活力良好的尸体皮，供全国30个省市300多家医院使用每年创利润数百万元，经济效益显著我院皮库简介：每年异体尸体皮采集及储存40余具129我院皮库简介：科研方面曾获国家自然科学基金，首都医学科技发展基金，八五、九五、十五、十一五全军科研基金20余项；出版相关专著10余部，发表学术论著100余篇；培养进修生、研究生数百人获国家科技进步二等奖1项，军队科技进步二等奖6项我院皮库简介：科研方面曾获国家自然科学基金，首都医学科技发展130皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长*与新鲜皮片组相比，P<0.未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮新鲜皮肤组织桥粒芯糖蛋白1主要分布于颗粒细胞层，－20℃组，4℃组阳性反应明显减弱。0150.移植皮片3-4天转红，1-2周异体皮色泽近似正常皮肤，此后呈斑点状或斑片状发黑区即为成活的自体微粒皮。皮肤β1整合素及相关蛋白冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接浸入液氮4℃储存皮肤FN免疫组化染色×360皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点异种皮以猪皮多见。0190.-196℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360保存时间(d)3-74512个月理论无限期D/K组呈簇状不均匀分布，空隙增大，解聚断裂；目前临床应用较多的是第二种方法两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响（平均积分光密度,X±SD，n=6）目前临床应用较多的是第二种方法第一部分皮肤的低温储存皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长第一部分皮131

皮肤储存的基础知识皮肤的结构皮肤的功能皮肤低温储存的重要意义皮肤低温储存的理论依据皮肤的低温损伤机制皮肤储存的基础知识皮肤的结构132皮肤的结构

皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分组成皮肤附件作为特化的表皮结构也属于皮肤的重要结构，其中包括汗腺、皮脂腺、毛发、指甲皮肤的结构皮肤从外到内，由表皮、真皮和皮下组织三部分133皮肤的结构

表皮

从上到下又分为角质层、透明层、颗粒层、棘层、基底层

真皮

分为乳头层、网状层。主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。此外皮肤附件，血管、淋巴管、神经末梢皮肤的结构表皮从上到下又分为角质层、透明层、颗粒层134皮肤的主要功能：保护作用感觉作用体温调节作用分泌和排泄作用吸收作用皮肤的主要功能：保护作用135水分电解质皮肤缺失热量蛋白质病原体

贫血低蛋白血症创面脓毒症MODS死亡水分电解质皮肤缺失热量蛋白质病原体贫血低蛋白血症136大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起：

体液的丢失有害介质释放侵袭性感染的滋生地机体超高代谢多器官功能衰竭及并发症大面积烧伤病人创面焦痂的存在引起：体液的丢失137皮肤储存的必要性：当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%时，自体供皮受限临床实践证明：具有活力的异体皮仍是目前最为理想的创面覆盖物异体皮来源时间受限皮肤储存的必要性：当大面积烧伤或皮肤缺损超过体表面积的30%138皮片的来源及种类自体皮

烧伤治疗中最为常用的皮片，其来源受到供皮区的限制异种皮以猪皮多见。取材方便，但移植后排斥时间短，有时难以达到覆盖创面的目的同种异体皮主要来源于成人新鲜尸体，其次为新鲜死婴皮

皮片的来源及种类自体皮烧伤治疗中最为常用的皮片，其139皮肤的低温储存

皮肤的低温储存140低温储存理论依据

理论上，储存温度越低，储存物活力保持的时间越长，细胞组织代谢越低，污染的细菌也不易繁殖低温储存理论依据理论上，储存温度越低，储存物活力保持的141异体皮来源受到极大的限制；通常需要通过异体（种）皮片移植来覆盖创面，而皮源的缺乏往往成为治疗的关键问题之一0150.环而显色2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗涤。方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30’后PBS洗涤。皮肤细胞外基质（纤维连接蛋白、层粘连蛋白等）、骨架蛋白（微丝、微管、中间丝）以及细胞间连接桥粒结构可能是低温损伤的关键位点-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×3604℃组桥粒出现断裂，结构模与新鲜组皮肤比较，*P<0.-80℃储存皮肤β-catenin免疫组化染色×360（平均积分光密度,X±SD，n=10）皮肤低温储存的理论依据右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小（平均积分光密度,X±SD，n=10）新鲜皮肤LN免疫组化染色×360培养进修生、研究生数百人两种低温保护剂对皮肤组织β1integrin表达变化影响E-cadherin免疫组化染色结果保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力表１

