硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件

中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法聪明出于勤奋，天才在于积累中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法聪明出于勤奋，天才在于积累基因组与蛋白质组学技术马珊珊中山医学院药理教研室中山大学蛋白质组学研究中心转录调控研究常用方法1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：增强:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法聪明出于勤奋1硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件2硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件3硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件4硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件5意义神经元凋亡→AD、PD等神经退行性疾病信号转导与基因调控研究－寻找调控凋亡的关键分子揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点6意义神经元凋亡→AD、PD等神经退行性疾病6JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路

撤NGF处理交感神经元撤钾处理小脑颗粒神经元

β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元黑质多巴胺神经元凋亡

……7JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路撤NGF处理交88c-Jun的靶基因是什么？

FasL

MolCellBiol2019

MolCellNeurosci2019JCellBiol2019Bim

Neuron2019

Neuron2019

NeurosciLett20199c-Jun的靶基因是什么？

FasLMolCell1010寻找c-Jun促凋亡靶基因

－基因芯片方法促凋亡靶基因：1凋亡时上调2Ad-169抑制3促凋亡作用

25K,5K,5K+Ad-169提RNAcDNAAffymetrixgenechip寻找c-Jun促凋亡靶基因

11Δ169结构示意图Δ169结构示意图12腺病毒技术感染率80％腺病毒技术感染率80％13各类病毒比较见下表病毒表达系统腺病毒Adenovirus慢病毒Lentivirus腺相关病毒Ad-associatedvirus病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒单链DNA病毒复制自主复制自主复制复制缺陷是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达感染细胞类型分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞表达丰度高水平表达中水平表达高水平表达表达时间快（1-2天）慢(

2-4天)慢滴度滴度高达1012pfu/ml滴度最高可达109TU/ml滴度最高可达105TU/ml克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过10kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过5kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性各类病毒比较见下表病毒腺病毒慢病毒腺相关病毒病毒基因组双链D14c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak215c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,JNK/c-Jun介导dp5表达上调16JNK/c-Jun介导dp5表达上调16

c-Jun直接调控dp5直接调控:c-Jun结合dp5启动子触发dp5表达

c-Jun直接调控dp5直接调控:c-Jun结合dp517确立dp5启动子核心区确立dp5启动子核心区18分析dp5启动子上的TF位点TRANSFAC：

gene-regulation/pub/databases.htmlGenomatixSuite：需注册ALGGEN：alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.htmlalggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3分析dp5启动子上的TF位点TRANSFAC：19硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件20Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点21dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？22报道基因报道基因23ATF位点是dp5上调的关键位点24ATF位点是dp5上调的关键位点24c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？25c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？25ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)26ElectrophoreticMobilityShiftc-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合27Chromatin

Immunoprecipitation

(ChIP)Chromatin

Immunoprecipitation28c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合29c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合29dp5上调是神经元凋亡所必需30dp5上调是神经元凋亡所必需30siRNAsiRNA313232JonathanHamLabJonathanHamLab333434硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件35ATF位点介导c-Jun靶基因上调反式作用因子c-Jun/ATF2ATFsiteTTACCTCA36ATF位点介导c-Jun靶基因上调反式作用因子c-Jc-Jun异二聚体的靶序列37c-Jun异二聚体的靶序列373838393940404141c-Jun/ATF2形成二聚体42c-Jun/ATF2形成二聚体42Immunoprecipitation(IP)Immunoprecipitation(IP)43c-Jun/ATF2介导ATF活性c-Jun/ATF2介导ATF活性44抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡45抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡45干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡46干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡46atf-decoy抑制神经元凋亡p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mut47atf-decoy抑制神经元凋亡p12ATF-(TTACc-Jun、ATF2协同促凋亡c-Jun、ATF2协同促凋亡48constitutivelyactivateconstitutivelyactivate49c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡50515151BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay)

Chang-DengHuetal.2019,MolCellBiFC(BimolecularFluorescence52凋亡时BiFC增多凋亡时BiFC增多53Fos↑→BiFC↓,

Fos↓→BiFC↑54Fos↑→BiFC↓,Fos↓→BiFC↑54Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成55Fos抑制c-Jun/ATF2二聚体形成55Fos保护神经元56Fos保护神经元565757硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件58转录调控研究常用方法1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：

增强:overexpression,constitutivelyactivate

抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株转录调控研究常用方法1.检测基因的表达水平：59转录调控研究常用方法4.从源头寻找差异基因方法：genechip,ChIPonchip,ChIPsequence5.启动子分析：确立启动子核心区预测启动子上的转录因子结合位点6.证明转录因子结合在启动子上：EMSA，ChIP7.蛋白质与蛋白质相互作用Co-IP,GST-pulldown,BiFC,FRET，PLA…转录调控研究常用方法4.从源头寻找差异基因方法：60谢谢！谢谢！6166、节制使快乐增加并使享受加强。——德谟克利特

