间充质干细胞的临床应用心得课件1

间充质干细胞的临床应用心得间充质干细胞的临床应用心得1（优选）间充质干细胞的临床应用心得（优选）间充质干细胞的临床应用心得2间充质干细胞生物学特性来源广泛自我更新、多向分化潜能易扩增传代能力MSCsIL-6,IL-7,IL-10,IL-11,SCF,SDF-1GM-CSF,M-CSF..adipocyteosteocytechondrocytemyoblastcardiocyteNervecellhepatocyte可来源于骨髓、胰腺、皮肤、肺脏等多处器官组织

体外能够传40代，并保持稳定的表型和多向分化的潜能（MesenchymalStemCells，MSCs)间充质干细胞生物学特性MSCsIL-6,IL-7,I3免疫调节作用产生多种细胞因子分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干细胞生长因子（SCF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、转化生长因子-β（TGF-β）等

表达多种细胞表面分子CD105、CD73、CD44、CD71、CD90、CD166、基质细胞抗原（STRO-1

）等无MHC限制不管MSCs或T细胞来源种类，MSCs均能对T细胞增殖产生免疫抑制作用产生多种细胞因子表达多种细胞表面分子无MHC限制4狼疮骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置显微镜观察×100人正常人与SLE患者BMSCs形态大小上无差异，均以长梭形为主孙凌云等，中华风湿病学杂志，2005形态观察狼疮骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第25SLE组正常对照组原代培养时间26±7.76d17±5.46dP=0.029形态学无区别SLE与正常对照组BMSCs培养比较张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006扩增效率P5代后降低P10代后降低

SLE组正常对照组原代培养时间26±7.76d17±56表达CD29、CD44和CD105

不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR

正常组与狼疮组表型表达并无差异（P<0.05)张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006表面标记测定表达CD29、CD44和CD105张华勇，孙凌云，中7dCellpopulation生长曲线呈S形SLE患者BMSCs总体生长较正常人缓慢

张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较dCellpopulation生长曲线呈S形张华勇，孙凌云8对照SLEBeta-actinIL-7SLE中IL-6、IL-7表达降低（P<0.05）而IL-11,M-CSF表达无区别张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常人与SLE患者BMSCs细胞因子表达比较对照SLEBeta-actinIL-7张华勇，孙凌云，中华风9张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006SLE患者BMSCs染色体组型

——为正常的染色体组型张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，200610表达CD29、CD44和CD105Cultureconditions(temperature,motion,etc.MSCs治疗2次32004;363:1439–41MSCs与HSCs共移植的临床研究SLE患者BMSCs总体生长较正常人缓慢（不需细胞间直接接触）狼疮骨髓MSCs（BMSCs）表达CD29、CD44和CD105包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激Breastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Koçetal.伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓该中心1000例接受异基因HSCT患者中，25例发生急性Ⅳ型GVHD，除此例外，另24例均死亡（移植后0.正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓Celllineorexvivo鼠

BALB/cNZBWF1/J

（P0）×100

形态上无显著差异但狼疮MSCs增殖速度更快、传代时间更短不同于人？SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006形态学表达CD29、CD44和CD105BAL11MSCs与免疫细胞MSCs与T细胞不活化异基因T细胞抑制T细胞增殖包括初始和记忆性T细胞的增殖包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激对T细胞凋亡影响一：不诱导静止期T细胞凋亡（TseWTetal.Transplantation，2003，75：389-397.）二：诱导活化的T细胞凋亡（PlumasJetal.Leukemia2005;19:1597-604.）MSCs与免疫细胞MSCs与T细胞12与正常（BALB/c）及狼疮鼠（NZBWF1/J）BMSCs共培养均导致活化的T细胞凋亡下降（P<0.05)三：使活化的T细胞凋亡降低SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006

单独T细胞T＋狼疮BMSCsT＋正常BMSCs与正常（BALB/c）及狼疮鼠（NZBWF1/J）BMSC131.正常鼠BMSCs对狼疮T细胞IFN-γ、IL-4生成的影响IFN-γ生成T细胞被刺激增多IL-4生成T细胞被抑制减少正常BMSCs可促进TH1而抑制TH2细胞生成—影响SLE病情DengW,etal.DNAandCellBiology.2005;24:458-463对T细胞亚群的影响T细胞内细胞因子测定IFN-γ生成T细胞被刺激增多DengW,etal.14

