兔瘟组织灭活苗的制作

关于兔瘟组织灭活苗的制作第一页，共二十八页，2022年，8月28日流行病学诊断临床诊断病理诊断第二页，共二十八页，2022年，8月28日

微生物(Microorganism)形体微小、结构简单，须借助于光学显微镜或电子显微镜进行观察。病毒(包括噬菌体)；细菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体等；真菌：包括酵母菌（单细胞）、霉菌（多细胞）；单细胞的藻类以及原生动物等。→非细胞型微生物→单细胞原核微生物→真核微生物第三页，共二十八页，2022年，8月28日

细菌(bacteria)的细胞形态

1、球菌单独存在时为圆球形，几个细菌联在一起时其接触面稍为扁平。按其分裂方向和分裂后排列状态，可以分为：单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌、链球菌、葡萄球菌。2、杆菌

细胞呈杆状或圆柱状，各种杆菌的长度与直径比例差异很大，有的粗短，有的细长，短杆菌近似球状，长杆菌近似丝状。一般来说，同一种杆菌其粗细比较稳定，而长度则经常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。有的杆菌很直，有的稍弯，有的两端截平如炭疽芽孢杆菌，有的略尖，有的半圆。第四页，共二十八页，2022年，8月28日

（三）革兰氏染色

革兰氏染色法于1884年由丹麦医生Gram创立，是延用至今的经典染色法。经革兰氏染色后可以把全部细菌分为G+和G-两大类。

染色机制：与细菌细胞壁的结构和组成有很大关系。

G+细菌：肽聚糖层厚，含量多，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，复染后不着色，保持结晶紫的颜色；

G-细菌：肽聚糖层很薄，含量少，脂肪含量高，经乙醇处理后部分细胞壁脂类可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径变大或通透性增加，不能阻止溶剂透入，酒精将结晶紫与碘的复合物洗脱，细菌被脱色，经复染后染成红色。

第五页，共二十八页，2022年，8月28日细胞壁革兰氏阳性菌(G+)革兰氏阴性菌(G-)厚度与强度厚、致密、坚韧薄、疏松肽聚糖数量、含量多层、含量高、占细胞干重40—90%单层、含量低、占细胞干重5—10%脂类含量少、占细胞干重1-4%多、占细胞干重11-22%磷壁酸（垣酸）+-脂多糖、磷脂、脂蛋白-+肽聚糖脂蛋白磷壁酸外膜第六页，共二十八页，2022年，8月28日染色操作步骤—涂片固定滴生理盐水挑取菌苔一环涂片热固定干燥取菌液一环涂片干燥第七页，共二十八页，2022年，8月28日革兰氏染色法1.涂片、干燥及固定2.

初染：在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1-2分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。3.媒染：先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。4.脱色：除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约25秒，后立即用流水冲洗。5.复染：滴加番红染色液，染2分钟，水洗后用吸水纸吸干。6.

镜检：观察染色结果图。第八页，共二十八页，2022年，8月28日细水冲洗结晶紫初染2min碘液媒染1min95%酒精脱色20s蕃红复染1~2min细水冲洗细水冲洗第九页，共二十八页，2022年，8月28日

革兰氏染色成败关键：酒精脱色，脱色不够将G-转变为G+，脱色过度将G+变成G-；涂片要均匀、薄；菌龄影响染色，菌龄老、陈旧的细菌培养物，往往G+转变成G-，一般做革兰氏染色用18小时左右的细菌培养物，不要超过24小时，以免影响染色性。第十页，共二十八页，2022年，8月28日油镜操作规程1.先用低倍镜和高倍镜观察涂片，待看到目的物后，将其移到视野中央。

2.在涂片上滴一滴香柏油，转动换转器使油镜针对通光孔。

3.使油镜与香柏油接触，这时油镜头几乎与载玻片相接触，切记不能使用粗调，以免压碎载玻片。

4.用细调旋钮慢慢提升镜头高度，直至物像清晰。切勿拧反方向。5.观察完毕后，使镜筒远离载物台。取下载玻片。用擦镜纸擦去镜头上的香柏油：先用干的擦镜纸擦1～2次，把大部分油去掉，再用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，最后再用干擦镜纸擦1次。擦拭时要顺镜头的直径方向，不要沿镜头的圆周擦。擦拭要细心，动作要轻。第十一页，共二十八页，2022年，8月28日五、结果：绘模式种、自选种镜检油镜视野图（比例、形状准确，注放大倍数，染色特性）G+(金黄色葡萄球菌)G-（枯草芽孢杆菌）G-（大肠杆菌）第十二页，共二十八页，2022年，8月28日GramStainof