皮肤储存方法比较项目4℃-20℃-80℃-196℃

费用少少较贵贵（补液氮）

保存时间(d)3-74512个月理论无限期最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70异体皮来源受到极大的限制；表１皮肤储存方法比较项目142低温损伤机制：

低温保存关键在于解决低温损伤对生物组织的影响。经典的低温生物学认为在低温条件下，细胞主要受到来自两种因素的损伤即溶质性损伤和胞内冰损伤，即“两因素”学说低温损伤机制：低温保存关键在于解决低温损伤对生物组143“两因素”学说胞内冰晶损伤

胞内生成冰晶，长大到一定程度，引起细胞壁及细胞内超微结构的变化，甚至导致细胞死亡，是降温速率较快时引起损伤的主要原因溶质性损伤（高渗性损伤）

细胞外水分结冰，导致细胞内外溶液浓度的升高并持续较长的时间。由高渗引起细胞的损伤，是降温速率较慢时引起损伤的主要原因“两因素”学说胞内冰晶损伤144“两因素”学说“两因素”学说145皮肤结构与储存的关系

皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和真皮构成的复合组织，由于皮肤内的各种主要细胞成分的结构与功能的复杂性，各种细胞代谢与营养条件不同,对环境改变的适应性亦有所不同。因此皮肤的低温损伤是一个更为非常复杂的过程皮肤结构与储存的关系皮肤不是单细胞成分，而是由表皮和146皮肤低温损伤的其他因素

近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切皮肤低温损伤的其他因素近年来的研究发现，表皮细胞低温147

低温损伤的干预：玻璃化储皮方法的发展抗冻液的使用

低温损伤的干预：148玻璃化的基础知识玻璃化的基础知识149玻璃化的概念

玻璃化是一个物理学的概念，是指当水或溶液在极快降温到或低于-100～-110℃的温度范围时，形成一种具有高黏度的界于液态和固态之间、非晶体态的、杂乱无章的、透明的玻璃状态玻璃化的概念150玻璃化储存的特点：

玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。这种玻璃态的物理性能与晶体态不同，是一种既可以避免或减轻冷冻过程组织的损伤，又是同时可长期保存组织的良好方法玻璃化储存的特点：玻璃化储存生物组织和细胞151皮肤低温储存的理论依据异体皮来源受到极大的限制；大张异体皮+微粒皮制备方法量基本与新鲜组相似4℃储存皮肤LN免疫组化染色×360最佳活力(%)30-8050-6050-60＞70皮肤低温储存的理论依据目前较为成熟抗冻液配方玻璃化速冻时冰晶的形态异体皮发黑变干脱落创面愈合新鲜皮肤LN免疫组化染色×360玻璃化对皮肤抗原性影响未见异体皮发黑，变干，脱落而创面愈合7天14天-196℃豚鼠皮朗格汉斯细胞数量明显减少、树突变短用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况-196℃储存皮肤E-cadherin免疫组化染色×360新型抗冻剂海藻糖的发现，可进一步优化低温抗冻液配方近年来的研究发现，表皮细胞低温损伤还与细胞骨架、细胞连接桥粒以及细胞间黏附的关系密切目前较为成熟抗冻液配方H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇），以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染色×360总结：玻璃化储存皮肤的步骤项目4℃-20℃-80℃-196℃右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小玻璃化储存生物组织和细胞，由于降温速率很快，水分没有足够的时间来形成冰晶，即进入均匀的玻璃状态。7天21天4℃储存皮肤E-cadherin免疫组化染色×360（平均积分光密度，X±SD，n=10）新鲜皮肤基底膜完整、密度正常，连续性好，半桥粒结构清晰可见，分布均匀；2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，与新鲜组皮肤组织比较，﹡P<0.EC(电子偶联反应体系)结合,将H结合到各温度组皮肤组织α-actinin表达通过488/520nm激发，在荧光显微镜下观察有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程组别组别以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×360皮肤低温储存的理论依据主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。两种方法的比较慢降温速率冰晶形态玻璃化速冻时冰晶的形态皮肤低温储存的理论依据新鲜皮肤E-cadherin免疫组化染152皮肤的玻璃化储存

皮肤在－196℃的深低温环境中，其组织和细胞内各种酶的活力及代谢很低甚至近乎零，即所谓的“生命悬持状态”。在此温度下保存的皮肤理论上可无限期储存皮肤的玻璃化储存皮肤在－196℃的深低温环境中，153