与正常鼠BMSCs(BALB/c)共孵育：↑IFN-γ*,IL-12*IL-4*,IL-10,IL-6，TNF-α*

向TH1偏移与狼疮鼠BMSCs(NZBWF1/J)共孵育：↑IL-6*,IL-4,IL-10

↓

TNF-α*

向TH2偏移#*##*##*2.BMSCs与正常T细胞共孵育前后细胞内细胞因子的变化SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006*为有统计学意义#*##*##*SunLY,etal.ScandJ15

T-betβ-actinA.T＋狼疮MSCs

B.单独TC.T＋正常MSCsGATA-3β-actin

ABCABC与正常鼠BMSCs共培养：T-bet↑，GATA-3↓TH1↑与狼疮鼠BMSCs共培养：T-bet↓，GATA-3↑TH2↑转录因子T-bet和GATA-3

SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006A.T＋狼疮MSCsABC16包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表达↓，IL-12分泌↓向非成熟状态的偏离对同种T细胞的活化能力下降显著抑制单核细胞向DC分化（无需细胞间接触）KushidaT，etal.Cultureconditions(temperature,motion,etc.正常组与狼疮组表型表达并无差异（P<0.MSCs作用的靶T细胞—CD8+亚群－接受高剂量化疗＋自体干细胞移植狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移SCTdonorincidenceofacuteGVHDchondrocyte色氨酸犬尿素5×106MSCs/kg（来自患者父亲）移植物中除去供者T细胞（体外T细胞清除）↑IL-6*,IL-4,IL-10T＋狼疮BMSCsSCTdonorincidenceofacuteGVHDLeBlancC,etal.正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移狼疮鼠病情缓解？狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移狼疮鼠病情恶化？

狼疮鼠BMSCs对T细胞免疫调节功能存在缺陷对TH1/TH2平衡影响包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激正常MSCs：使T17MSCs与B细胞人BMSCs可抑制B细胞增殖增殖抑制与B细胞的凋亡无关，而与细胞周期滞留于G0/G1有关由可溶性细胞因子介导（不需细胞间直接接触）抑制抗体生成(IgA、IgM、

IgG)CorcioneA,etal.Blood.2006;107:367-372MSCs与B细胞CorcioneA,etal.Bloo18MSCs与NK细胞静止期NK不能裂解人MSCs。IL-2活化的自体及异体NK细胞均可裂解BMSCsBMSCs抑制IL-2诱导的静止期NK细胞的增殖，部分抑制已活化NK细胞的增殖经IFN－γ预处理可抑制该裂解作用—上调MSCs的HLA-Ⅰ类分子水平阻止NK细胞的活化SpaggiariGM,etal.Blood.2006;107:1484-1490NK对MSCs的裂解作用.（E/T即NK/MSC）

MSCs与NK细胞SpaggiariGM,etal.B19MSCs与DC细胞人BMSCs与DC共培养对DC分化、成熟、功能影响

显著抑制单核细胞向DC分化（无需细胞间接触）

抑制DC分泌TNF-α的能力引起免疫耐受成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表达↓，IL-12分泌↓向非成熟状态的偏离对同种T细胞的活化能力下降

JiangXXetal.Blood，2005;105:4120-4126

MSCs与DC细胞JiangXXetal.Blood，20MSCs与CTL抑制CTLs的细胞毒作用呈时间和剂量依赖不能抑制已活化CTLs的细胞毒作用通过可溶性因子介导

