免疫标记技术及分析应用

关于免疫标记技术及分析应用第一页，共一百零二页，2022年，8月28日用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。第一节免疫标记技术第二页，共一百零二页，2022年，8月28日荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。第三页，共一百零二页，2022年，8月28日免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位第四页，共一百零二页，2022年，8月28日反应类型实验技术结果判断标记免疫反应荧光免疫技术检测荧光现象放射免疫技术检测放射性强度酶免疫技术检测酶底物显色发光免疫技术检测发光强度金免疫技术检测金颗粒沉淀免疫标记技术第五页，共一百零二页，2022年，8月28日用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性荧光素：异硫氰酸荧光素（黄绿色荧光）、藻红蛋白、罗丹明（红色荧光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶免疫荧光检测法（IFA）放射免疫检测法（RIA）酶免疫检测法（EIA）免疫标记技术液相（ELISA）、固相（免疫组化技术）第六页，共一百零二页，2022年，8月28日免疫荧光技术第二节第七页，共一百零二页，2022年，8月28日将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。第八页，共一百零二页，2022年，8月28日第九页，共一百零二页，2022年，8月28日抗体的荧光素标记标记原理：利用抗体蛋白的自由氨基与FITC的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITC结合成荧光抗体。标记方法:

搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间短，荧光素用量少，但有非特异性染色。

透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，非特异染色较低。FITC异硫氰酸荧光素第十页，共一百零二页，2022年，8月28日常用的荧光素返回第十一页，共一百零二页，2022年，8月28日第十二页，共一百零二页，2022年，8月28日去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收荧光抗体的纯化第十三页，共一百零二页，2022年，8月28日荧光检测仪（1）荧光显微镜（2）荧光分光光度计（3）流式细胞仪（4）荧光偏振光分析仪第十四页，共一百零二页，2022年，8月28日荧光显微镜

利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。

第十五页，共一百零二页，2022年，8月28日

荧光显微镜的种类

透射式

落射式第十六页，共一百零二页，2022年，8月28日荧光显微镜的构造吸收滤色镜激发滤色镜分色镜汞灯第十七页，共一百零二页，2022年，8月28日流式细胞仪第十八页，共一百零二页，2022年，8月28日荧光酶标仪第十九页，共一百零二页，2022年，8月28日（1）直接荧光染色法 将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原。优点：简单、快速、特异性高。缺点：敏感性差。第二十页，共一百零二页，2022年，8月28日直接法

间接法

第二十一页，共一百零二页，2022年，8月28日第二十二页，共一百零二页，2022年，8月28日第二十三页，共一百零二页，2022年，8月28日（2）间接荧光染色法 将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。第二十四页，共一百零二页，2022年，8月28日直接法

间接法

第二十五页，共一百零二页，2022年，8月28日第二十六页，共一百零二页，2022年，8月28日（3）补体荧光染色法 将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。第二十七页，共一百零二页，2022年，8月28日优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。第二十八页，共一百零二页，2022年，8月28日第二十九页，共一百零二页，2022年，8月28日第三十页，共一百零二页，2022年，8月28日免疫酶技术EnzymeImmunoassay（EIA）第三节第三十一页，共一百零二页，2022年，8月28日就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。第三十二页，共一百零二页，2022年，8月28日抗原抗体反应＋酶催化反应肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计特异、敏感可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在µg、甚至ng水平上对其进行定量。第三十三页，共一百零二页，2022年，8月28日将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。第三十四页，共一百零二页，2022年，8月28日优点：①灵敏度高，特异性强；②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查；③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染；④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展；⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。第三十五页，共一百零二页，2022年，8月28日缺点： 标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。第三十六页，共一百零二页，2022年，8月28日一、常用的酶及其底物酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。常用酶底物显色

