HCN4基因心脏起搏机制与心律失常关系研究

HCN4基因心脏起搏机制与心律失常关系研究【内容摘要】hcn4基因编码超等化激活阳离子电流〔if〕通道构造蛋白，具有调节心脏起搏的功能，心脏上打针hcn4基因转染的心肌细胞能够起到生物起搏作用。hcn4与各种心律失常关系亲密，家族性窦性心动过缓等遗传性心律失常患者hcn4基因外显子碱基的缺失或颠换突变导致hcn4通道蛋白的改变，引起if幅度减少，属于常染色体显性遗传。心力衰竭、心肌肥厚、心房颤抖等获得性心律失常患者hcn4基因的表达上调，能够使if增大，导致心律失常发生。【本文关键词语】hcn4基因；心律失常；心脏起搏机制hcn4基因属于超等化激活环核苷酸门控阳离子通道基因家族〔hcn〕，参与编码超极化激活阳离子电流〔if〕通道构造蛋白，是心脏动作电位的缓慢的舒张期自动去极化激活的一个主要构成部分，参与窦房结细胞自觉性舒张期膜去极化经过，具有调控起搏的功能。1999年ludweding等［1］在筛查cdna文库时，通过探针发现hcn4基因的cdna。随后，seifert等［2］从人类丘脑cdna文库中使用pcr技术和重组体质粒构建成功克隆出hcn4基因。2003年，seifert等［3］又通过原位杂交和免疫组织化学分析，发现hcn4基因在发育中的胚胎心脏上高表达。hcn4基因突变可能与病态窦房结综合征〔sicksinussyndrome;sss〕,心房颤抖〔atrialfibrillation,af〕的多种心律失常相关。现笔者就hcn4基因的构造功能、心脏起搏机制及其与多种心律失常发生发展关系的最新进展做一综述。1hcn4基因及其蛋白的构造特点1.1hcn4基因的定位与构造hcn4基因位于人染色体15q23q24，全长5065bp,含有8个外显子，分子量为129.1kda［4］。hcn4基因cdna的全长为6.8kb，有1个序列标签位点〔sts〕。hcn4基因3’末端的未翻译区长度为2.6kb，具有特征性的限制区域和碱基序列。5’末端的转录序列中有相当高的gc含量〔77%〕，其四周有一个明显的gpc岛，这反映出hcn4蛋白n端可大量出现脯氨酸和甘氨酸的氨基酸残基。northern杂交和pcr分析表示清楚，hcn4基因重要在心室及心房表达。1.2hcn4蛋白的构造hcn4基因的编码产品hcn4蛋白是由1203个氨基酸构成，包括6个跨膜片段(s1s6)，一个孔道区以及一个环核苷酸结合域〔cnbd〕。其中s4片段有一群带正电荷的氨基酸,具有电压感受器作用,类似于在去极化激活的电压门控k+通道中的作用。hcn4通道的激活元件包含s1,s1s2的联合子，s2及s6的c末端区域［5，6］。位于s5和s6间的一段氨基酸序列部分贯穿细胞膜内,是构成亲水性孔道而使离子选择性通过的部分,称为孔道区(poreregion)或p区,有大多数k+选择性通道所特有的gyg标记序列。不外除gyg标记之外的氨基酸序列和k+选择性通道是不一样的,是造成对k+选择性低的原因。hcn通道还表现出与环腺苷酸门控通道的高度同源性,即在c末端存在一个120个氨基酸的cnbd,它的作用是调节通道对camp反应［7］。将cnbd切除后可模仿camp效应,即hcn门控的电压依靠性被移向更正的电压水平,其幅度类似于camp饱和浓度时的最大效应。hcn4基因的转录产品可在大脑、心脏和睾丸中表达。2hcn4基因的功能及其心脏起搏机制2.1hcn家族基因产品的功能hcn通道属于电压门控阳离子通道超家族，hcn家族的基因产品hcn1、hcn2、hcn3、hcn4，是“特种电流〞〔funnycurrent,if〕通道的分子构成元件；if是心脏起搏电流，并间接起到调控心率自觉递质活动的作用。虽然hcn4个家族成员大约60%基因序列一样，但他们的生物学功能各不一样［8-10］：hcn通道在神经细胞和心肌细胞中均被发现。hcn基因家族的4个成员在心脏中存在的有3个,即hcn1、hcn2和hcn4。hcn2重要作用在于维持起搏节律的稳定。hcn4重要作用是使起搏的频率维持在一定水平以上并随着机体不同的生理状况而对频率进行调整。