MSCs不是CTLs作用的靶细胞RasmussonI,etal.Transplantation，2003，76:1208-1213

MSCs与CTLRasmussonI,etal.T21MSCs的免疫调控可能机制MSCs分泌可溶性细胞因子

CD8+调节性T细胞吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）

诱导调节性APCs

MSCs的免疫调控可能机制MSCs分泌可溶性CD8+调节吲哚22机制分泌可溶性细胞因子介导

IL-10、TGF-β1、前列腺素E2（PGE2）、肝细胞生长因子(HGF)、IL-2、IL-2R等不需要细胞间直接接触矛盾观点不同细胞因子介导需要与T细胞直接接触不同的来源、提取、培养、鉴定方法等可能导致收集的MSCs亚群不同（见下表）机制分泌可溶性细胞因子介导不同的来源、提取、培养、鉴定方法23Extractionsites(Prinzetal.,1999)Bonemarrow(livedonors）:hip,sternum,brokenbonesBonemarrow(cadaverdonors):allsites(rare)Othertissue:teeth,fat,muscle,cartilage,synovialfluid,skinDevelopmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDissociationmethodTrypsinationScrapingSuspensioncultureMarkercombinationsCD10+,CD13+,CD34+,CD56+,CD90+,MHC-1+(Youngetal.,1999)VCAM+,STRO-1+,CD73+,CD105+(Tulietal.,2003)Wnt2+,Wnt4+,Wnt5a+,Wnt11+,Wnt16+,Fz2+,Fz3+,Fz4+,Fz5+,Fz6+(Etheridgeetal.,2004)…IdentificationAdherencetoplasticMagneticbeadFACScellsortingOtherfactorsCelllineorexvivoDonorageDonorsexDonordiseasestatusMediumcompositionPointoffirstanalysisCultureconditions(temperature,motion,etc.)DifferentiationagentFrequencyofmediumchange…SetheS,etal.AgeingResearchReviews.2006;5:91-116Extractionsites(Prinzetal.24ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激利用MSCs的免疫抑制作用可治疗急性GVHDMSCs治疗急性GVHD一例间充质干细胞的临床应用心得－治疗后血小板>0.张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率在延长生存率上，PV＋IV>PV>IV2000年，KushidaT等用全身照射＋门静脉内注射（PV）＋尾静脉注射（IV）治疗狼疮（MRL/lpr），1年生存率达100％，高于（照射＋PV）及（照射＋IV）组2006;107:367-3722005;11:321-334SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置显微镜观察×100—全身照射+传统化疗KocON,etal.Donordiseasestatus张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006DifferentiationagentMagneticbeadMSCs的输注可延长狼疮鼠生存期限Developmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDjouadF,etal.Blood.2003;102:3837-3844诱导CD8+调节性Ｔ细胞产生MSCs作用的靶T细胞—CD8+亚群通过诱导CD8+调节性Ｔ细胞发挥免疫抑制作用Condedsplenocytes+MSCMLR鼠BMSCs抑制MLR中CD8+亚群的增殖CD8+亚群抑制淋巴细胞增殖ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生25吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介导BMSCs在IFN-γ的诱导下大量表达IDO

色氨酸犬尿素

抑制T细胞抗原应答色氨酸加入Ｔ细胞的增殖可显著恢复

IDO-介导的色氨酸降解—人BMSCs抑制T细胞增殖MeiselR,etal.Blood.2004;103:4619-4621吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介导MeiselR,eta26诱导调节性APCs产生人BMSCs可能干涉APCs的成熟转变为调节性APCs

BeythS,etal.Blood.2005;105:2214-2219缺乏T细胞活化能力接触依赖性伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓抗炎症细胞因子IL-10表达↑MSCs调节性APCs防止或减轻GVHD？诱导调节性APCs产生BeythS,etal.B27MSCs的临床应用优点无或低免疫原性

无MHC限制诱导宿主免疫耐受降低移植排斥反应MSCs的临床应用优点28体外培养扩增MSCs作为组织工程的种子细胞，修复各种组织、器官作为基因治疗的载体细胞：转基因或基因修饰MSCs植入，替代有缺陷的骨髓利用免疫抑制、降低移植排斥，用于器官或组织移植与HSCs共移植治疗血液、肿瘤、免疫性等临床疾病防治GVHD

主要应用皮肤骨、软骨、肌腱关节脑神经组织心肌等主要应用29

DiseaseNo.SourceofMSCs/SCTOutcomeRef.StudyPatientsSettingHematologic15AutologousIVNoadverseeventsof1,Lazarusetal.malignanciesinfusion10,and50×106cellsBreastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Koçetal.autologousSCTautologousSCTrecoverywasrapidInbornerrorsof11HLA-identicalNoimmuneresponseagainstkocetal.MetabolismfromSCTdonordonor;improvednerveconductiovelocityinmetachromaticleukodystrophyOsteogenesis5HLA-identicalfromGene-markedMSCsengrafted;Horwitzetal.ImperfectaSCTdonornewdenseboneformation;fewfracturesAcutemyeloid1HLA-haploidenticalSCTengraftmentwithnoGVHDLeeetal.LeukemiafromSCTdonorLeukemia31HLA-identicalfromRapidplateletengraftment;lowrassonietal.SCTdonorincidenceofacuteGVHDSevereaplastic1AllogeneicMSCEngraftment;improvedstromaFouillardetal.anemiaSevereacute1HaploidenticalMSC;ClearanceofgradeIVacuteLeBlancetal.GVHDunrelateddonorSCTGVHD,twice