67、今天应做的事没有做，明天再早也是耽误了。——裴斯泰洛齐

68、决定一个人的一生，以及整个命运的，只是一瞬之间。——歌德

69、懒人无法享受休息之乐。——拉布克

70、浪费时间是一桩大罪过。——卢梭66、节制使快乐增加并使享受加强。——德谟克利特62中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法聪明出于勤奋，天才在于积累中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法聪明出于勤奋，天才在于积累基因组与蛋白质组学技术马珊珊中山医学院药理教研室中山大学蛋白质组学研究中心转录调控研究常用方法1.检测基因的表达水平：mRNA：RT-PCRProtein：WB，ICC，IHC，IFTranscription：报道基因2.证明转录因子的功能：增强:overexpression,constitutivelyactivate抑制:inhibitor，dominantnegative,siRNA，KOmice3.导入外源基因方法：质粒转染，病毒感染，稳定细胞株中山大学硕士研究生生物医学课程转录调控基本方法聪明出于勤奋63硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件64硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件65硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件66硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件67意义神经元凋亡→AD、PD等神经退行性疾病信号转导与基因调控研究－寻找调控凋亡的关键分子揭示神经退行性疾病机制并确立新的防治靶点68意义神经元凋亡→AD、PD等神经退行性疾病6JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路

撤NGF处理交感神经元撤钾处理小脑颗粒神经元

β淀粉样蛋白处理大脑皮质神经元黑质多巴胺神经元凋亡

……69JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路撤NGF处理交708c-Jun的靶基因是什么？

FasL

MolCellBiol2019

MolCellNeurosci2019JCellBiol2019Bim

Neuron2019

Neuron2019

NeurosciLett201971c-Jun的靶基因是什么？

FasLMolCell7210寻找c-Jun促凋亡靶基因

－基因芯片方法促凋亡靶基因：1凋亡时上调2Ad-169抑制3促凋亡作用

25K,5K,5K+Ad-169提RNAcDNAAffymetrixgenechip寻找c-Jun促凋亡靶基因

73Δ169结构示意图Δ169结构示意图74腺病毒技术感染率80％腺病毒技术感染率80％75各类病毒比较见下表病毒表达系统腺病毒Adenovirus慢病毒Lentivirus腺相关病毒Ad-associatedvirus病毒基因组双链DNA病毒RNA病毒单链DNA病毒复制自主复制自主复制复制缺陷是否整合病毒基因组游离于宿主基因组外，瞬时表达病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达感染细胞类型分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞分裂和不分裂细胞表达丰度高水平表达中水平表达高水平表达表达时间快（1-2天）慢(

2-4天)慢滴度滴度高达1012pfu/ml滴度最高可达109TU/ml滴度最高可达105TU/ml克隆容量可插入高达8kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过10kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低可插入不超过5kb的外源片段，滴度随插入片段长度增加而降低免疫原性高免疫原性低免疫原性低免疫原性各类病毒比较见下表病毒腺病毒慢病毒腺相关病毒病毒基因组双链D76c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,atf3,drak277c-Jun靶基因：dp5,puma,caspase-3,JNK/c-Jun介导dp5表达上调78JNK/c-Jun介导dp5表达上调16

c-Jun直接调控dp5直接调控:c-Jun结合dp5启动子触发dp5表达

c-Jun直接调控dp5直接调控:c-Jun结合dp579确立dp5启动子核心区确立dp5启动子核心区80分析dp5启动子上的TF位点TRANSFAC：

gene-regulation/pub/databases.htmlGenomatixSuite：需注册ALGGEN：alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi?dirDB=TF_8.3&idCon=135804298400&getFile=resumSearchRes.htmlalggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3分析dp5启动子上的TF位点TRANSFAC：81硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件82Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点Dp5启动子上有c-Jun结合的ATF位点83dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？dp5启动子上的ATF位点对其转录活性是否重要？84报道基因报道基因85ATF位点是dp5上调的关键位点86ATF位点是dp5上调的关键位点24c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？87c-Jun是否直接结合在dp5启动子的ATF位点上？25ElectrophoreticMobilityShiftAssay(EMSA)88ElectrophoreticMobilityShiftc-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合89Chromatin

Immunoprecipitation

(ChIP)Chromatin

Immunoprecipitation90c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合91c-Jun与dp5启动子ATF位点直接结合29dp5上调是神经元凋亡所必需92dp5上调是神经元凋亡所必需30siRNAsiRNA939432JonathanHamLabJonathanHamLab959634硕士研究生生物医学课程-转录调控基本方法课件97ATF位点介导c-Jun靶基因上调反式作用因子c-Jun/ATF2ATFsiteTTACCTCA98ATF位点介导c-Jun靶基因上调反式作用因子c-Jc-Jun异二聚体的靶序列99c-Jun异二聚体的靶序列3710038101391024010341c-Jun/ATF2形成二聚体104c-Jun/ATF2形成二聚体42Immunoprecipitation(IP)Immunoprecipitation(IP)105c-Jun/ATF2介导ATF活性c-Jun/ATF2介导ATF活性106抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡107抑制c-Jun或ATF2保护神经元凋亡45干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡108干扰c-Jun、ATF2抑制神经元凋亡46atf-decoy抑制神经元凋亡p12ATF-(TTACATCA)-c-Jun/ATF2p12ATF-(GGACATCG)-mut109atf-decoy抑制神经元凋亡p12ATF-(TTACc-Jun、ATF2协同促凋亡c-Jun、ATF2协同促凋亡110constitutivelyactivateconstitutivelyactivate111c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡c-Jun/ATF2二聚体促进神经元凋亡11211351113BiFC(BimolecularFluorescenceComplementationAssay)

Chang-DengHuetal.2019,MolCellBiFC(BimolecularFluorescence114凋亡时