有研究发如今兔窦房结的某些单个细胞有hcn1基因的表达,证明心肌细胞上存在hcn通道蛋白。hcn1和hcn2及hcn4分别组装构成的异源多聚体,这可能提供一个具有稍快起搏电流的中心细胞,这些细胞将具有比四周细胞稍快的搏动频率,这是真正心脏起搏点的主要特征。hcn3重要分布于神经纤维上,在心房肌组织上则以hcn2和hcn4亚型表达为主，在窦房结细胞中hcn4是最重要的hcn亚型。ishii、stieber等［3，11］对部分心肌组织中2种亚型对起搏通道的奉献的比较,以为起搏通道由单独的hcn2或hcn4亚型构成,即起搏通道的同源构成学说,但也有报道起搏通道由hcn2和hcn4共同构成,为起搏通道的异源构成学说。notomi、shigemoto等［12］也在实验中发现，在大脑，hcn家族的4中亚型均被检测到，但是各个不同的hcn亚型通道的mrnas的表达水安然平静分布情况却截然不同。hcn2是最丰富的神经通道，在大脑中能够普遍找到。与此对照的是，hcn1和hcn4在特定的区域表达量高：hcn4重要在丘脑表达，hcn1重要在海马表达。hcn3在大脑的大部分地方的表达量低，但是在嗅球和下丘脑的一些核团表达量较高。hcn通道也在肾脏和外周神经元，例如脊神经根等处表达。基因敲除显示：hcn2的缺失能够出现窦性心律失常和癫痫［13］，hcn1的缺失能够出现运动神经学习和记忆的障碍［14］，hcn4的突变已经在病人中发现表现为自觉性窦房结功能失常［15，16］。2.2hcn4的心脏起搏机制hcn4在窦房结细胞的舒张期去极化中起到主要作用。hcn4阳离子通道是六个跨膜超等家族之一［6，17］。通过对人胚胎肾293〔hek293〕细胞的研究，hcn4在hek293细胞比心肌细胞的激活阈值更低。与其他电压门控通道相比，hcn4通道在超等化时开放，在正电位时关闭。hcn4的平均激活曲线的半最大电压为-72.5mv，环核苷酸camp和cgmp通过使通道的激活曲线向更高层次的正电位转移11mv进而提升hcn4通道的活动性。if最为人所知的作用是通过在窦房结的产生的起搏电流控制心脏的心率和节律［18］。if在紧随动作电位终止的细胞膜超等化时激活，并产生一个使细胞膜缓慢去极化的内向na+电流。此时，窦房结细胞交感神经刺激将升高camp的水安然平静增长if，进而加速舒张期去极化和心率。相反，毒蕈碱样乙酰胆碱受体兴奋降低camp的水安然平静减少if，使心率减缓。在窦房结，hcn4通道的激活产生一个内向的阳离子电流if，他能够反复的使起搏点电位从70mv向-40mv去极化，最终导致动作电位的发生。王泽文等［19］的实验结果表示清楚，hcn4基因修饰大鼠间充质干细胞心脏起搏样细胞具有窦房结细胞类似的动作电位。steiber等［3］的实验研究结果表示清楚，hcn4+/-的小鼠是能存活的，能够正常喂养，与正常的小鼠无区别。但是，hcn4-/-的小鼠胚胎在胚胎期的9.5天时死亡。可见，心脏hcn4基因的特定缺失会造成与普遍缺失一样的胚胎致死率。hcn4基因缺失的胚胎比正常的胚胎心率慢，同时心脏上没有产生动作电位的成熟的起搏点，心率和动作电位不能通过camp水平升高而增长。steiber等［3］推断hcn4基因在新生儿窦房结中对起搏电位的产生起着至关主要的作用。quj等［20］以腺病毒为载体将鼠hcn4〔mhcn4〕直接打针入狗左心耳根部，同时右心房缝一参考电极，3-4天后，迷走神经刺激抑制窦性节律，显示左心房部位有异位起搏点产生，增长刺激亦可抑制该起搏点，对离子通道进一步研究发现，在没有表达hcn4基因的细胞if为7±4pa(电压-130mv时)，而表达有mhcn4基因的心房肌细胞起搏电流增大500倍以上，在电压-125mv时电流达3823±713pa，阈值约为-75mv，平均最大半激活电压为-95.2±0.4mv，而膜电容在两组没区别。在另一个实验中,研究小组通过导管将mhcn2注入狗的左前分支上，在打针点构成较快的逸搏心率,提示在哺乳动物心肌细胞转染编码起搏电流的hcn基因能够构成有效的生物起搏［21］。