MSCs与HSCs共移植的临床研究LeBlancC,etal.BiologyofBloodandMarrowTransplantation.2005;11:321-334DiseaseNo.301.血液疾病女，20岁，急性白血病

—全身照射+传统化疗—5.7×106CD34+cells/kg+1.5×106MSCs/kg（来自患者父亲）—无急性GVHD或慢性GVHD发生—移植后31月血象正常，无病情复发LeeST,etal.BrJHaematol.2002;118:1128-1131.1.血液疾病LeeST,etal.BrJHaema312.肿瘤28名乳腺癌患者－接受高剂量化疗＋自体干细胞移植－静脉输注1～2×106/kg

MSCs－无输注后毒性反应发生－治疗后血小板>0.5×109/L的平均时间9d(4-19d)

中性粒细胞>0.5×109/L的平均时间8d(6-11d)KocON,etal.ClinOncol,2000;18:307-316MSCs可促进HSCs移植2.肿瘤KocON,etal.ClinOncol,323.GVHD（移植物抗宿主病）为HSCT常见并发症（20％－60％）预防方法传统移植物中除去供者T细胞（体外T细胞清除）T细胞抗体处理(体内T细胞清除）免疫抑制药物使用新策略MSCs输注下调宿主抗原呈递细胞3.GVHD（移植物抗宿主病）为HSCT常见并发症（20％－3331名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植MSCs剂量1－5×106/kg无MSCs输注相关毒性反应急性II～IVGVHD发生率为15%(对照组40%,P=0.01)慢性GVHD发生率为12%（对照组67%,P=0.002)6月存活率88%（对照组67%)ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率FrassoniF,etal.BoneMarrowTransplant2002;29(suppl2)31名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植ASC34MSCs治疗急性GVHD一例男，9岁，急性淋巴细胞白血病HSCT后发生Ⅳ型急性GVHD症状：腹泻，高胆红素血症，反复细菌、真菌、病毒感染常规抗GVHD治疗无效移植后73d予静脉输注2×106/kg

MSCs（来自患者母亲），第170d予1×106/kg

MSCs治疗效果：症状好转至消失，血胆红素正常，急淋缓解该中心1000例接受异基因HSCT患者中，25例发生急性Ⅳ型GVHD，除此例外，另24例均死亡（移植后0.5－5.5月，平均2月）如下图MSCs治疗急性GVHD一例男，9岁，急性淋巴细胞白血病HS35患者移植临床过程LeBlancK，etal.Lancet.2004;363:1439–41结论:

利用MSCs的免疫抑制作用可治疗急性GVHD患者移植临床过程LeBlancK，etal.Lanc36MSCs治疗激素难控制型急性GVHD8例治疗组例数/次数急性GVHD8慢性GVHD1MSCs治疗1次6MSCs治疗2次3移植后急性GVHD消失6移植后死亡3巨细胞病毒胃肠炎1存活（2月－3年）5生存率明显高于同期未接受MSCs输注的GVHD患者（P＝0.03）RingdenO，etal.BiologyBloodMarrowTransplant,2006MSCs治疗激素难控制型急性GVHD8例治疗组37MSCs用于自身免疫病治疗的潜能自身免疫病为干细胞病,临床上已开展骨髓移植治疗自身免疫病MSCs在异基因骨髓移植中可降低GVHD的发生和严重性自身免疫病动物实验显示，全骨髓移植(含MSCs）可延长生存期限,降低疾病复发4.自身免疫病MSCs用于自身免疫病治疗的潜能4.自身免疫病38KushidaT等用照射＋胫骨内注射全骨髓（IBM－BMT）治疗狼疮（MRL/lpr），1年以上生存率达100％