玻璃化的理想条件

理论上说，体积很小的1微升纯水要用106-107℃/s降温速率才能形成玻璃态

玻璃化的理想条件

理论上说，体积很小的1微升纯水要用154皮肤玻璃化储存的途径

以水为主要成分的生物组织,实现完全玻璃化需要极高的降温速率。目前只能采用各种方法实现部分玻璃化，抑制冰晶形成和长大，避免细胞严重损伤皮肤玻璃化储存的途径以水为主要成分的生物组织,实现完全玻155皮肤玻璃化储存的途径冷源问题

目前国内各家皮库主要采用液氮作为冷源，温度可达-196℃，皮片直接放入液氮后，其最快的降温速率可达2160℃/min皮肤玻璃化储存的途径冷源问题156皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来冷源温度传导困难和储存不便，因此可设计成皮卷形式皮肤玻璃化储存的途径储存的皮肤往往因具有一定的厚度和面积带来157皮肤玻璃化储存的途径降温速率冷却的铜板预冷皮肤后即将其直接浸入液氮预冷铜板示意图皮肤玻璃化储存的途径降温速率预冷铜板示意图158抗冻剂的应用抗冻剂的应用159抗冻液的作用及机制：

深低温储存组织离不开抗冻液的保护，否则皮肤将受到严重的损伤抗冻剂的作用机制有以下两点：有效抑制过冷水的不规则形态及促进快速结晶，促进玻璃化行程缓冲因冰形成而造成的渗透压升高，减轻溶质损害抗冻液的作用及机制：深低温储存组织离不开抗冻液的保护，160目前较为成熟抗冻液配方

H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇），以此作为玻璃化储存皮肤的抗冻液

一般10000cm2面积的皮肤约需抗冻液3000ml目前较为成熟抗冻液配方H液（20%二甲基亚砜、6%丙二醇）16130分钟6小时内皮片新洁尔灭生理盐水H抗冻液玻璃化储皮及使用步骤临床使用液氮复温40℃15’30’皮卷生理盐水生理盐水30分钟6小时内皮片新洁尔灭生理盐水H抗冻液玻璃化储皮及使用162总结：玻璃化储存皮肤的步骤异体皮的采集消毒皮肤的修整抗冻液的处理包装快速降温液氮容器的管理总结：玻璃化储存皮肤的步骤异体皮的采集163细胞膜的影响降低细胞的流动性细胞骨架受损表皮细胞黏附率降低基底膜的破坏玻璃化对皮肤结构和功能的影响细胞膜的影响降低细胞的流动性玻璃化对皮肤结构和功能的影响164玻璃化对皮肤抗原性影响皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新鲜异体皮长低温储存后皮片抗原性降低，可能与皮肤内朗格汉斯细胞（LS）数量降低有关保存温度越低，抗原性越弱，移植后存活时间越长玻璃化对皮肤抗原性影响皮肤经低温储存后，异体皮的存活时间较新165低温对朗格汉斯细胞的影响新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞数量较多、呈树突状轮廓-196℃豚鼠皮朗格汉斯细胞数量明显减少、树突变短低温对朗格汉斯细胞的影响新鲜豚鼠皮朗格汉斯细胞数量较166新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密集分布。4℃储存皮肤FN免疫组化染色×360E-cadherin免疫组化染色结果-80℃储存皮肤FN免疫组化染色×360E-cadherin免疫组化染色结果保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力主要有结缔组织构成，包括胶原纤维、弹力纤维、网状纤维。新鲜皮肤桥粒结构清晰、-196℃组中桥粒结构、数新鲜皮肤桥粒结构清晰、量基本与新鲜组相似每年异体尸体皮采集及储存40余具与新鲜组皮肤比较，*P<0.防止创面干燥，减少水分及热量丧失皮肤在－196℃的深低温环境中，其组织和细胞内各种酶的活力及代谢很低甚至近乎零，即所谓的“生命悬持状态”。每年异体尸体皮采集及储存40余具大张异体皮+微粒皮制备方法2周时间，D/P组基底膜部分区域结构稍有松散，模糊不清，半桥粒数量有所下降，T/D组基底膜较完整，厚度大致均匀，半桥粒未见明显渐少，到供皮区的限制与新鲜组皮肤组织比较，﹡P<0.保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力溶质性损伤（高渗性损伤）异体皮匀浆免疫扩散电泳图右侧为新鲜皮匀浆与抗体形成的沉淀环;左侧为液氮储存48h后与抗体形成的沉淀环，面积明显缩小