这些研究均提示hcn4基因具有特征性的表达形式和缓慢门控作用，参与控制心脏起搏细胞的节律性活动。3hcn4基因与心律失常发生的相关性3.1hcn4与遗传性心律失常在hcn4与各种心律失常的关系中，研究的最早、最多的当属其与遗传性心律失常发生发展的关系。ueda等［16］分析了6名窦房结功能障碍患者，3名进展性心脏传导阻滞患者和14名自觉性的心室颤抖患者的hcn4基因，发现这些患者6个已经知道的离子通道出现阴性突变。同时，ueda等通过对一名43岁病态窦房结综合症的女性患者研究，鉴定出hcn4基因第5个外显子的一个ga转换的杂合现象，导致了核跨膜区域和环核苷酸连接区域的联合部位的一个保守残基asp553asn〔d553n〕的替换。这名患者的姐姐和儿子也患有同种疾病，而在他们的hcn4基因也发现突变的杂合现象，但是在对照组380组染色体中未发现的突变。体外分析提示由于一个显性负相型的hcn4通道运输障碍，出现膜表达下降和if减低。该实验研究结果表示清楚转染的cos7细胞中突变通道的共表达通过显性负相方式减少细胞外表正常通道，同时膜片钳检测证明伴有if幅度的减低。milanesi等［22］发现窦性心动过缓与hcn4离子通道的编码基因突变相关。窦房结的起搏通道自动产生电流和间接调控camp依靠的心率自动调节。与心动过缓相关的突变发生在靠近camp结合处的部位，功能分析表示清楚突变的通道正常回应camp，与正常的通道相比在一个更负的电位激活。这些变化类似模拟稍微的迷走神经刺激，通过减少内向的舒张期电流而减慢心率。因而，减少起搏通道的作用而导致家族性心动过缓。milanesi等筛查了52名心脏起搏点hcn4基因编码区突变的窦性心动过缓患者。他们鉴定出一个患有无症状性窦性心动过缓的意大利家庭〔心率43次/分〕，携带一个hcn4基因第7个外显子ser672到arg(s672r)的错意突变，而这个突变是由于第2016个核苷酸ca的颠换所引起。然后，他们对这个家族所有27名成员的dna进行检查，pcrsscp分析表示清楚所有心动过缓表型中有s672r突变的共分离，这个结果提示该突变为常染色体显性遗传。出现基因突变的家族成员的心率范围为43次/分至60次/分，而正常基因的家族成员的心律范围为64次/分至81次/分，同时计算出hcn4基因与窦性心动过缓的最大优势对数评分为5.47。nof等［23］对一个有8名患有无症状的窦性心动过缓的患者的四世同堂的家庭的鉴定中检测出一个hcn4基因第4个外显子的1439gc的杂合现象，碱基的颠换导致跨膜核成型区域gly480arg(g480r)保守残基替换。这个突变在8个未受影响的家族成员和100个不相关的对照基因中未发现。基因功能分析表示清楚突变通道的电压激活比正常通道低；基因表达分析表示清楚与正常通道相比，突变通道出现合成和运输的障碍。schulzebahr等［15］对一名66岁具有晕厥症状的典型窦性心动过缓和间歇性心房颤抖的老年女性患者的鉴定中发现hcn4基因第5个外显子有一个1bp的缺失(1631缺c)的杂合现象，碱基的缺失引起密码子573框移导致进而导致c端环核苷酸连接区域的蛋白缩短。这个突变在其3个未患病的孩子及对照组362对染色体中未发现。cos7细胞的膜片钳实验表示清楚突变通道介导的if对细胞camp水平升高不敏感；共同表达研究表示清楚hcn4基因的突变能够导致显性负相效应。以上研究均表示清楚，hcn4基因与遗传性心律失常，尤其是家族性窦性心动过缓的发生发展亲密相关。外显子碱基的缺失或颠换而导致的杂合现象是hcn4基因突变的重要机制，同时hcn4基因突变符合常染色体显性遗传。3.2hcn4与获得性心律失常robinsonrb［17］等研究指出，高血压大鼠和心力衰竭病人的心室肌上有if的明显变化。在老年自觉性高血压大鼠if增大，用血管紧张素iiat1受体阻断剂罗沙坦可降低增大的if电导。在β2肾上腺能过表达的老年小鼠，伴随心肌肥厚心室的if增大5倍，同时有hcn4基因上调优势表达。michels等［24］的实验研究结果表示清楚，通过单通道分析hcn4基因和if，单通道hcn4基因阈电位比hcn家族多种亚型共存在细胞膜上多通道作用时阈电位高。