结论MSCs的输注可延长狼疮鼠生存期限输注途径影响动物实验2000年，KushidaT等用全身照射＋门静脉内注射（PV）＋尾静脉注射（IV）治疗狼疮（MRL/lpr），1年生存率达100％，高于（照射＋PV）及（照射＋IV）组SLE在延长生存率上，PV＋IV>PV>IVIBM－BMT可减少照射剂量，并无需追加IVKushidaT等用照射＋胫骨内注射全骨髓（IBM－BMT39IL-11,SCF,SDF-1T＋正常BMSCs中性粒细胞>0.吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介导症状：腹泻，高胆红素血症，反复细菌、真菌、病毒感染↑IL-6*,IL-4,IL-10PointoffirstanalysisIL-6,IL-7,IL-10,女，20岁，急性白血病DiseaseNo.不管MSCs或T细胞来源种类，MSCs均能对T细胞增殖产生免疫抑制作用急性GVHD8Transplantation，2003，76:1208-1213与正常（BALB/c）及狼疮鼠（NZBWF1/J）BMSCs共培养均导致活化的T细胞凋亡下降（P<0.张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率为HSCT常见并发症（20％－60％）↑IL-6*,IL-4,IL-10治疗组例数/次数Condedsplenocytes+MSCMLR2005;24:458-463MediumcompositionDengW,etal.31名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植—全身照射+传统化疗wasrapidCultureconditions(temperature,motion,etc.二：诱导活化的T细胞凋亡（PlumasJetal.—全身照射+传统化疗狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移狼疮鼠病情恶化？MeiselR,etal.正常组与狼疮组表型表达并无差异（P<0.静止期NK不能裂解人MSCs。正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移生存率明显高于同期未接受MSCs输注的GVHD患者SLE患者BMSCs总体生长较正常人缓慢（E/T即NK/MSC）女，20岁，急性白血病2004;363:1439–41IL-11,SCF,SDF-1张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006IBM－BMT可减少照射剂量，并无需追加IV张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，20062003;102:3837-3844BMSCs在IFN-γ的诱导下大量表达IDOformation;fewfractures2006;107:367-372ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率BMSCs抑制IL-2诱导的静止期NK细胞的增殖，部分抑制已活化NK细胞的增殖不能抑制已活化CTLs的细胞毒作用IL-4*,IL-10,2004;363:1439–41Severeaplastic1AllogeneicMSCEngraftment;improvedstromaFouillardetal.MRL/lpr鼠肾小球病理改变KushidaT，etal.Blood.2001;97:3292-3299IL-11,SCF,SDF-1为HSCT常见并发症（2040间充质干细胞的临床应用心得间充质干细胞的临床应用心得41（优选）间充质干细胞的临床应用心得（优选）间充质干细胞的临床应用心得42间充质干细胞生物学特性来源广泛自我更新、多向分化潜能易扩增传代能力MSCsIL-6,IL-7,IL-10,IL-11,SCF,SDF-1GM-CSF,M-CSF..adipocyteosteocytechondrocytemyoblastcardiocyteNervecellhepatocyte可来源于骨髓、胰腺、皮肤、肺脏等多处器官组织

体外能够传40代，并保持稳定的表型和多向分化的潜能（MesenchymalStemCells，MSCs)间充质干细胞生物学特性MSCsIL-6,IL-7,I43免疫调节作用产生多种细胞因子分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、干细胞生长因子（SCF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、转化生长因子-β（TGF-β）等

表达多种细胞表面分子CD105、CD73、CD44、CD71、CD90、CD166、基质细胞抗原（STRO-1

）等无MHC限制不管MSCs或T细胞来源种类，MSCs均能对T细胞增殖产生免疫抑制作用产生多种细胞因子表达多种细胞表面分子无MHC限制44狼疮骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置显微镜观察×100人正常人与SLE患者BMSCs形态大小上无差异，均以长梭形为主孙凌云等，中华风湿病学杂志，2005形态观察狼疮骨髓MSCs（BMSCs）SLE骨髓（P0）MSCs第245SLE组正常对照组原代培养时间26±7.76d17±5.46dP=0.029形态学无区别SLE与正常对照组BMSCs培养比较张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006扩增效率P5代后降低P10代后降低

SLE组正常对照组原代培养时间26±7.76d17±546表达CD29、CD44和CD105

不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR

正常组与狼疮组表型表达并无差异（P<0.05)张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006表面标记测定表达CD29、CD44和CD105张华勇，孙凌云，中47dCellpopulation生长曲线呈S形SLE患者BMSCs总体生长较正常人缓慢

张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较dCellpopulation生长曲线呈S形张华勇，孙凌云48对照SLEBeta-actinIL-7SLE中IL-6、IL-7表达降低（P<0.05）而IL-11,M-CSF表达无区别张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006正常人与SLE患者BMSCs细胞因子表达比较对照SLEBeta-actinIL-7张华勇，孙凌云，中华风49张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006SLE患者BMSCs染色体组型