辣根过氧化物酶邻苯二胺、H2O2橙黄色四甲基联苯胺、H2O2蓝色

碱性磷酸酶对硝基苯磷酸酯黄色第三十七页，共一百零二页，2022年，8月28日第三十八页，共一百零二页，2022年，8月28日二、标记方法酶结合物技术简单、产率高；不影响酶和抗体（抗原）的生物活性；所得酶标记物稳定；较少形成酶与酶、抗体与抗体、抗原与抗原的聚合物。第三十九页，共一百零二页，2022年，8月28日戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶

改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG

第四十页，共一百零二页，2022年，8月28日三、酶标记物的纯化及鉴定1、纯化游离酶：增加非特异染色游离抗原（抗体）：竞争降低特异性染色葡聚糖凝胶层析法50%饱和硫酸铵沉淀提纯法第四十一页，共一百零二页，2022年，8月28日2、鉴定免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA酶标记率测定：分光光度法第四十二页，共一百零二页，2022年，8月28日四、酶标仪（酶联免疫检测仪）比色测定波长、吸光度范围、光学系统、检测速度、震板功能、温度控制、定性和定量的软件，自动洗板、温育、加样450nm、492nm、620nm、630nm、650nm、405nm第四十三页，共一百零二页，2022年，8月28日返回第四十四页，共一百零二页，2022年，8月28日第四十五页，共一百零二页，2022年，8月28日第四十六页，共一百零二页，2022年，8月28日第四十七页，共一百零二页，2022年，8月28日免疫标记技术放射物标记技术酶标技术免疫荧光技术其他标记技术酶联免疫吸附技术酶免疫组化技术双抗体夹心法竞争法双抗原夹心法间接法双位一点法ELISA第四十八页，共一百零二页，2022年，8月28日酶联免疫吸附试验ELISAEnzyme-LinkedImmunosorbentAssay第四十九页，共一百零二页，2022年，8月28日ELISA基本实验过程包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色第五十页，共一百零二页，2022年，8月28日ELISA原理图YY

①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）

②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）Y②酶标记的抗原或抗体（标记物）第五十一页，共一百零二页，2022年，8月28日固相抗原或抗体1.固相载体的性状：聚苯乙烯等固相载体2.试剂的配制：所有试剂的配制都用双蒸水3.包被：(1)包被缓冲液：pH9.6碳酸盐缓冲液(2)包被的浓度:10µg/ml(3)包被的时间：4℃过夜或37℃1-3h(4)包被的量：100µl第五十二页，共一百零二页，2022年，8月28日酶底物显色反应

测定波长

辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐

橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642

碱性磷酸酶

4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶

ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶

甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色

360,450

420

酶及其底物第五十三页，共一百零二页，2022年，8月28日DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪

DNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪测定OD值第五十四页，共一百零二页，2022年，8月28日1.直接法2.间接法3.夹心法4.竞争法5.捕获法ELISA种类第五十五页，共一百零二页，2022年，8月28日1.直接法第五十六页，共一百零二页，2022年，8月28日directELISA—forAg第五十七页，共一百零二页，2022年，8月28日directELISA—forAb返回第五十八页，共一百零二页，2022年，8月28日2.间接法+++

间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。第五十九页，共一百零二页，2022年，8月28日第六十页，共一百零二页，2022年，8月28日第六十一页，共一百零二页，2022年，8月28日包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定间接法ELISA过程第六十二页，共一百零二页，2022年，8月28日3.夹心法：+++双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法第六十三页，共一百零二页，2022年，8月28日第六十四页，共一百零二页，2022年，8月28日获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定双抗体夹心法第六十五页，共一百零二页，2022年，8月28日双抗原夹心法原理包被体待测抗体包被抗原标记抗原第六十六页，共一百零二页，2022年，8月28日双夹心法返回第六十七页，共一百零二页，2022年，8月28日4.竞争法第六十八页，共一百零二页，2022年，8月28日第六十九页，共一百零二页，2022年，8月28日竞争法的原理固相支持物表面待测物包被抗体标记抗原此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。第七十页，共一百零二页，2022年，8月28日用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量第七十一页，共一百零二页，2022年，8月28日俘获抗体（二抗）待测抗体标记抗原包被体5.捕获法血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法第七十二页，共一百零二页，2022年，8月28日包被体待测抗原包被连接物标记抗体俘获抗体特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺第七十三页，共一百零二页，2022年，8月28日（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。捕获法操作过程第七十四页，共一百零二页，2022年，8月28日食品中盐酸克伦特罗的测定食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，赭曲霉毒素）食品中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在食品安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测第七十五页，共一百零二页，2022年，8月28日河豚毒素