新鲜组束状广泛分布于细胞质中，T/D组少量断裂和分叉，束状密167异体皮匀浆免疫火箭电泳图上图为新鲜皮匀浆电泳结果下图为液氮储存48h后皮片匀浆电泳结果异体皮匀浆免疫火箭电泳图上图为新鲜皮匀浆电泳结果168皮肤活力的鉴定皮肤活力的鉴定169常用的皮肤活力的鉴定方法皮肤氧耗量测定法琥珀酸钠脱氢酶测定法四氮唑盐WST-1法SYTO/EB双重染色法常用的皮肤活力的鉴定方法皮肤氧耗量测定法170皮肤氧耗量测定法

原理：有活力的组织均有代谢耗氧恒温营养液内微电极（铂、银电极）与有活力的皮肤接触，表面氧分压下降，通过放大器测下降程度，推算出皮肤的活力，操作可在1h内完成皮肤氧耗量测定法原理：有活力的组织均有代谢耗氧171我院自行设计的测氧仪外观我院自行设计的测氧仪外观172琥珀酸脱氢酶测定法测定原理琥珀酸钠+红四氮唑延胡索酸+甲琥珀酸脱氢酶H+月替琥珀酸脱氢酶测定法测定原理琥珀酸脱氢酶H+月替173琥珀酸脱氢酶测定法示意图

皮片氮气琥珀酸钠+红四氮唑37℃水浴1h乙二醇乙醚皮片OD490um/mg（活力单位）琥珀酸脱氢酶测定法示意图琥珀酸钠+红四氮唑37℃水浴1h乙174四氮唑盐WST-1法

原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀酸四氮唑反应体系(RS),作用在亚细胞呼吸链反应中的还原型辅酶Ⅰ

(NADH)、NAD+(辅酶Ⅰ)脱氢反应与细胞组织中的呼吸链EC(电子偶联反应体系)结合,将H结合到WST-1的甲氮唑苯环上,打开其四氮唑苯环而显色四氮唑盐WST-1法原理:利用活组织或细胞中的线粒体琥珀175四氮唑盐WST-1法琥珀酸四氮唑反应体系(RS)琥珀酸脱氢酶H+呼吸链WST-1显色反应四氮唑盐WST-1法琥珀酸四氮唑琥珀酸脱氢酶H+呼吸链WST176SYTO/EB双重染色法

为一种敏感、快速的皮肤活力检测法,采用新型穿透性核酸染色剂SYTO和EB方法：皮片经PBS洗涤后加入SYTO50ul,37℃避光孵育30’，PBS洗涤加入50ulEB,水浴避光孵育30’

后PBS洗涤。通过488/520nm激发，在荧光显微镜下观察SYTO/EB双重染色法

为一种敏感、快速的皮肤活力检测法,177玻璃化对皮肤活力的影响

通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活力的测定发现玻璃化储存的皮肤活力较慢冻法提高了将近20%玻璃化对皮肤活力的影响通过对氧耗量及琥珀酸脱氢酶活178速冻玻璃化储皮的优点及效果：该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻皮片的平均活力指标可达到新鲜皮片的70%，较以往的慢速冷冻法提高活力近20%采用该法保存的皮肤临床具有质地柔软、植皮后转红快、成活率高（95%左右）、存活期长等优点速冻玻璃化储皮的优点及效果：该法可以永久保存皮肤，储存后冷冻179第二部分

临床实际应用第二部分

临床实际应用180冷冻异体皮的适用范围开放性创面、深度烧伤创面和切痂创面的暂时性覆盖用于邮票、网状或自体微粒皮的覆盖移植，保证下方自体微粒皮成活用于自体皮源紧张的烧伤后期整形重建手术，作为自体微粒皮的支架用于暂不适合自体皮的创面覆盖以改善创基情况冷冻异体皮的适用范围181异体皮覆盖创面的意义防止创面干燥，减少水分及热量丧失防止电解质、蛋白质及血细胞丢失减少创面污染，减轻患者疼痛有利于关节部位早日活动保护暴露的组织，促进肉芽成熟、创面愈合，具有抗感染能力低温储存后抗原性降低，创面覆盖时间延长异体皮覆盖创面的意义防止创面干燥，减少水分及热量丧失182应用方法大张异体皮嵌植小块自体皮大张异体皮自体微粒皮移植目前临床应用较多的是第二种方法应用方法大张异体皮嵌植小块自体皮183大张异体皮+微粒皮制备方法

第一步复温大张异体皮+微粒皮制备方法184大张异体皮+微粒皮制备方法第二步微粒皮的制备大张异体皮+微粒皮制备方法