——为正常的染色体组型张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，200650表达CD29、CD44和CD105Cultureconditions(temperature,motion,etc.MSCs治疗2次32004;363:1439–41MSCs与HSCs共移植的临床研究SLE患者BMSCs总体生长较正常人缓慢（不需细胞间直接接触）狼疮骨髓MSCs（BMSCs）表达CD29、CD44和CD105包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激Breastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Koçetal.伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓该中心1000例接受异基因HSCT患者中，25例发生急性Ⅳ型GVHD，除此例外，另24例均死亡（移植后0.正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓Celllineorexvivo鼠

BALB/cNZBWF1/J

（P0）×100

形态上无显著差异但狼疮MSCs增殖速度更快、传代时间更短不同于人？SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006形态学表达CD29、CD44和CD105BAL51MSCs与免疫细胞MSCs与T细胞不活化异基因T细胞抑制T细胞增殖包括初始和记忆性T细胞的增殖包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激对T细胞凋亡影响一：不诱导静止期T细胞凋亡（TseWTetal.Transplantation，2003，75：389-397.）二：诱导活化的T细胞凋亡（PlumasJetal.Leukemia2005;19:1597-604.）MSCs与免疫细胞MSCs与T细胞52与正常（BALB/c）及狼疮鼠（NZBWF1/J）BMSCs共培养均导致活化的T细胞凋亡下降（P<0.05)三：使活化的T细胞凋亡降低SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006

单独T细胞T＋狼疮BMSCsT＋正常BMSCs与正常（BALB/c）及狼疮鼠（NZBWF1/J）BMSC531.正常鼠BMSCs对狼疮T细胞IFN-γ、IL-4生成的影响IFN-γ生成T细胞被刺激增多IL-4生成T细胞被抑制减少正常BMSCs可促进TH1而抑制TH2细胞生成—影响SLE病情DengW,etal.DNAandCellBiology.2005;24:458-463对T细胞亚群的影响T细胞内细胞因子测定IFN-γ生成T细胞被刺激增多DengW,etal.54

与正常鼠BMSCs(BALB/c)共孵育：↑IFN-γ*,IL-12*IL-4*,IL-10,IL-6，TNF-α*

向TH1偏移与狼疮鼠BMSCs(NZBWF1/J)共孵育：↑IL-6*,IL-4,IL-10

↓

TNF-α*

向TH2偏移#*##*##*2.BMSCs与正常T细胞共孵育前后细胞内细胞因子的变化SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006*为有统计学意义#*##*##*SunLY,etal.ScandJ55

T-betβ-actinA.T＋狼疮MSCs

B.单独TC.T＋正常MSCsGATA-3β-actin

ABCABC与正常鼠BMSCs共培养：T-bet↑，GATA-3↓TH1↑与狼疮鼠BMSCs共培养：T-bet↓，GATA-3↑TH2↑转录因子T-bet和GATA-3

SunLY,etal.ScandJRheumatol,2006A.T＋狼疮MSCsABC56包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表达↓，IL-12分泌↓向非成熟状态的偏离对同种T细胞的活化能力下降显著抑制单核细胞向DC分化（无需细胞间接触）KushidaT，etal.Cultureconditions(temperature,motion,etc.正常组与狼疮组表型表达并无差异（P<0.MSCs作用的靶T细胞—CD8+亚群－接受高剂量化疗＋自体干细胞移植狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移SCTdonorincidenceofacuteGVHDchondrocyte色氨酸犬尿素5×106MSCs/kg（来自患者父亲）移植物中除去供者T细胞（体外T细胞清除）↑IL-6*,IL-4,IL-10T＋狼疮BMSCsSCTdonorincidenceofacuteGVHDLeBlancC,etal.正常人与SLE患者BMSCs生长曲线比较正常MSCs：使TH1/TH2平衡向TH1偏移狼疮鼠病情缓解？狼疮MSCs：使TH1/TH2平衡向TH2偏移狼疮鼠病情恶化？

狼疮鼠BMSCs对T细胞免疫调节功能存在缺陷对TH1/TH2平衡影响包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激正常MSCs：使T57MSCs与B细胞人BMSCs可抑制B细胞增殖增殖抑制与B细胞的凋亡无关，而与细胞周期滞留于G0/G1有关由可溶性细胞因子介导（不需细胞间直接接触）抑制抗体生成(IgA、IgM、