StaphylococcusaureusGramStainof

EscherichiacoliAGramStainofaMixtureofGram-PositiveandGram-NegativeBacteria.第十三页，共二十八页，2022年，8月28日

兔病毒性出血症的诊断及其组织灭活苗的制造王海荣第十四页，共二十八页，2022年，8月28日

兔的病毒性出血症（rabbitviralhemorrhagicdiseaze）是兔的一种急性败血性传染病，RHDV抗原性强，组织灭活苗效果极佳，安全可靠，目前广泛使用的是肝组织甲醛灭活苗，联苗兔瘟、巴氏杆菌二联苗也已使用。第十五页，共二十八页，2022年，8月28日

组织灭活苗可分加佐剂和不加佐剂两种。含佐剂苗所产生的抗体水平较高于无佐剂苗，但产生免疫力的时间迟于无佐剂苗，而且生产程序较为复杂，成本也高。

当发生免瘟时，作为紧急接种，选用无佐剂苗更为理想，因产生免疫力较快，可提早控制疫情，即使平时预防接种，无佐剂苗也极为有效。第十六页，共二十八页，2022年，8月28日一

材料

（1）种毒强毒株组织毒1:10悬液感染成兔肌注1ml，48～72小时引起发病死亡。（2）制苗动物

3月龄以上未感染本病和未接种本病疫苗的健康免。

⑶组织捣碎机等第十七页，共二十八页，2022年，8月28日

二、操作方法1、攻毒取种毒2-5g制成1:10组织悬液，每毫升各加青链霉素1000IU单位,在4℃处理4～6小时，取上清液皮下或肌肉注射兔子，1ml/只，实验免接毒后的观察。第十八页，共二十八页，2022年，8月28日（1）抗生素可先配制成高浓度的原液，

-20℃保存。（2）抗生素的最高使用浓度。青霉素钾1万单位/ml链霉毒钾：20mg/ml即1mg=1000Iu2万Iu/ml。抗生素的配置：1先配浓溶液20万/ml，25万/ml第十九页，共二十八页，2022年，8月28日2、RHD的临床诊断及实验室诊断

临床上，RHD以神经症状为主，在免疫压力可表现出非典型变化。剖检以呼吸系统的严重出血和内脏实质器官的淤血肿大为特征。人工感染后的发病高峰时间接种后36～72小时。第二十页，共二十八页，2022年，8月28日

RHDV可凝集人的O型红细胞，温度对血凝无显著影响，PH4.4-7.2时血凝稳定，血凝具有特异性，能被高免血清所抑制。

第二十一页，共二十八页，2022年，8月28日

10%肝悬液4000rpm，10-15分钟离心后取上清，1%人O型红细胞做HA，放置20-30分钟出结果，血凝现象的观察时间不超过45分钟。

HA≥1︰160即为阳性

阳性病料无论是自然死亡还是人工感染致死，其血凝价一般不低于25。

健康兔只有22～23，＜24。第二十二页，共二十八页，2022年，8月28日RHD组织灭活苗的制造与检验

病料：PBS=1:10，生理盐水也可。捣碎、滤过，加入甲醛，使之含0.4%，37℃12—24小时，摇匀/2小时。

用0.8%甲醛生理盐水对倍稀释，分装，37℃温箱内灭活48小时，每2小时摇匀一次，备检。

第二十三页，共二十八页，2022年，8月28日方

法：

100g+400ml灭菌生理盐水——高速组织、捣碎碎机匀浆（13）——过滤——用0.8%甲醛生理盐水对倍稀释——分装——37℃温箱内灭活24小时，每2小时摇匀一次，备检。第二十四页，共二十八页，2022年，8月28日检验：

①安全检验：2—3倍接种量1ml—3ml(血液琼脂斜面，厌氧肉肝汤)

②无菌检验：培养基接种。

③效力检验：第二十五页，共二十八页，202