植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘

主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测：第七十六页，共一百零二页，2022年，8月28日ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊断中的作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体第七十七页，共一百零二页，2022年，8月28日ELISA试剂盒第七十八页，共一百零二页，2022年，8月28日放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）第四节第七十九页，共一百零二页，2022年，8月28日利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质第八十页，共一百零二页，2022年，8月28日RosalynYalow

（美国）（1977年获诺贝尔生理和医学奖）“forthedevelopmentofradioimmunoassaysofpeptidehormones”VeteransAdministrationHospital

Bronx,NY,USAb.19211959年，Yalow和Berson首次应用放射免疫分析法测定胰岛素第八十一页，共一百零二页，2022年，8月28日与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。第八十二页，共一百零二页，2022年，8月28日放射免疫技术优点：①特异性强，即抗原抗体的特异性反应；②灵敏度高，结果精确，检测范围10-910-12g；③操作流程简单易行，加样程序简单，测量和数据处理自动化；④样品用量少、一般无需复杂的提纯步骤；⑤应用范围广泛，尤其是测量小分子半抗原。缺点：需要昂贵的检测仪器；同位素污染。第八十三页，共一百零二页，2022年，8月28日结合相游离相第八十四页，共一百零二页，2022年，8月28日免疫胶体金标记技术第五节第八十五页，共一百零二页，2022年，8月28日胶体金标记技术以胶体金作为示踪标记物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。

第八十六页，共一百零二页，2022年，8月28日胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。第八十七页，共一百零二页，2022年，8月28日吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒运载到组织或细胞内、固相载体上的相应抗体、抗原的位置。由于金颗粒具有高电子密度的特性，这些标记物在抗原抗体反应处聚集达到一定密度时（即金颗粒107个/mm2），出现肉眼可见的粉红色斑点。第八十八页，共一百零二页，2022年，8月28日

胶体金标记技术第八十九页，共一百零二页，2022年，8月28日胶体金纸条的不同种类第九十页，共一百零二页，2022年，8月28日层析法技术优势：简单\现场\快速第九十一页，共一百零二页，2022年，8月28日试纸条组成结构控制线（C线）第九十二页，共一百零二页，2022年，8月28日与常规诊断方法相比：优点缺点快速：全部检测过程仅需5-30分钟。简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，无需专业人员，携带方便，可随时随地进行。廉价：单个测试条成本极低

可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测，可立刻拿到结果，不必等待。

稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。

检测标本种类多：在临床检测中，样品可能有尿、血液、血清、唾液或其他体液。在非临床检测中，样本可能是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液。定量问题灵敏度问题第九十三页，共一百零二页，2022年，8月28日应用领域类别应用领域检测的物质人类医学各级医院，血站，CDC，防疫站，诊断中心；家庭自检；商检系统；边检口岸；公安系统传染病（乙肝五项，HIV,SARS等）标志物（AFP、肌钙蛋白、粪便血红蛋白等）女性妊娠（hCG(早孕)，LH，FSH)毒品（吗啡、K粉、摇头丸、冰毒）农牧业畜牧兽医站,商检系统,边检口岸，农牧类院系和研究所传染病（禽流感，兽瘟疫等）病毒（烟草花叶病毒、犬细小病毒等）环境