IgG)CorcioneA,etal.Blood.2006;107:367-372MSCs与B细胞CorcioneA,etal.Bloo58MSCs与NK细胞静止期NK不能裂解人MSCs。IL-2活化的自体及异体NK细胞均可裂解BMSCsBMSCs抑制IL-2诱导的静止期NK细胞的增殖，部分抑制已活化NK细胞的增殖经IFN－γ预处理可抑制该裂解作用—上调MSCs的HLA-Ⅰ类分子水平阻止NK细胞的活化SpaggiariGM,etal.Blood.2006;107:1484-1490NK对MSCs的裂解作用.（E/T即NK/MSC）

MSCs与NK细胞SpaggiariGM,etal.B59MSCs与DC细胞人BMSCs与DC共培养对DC分化、成熟、功能影响

显著抑制单核细胞向DC分化（无需细胞间接触）

抑制DC分泌TNF-α的能力引起免疫耐受成熟DC（CD83、HLA-DR、CD1a、CD80、CD86）表达↓，IL-12分泌↓向非成熟状态的偏离对同种T细胞的活化能力下降

JiangXXetal.Blood，2005;105:4120-4126

MSCs与DC细胞JiangXXetal.Blood，60MSCs与CTL抑制CTLs的细胞毒作用呈时间和剂量依赖不能抑制已活化CTLs的细胞毒作用通过可溶性因子介导

MSCs不是CTLs作用的靶细胞RasmussonI,etal.Transplantation，2003，76:1208-1213

MSCs与CTLRasmussonI,etal.T61MSCs的免疫调控可能机制MSCs分泌可溶性细胞因子

CD8+调节性T细胞吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）

诱导调节性APCs

MSCs的免疫调控可能机制MSCs分泌可溶性CD8+调节吲哚62机制分泌可溶性细胞因子介导

IL-10、TGF-β1、前列腺素E2（PGE2）、肝细胞生长因子(HGF)、IL-2、IL-2R等不需要细胞间直接接触矛盾观点不同细胞因子介导需要与T细胞直接接触不同的来源、提取、培养、鉴定方法等可能导致收集的MSCs亚群不同（见下表）机制分泌可溶性细胞因子介导不同的来源、提取、培养、鉴定方法63Extractionsites(Prinzetal.,1999)Bonemarrow(livedonors）:hip,sternum,brokenbonesBonemarrow(cadaverdonors):allsites(rare)Othertissue:teeth,fat,muscle,cartilage,synovialfluid,skinDevelopmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDissociationmethodTrypsinationScrapingSuspensioncultureMarkercombinationsCD10+,CD13+,CD34+,CD56+,CD90+,MHC-1+(Youngetal.,1999)VCAM+,STRO-1+,CD73+,CD105+(Tulietal.,2003)Wnt2+,Wnt4+,Wnt5a+,Wnt11+,Wnt16+,Fz2+,Fz3+,Fz4+,Fz5+,Fz6+(Etheridgeetal.,2004)…IdentificationAdherencetoplasticMagneticbeadFACScellsortingOtherfactorsCelllineorexvivoDonorageDonorsexDonordiseasestatusMediumcompositionPointoffirstanalysisCultureconditions(temperature,motion,etc.)DifferentiationagentFrequencyofmediumchange…SetheS,etal.AgeingResearchReviews.2006;5:91-116Extractionsites(Prinzetal.64ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率包括同种异基因抗原、丝裂原或抗原特异性刺激利用MSCs的免疫抑制作用可治疗急性GVHDMSCs治疗急性GVHD一例间充质干细胞的临床应用心得－治疗后血小板>0.张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生存率在延长生存率上，PV＋IV>PV>IV2000年，KushidaT等用全身照射＋门静脉内注射（PV）＋尾静脉注射（IV）治疗狼疮（MRL/lpr），1年生存率达100％，高于（照射＋PV）及（照射＋IV）组2006;107:367-3722005;11:321-334SLE骨髓（P0）MSCs第25d倒置显微镜观察×100—全身照射+传统化疗KocON,etal.Donordiseasestatus张华勇，孙凌云，中华风湿病学杂志，2006DifferentiationagentMagneticbeadMSCs的输注可延长狼疮鼠生存期限Developmentaltissue:foetal,umbilical,placentaDjouadF,etal.Blood.2003;102:3837-3844诱导CD8+调节性Ｔ细胞产生MSCs作用的靶T细胞—CD8+亚群通过诱导CD8+调节性Ｔ细胞发挥免疫抑制作用Condedsplenocytes+MSCMLR鼠BMSCs抑制MLR中CD8+亚群的增殖CD8+亚群抑制淋巴细胞增殖ASCT同时输入MSCs可促进移植，降低GVHD,提高生65吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介导BMSCs在IFN-γ的诱导下大量表达IDO

色氨酸犬尿素

抑制T细胞抗原应答色氨酸加入Ｔ细胞的增殖可显著恢复

IDO-介导的色氨酸降解—人BMSCs抑制T细胞增殖MeiselR,etal.Blood.2004;103:4619-4621吲哚胺2,3二氧化酶（IDO）介导MeiselR,eta66诱导调节性APCs产生人BMSCs可能干涉APCs的成熟转变为调节性APCs

BeythS,etal.Blood.2005;105:2214-2219缺乏T细胞活化能力接触依赖性伴前炎症分子IL-12,TNF-α，MHC-Ⅱ表达↓抗炎症细胞因子IL-10表达↑MSCs调节性APCs防止或减轻GVHD？诱导调节性APCs产生BeythS,etal.B67MSCs的临床应用优点无或低免疫原性

无MHC限制诱导宿主免疫耐受降低移植排斥反应MSCs的临床应用优点68体外培养扩增MSCs作为组织工程的种子细胞，修复各种组织、器官作为基因治疗的载体细胞：转基因或基因修饰MSCs植入，替代有缺陷的骨髓利用免疫抑制、降低移植排斥，用于器官或组织移植与HSCs共移植治疗血液、肿瘤、免疫性等临床疾病防治GVHD

主要应用皮肤骨、软骨、肌腱关节脑神经组织心肌等主要应用69

DiseaseNo.SourceofMSCs/SCTOutcomeRef.StudyPatientsSettingHematologic15AutologousIVNoadverseeventsof1,Lazarusetal.malignanciesinfusion10,and50×106cellsBreastcancer28AutologousinIVinfusionwassafe;Koçetal.autologousSCTautologousSCTrecoverywasrapidInbornerrorsof11HLA-identicalNoimmuneresponseagainstkocetal.MetabolismfromSCTdonordonor;improvednerveconductiovelocityinmetachromaticleukodystrophyOsteogenesis5HLA-identicalfromGene-markedMSCsengrafted;Horwitzetal.ImperfectaSCTdonornewdenseboneformation;fewfracturesAcutemyeloid1HLA-haploidenticalSCTengraftmentwithnoGVHDLeeetal.LeukemiafromSCTdonorLeukemia31HLA-identicalfromRapidplateletengraftment;lowrassonietal.SCTdonorincidenceofacuteGVHDSevereaplastic1AllogeneicMSCEngraftment;improvedstromaFouillardetal.anemiaSevereacute1HaploidenticalMSC;ClearanceofgradeIVacuteLeBlancetal.GVHDunrelateddonorSCTGVHD,twice

MSCs与HSCs共移植的临床研究LeBlancC,etal.BiologyofBloodandMarrowTransplantation.2005;11:321-334DiseaseNo.701.血液疾病女，20岁，急性白血病

—全身照射+传统化疗—5.7×106CD34+cells/kg+1.5×106MSCs/kg（来自患者父亲）—无急性GVHD或慢性GVHD发生—移植后31月血象正常，无病情复发LeeST,etal.BrJHaematol.2002;118:1128-1131.1.血液疾病LeeST,etal.BrJHaema712.肿瘤28名乳腺癌患者－接受高剂量化疗＋自体干细胞移植－静脉输注1～2×106/kg

MSCs－无输注后毒性反应发生－治疗后血小板>0.5×109/L的平均时间9d(4-19d)

中性粒细胞>0.5×109/L的平均时间8d(6-11d)KocON,etal.ClinOncol,2000;18:307-316MSCs可促进HSCs移植2.肿瘤KocON,etal.ClinOncol,723.GVHD（移植物抗宿主病）为HSCT常见并发症（20％－60％）预防方法传统移植物中除去供者T细胞（体外T细胞清除）T细胞抗体处理(体内T细胞清除）免疫抑制药物使用新策略MSCs输注下调宿主抗原呈递细胞3.GVHD（移植物抗宿主病）为HSCT常见并发症（20％－7331名患者接受HLA相匹配的同胞HSCs＋MSCs移植MSCs剂量1－5×106/kg无MSCs输注相关毒性反应急性II～IVGVHD发生率为15%(对照组40%,P=0.01)慢性GVHD发生率为12%（对照组67%,P=0.002)6月存活率88%（对照组