这个观察结果支持一种假设if在心力衰竭、心肌肥厚和心房颤抖等这些获得性心律失常存在时的过度表达导致心律失常的发生，同时提示特定if阻滞剂的电位治疗作用能够改变疾病病理变化经过。故hcn4基因在获得性心律失常的发生中可能是一个关键性的起搏通道基因，且其致病机制为hcn4基因表达上调和if的增大。4结束语hcn4基因作为一种新近发现的编码心脏if的通道基因，关于其突变机制、心脏起搏机制及其与心律失常关系的研究正在不断深切进入。当前，研究较多的还是hcn4基因心脏起搏机制及其与窦房结功能障碍的关系，尤其是家族性窦性心动过缓已表现出hcn4基因突变缺失或颠换常染色体显性遗传的特征。同时越来越多的研究已经揭示该基因在多种心律失常的发生、发展和预后及生物起搏等方面都发挥了无足轻重的作用。hcn4基因与其他一些心律失常如风湿性心脏病心房颤抖等的研究也正在继续，我们需要更多的实验数据来说明其发生机制。通过对其构造功能研究，能够得知hcn4天然发生突变是怎样影响if通道功能，将为心律失常的诊断和治疗的提供理论基础。【以下为参考文献】1ludwiga,zongx,stieberj,etal.twopacemakerchannelsfromhumanheartwithprofoundlydifferentactivationkinetics[j].embo,1999,18〔23〕:2323-2329.2seifertr,scholtena,gaussr,etal.molecularcharacterizationofaslowlygatinghumanhyperpolarizationactivatedchannelpredominantlyexpressedinthalamus,heart,andtestis[j].procnatlacadsci,1999,96:9391-9396.3stieberj,herrmanns,feils,etal.thehyperpolarizationactivatedchannelhcn4isrequiredforthegenerationofpacemakeractionpotentialsintheembryonicheart[j].procnatlacadsci,2003,100:15235-15240.4hofmannf,bielm,ernationalunionofpharmacology.li.nomenclatureandstructurefunctionrelationshipsofcyclicnucleotideregulatedchannels[j].pharmacolrev,2005,57〔4〕:455-462.5ishiitm,takanom,ohmorih,etal.determinantsofactivationkineticsinmammalianhyperpolarizationactivatedcationchannels[j].jgenphysiol2001,53(1):93-100.6wangj,chens,siegelbaums.regulationofhyperpolarizationactivatedhcnchannelgatingandcampmodulationduetointeractionsofcoohterminusandcore[j].transmembraneregions.jgenphysiol,2001,118〔2〕:237-250.7gaussr,seifertr,kauppub,etal.molecularidentificationofahyperpolarizationactivatedchannelinseaurchinsperm[j].nature,1998,393〔4〕:583-587.8bielm,schneidera,wahlc,etal.cardiachcnchannels:structure,functionandmodulation[j].trendscardiovascmed,2002,12〔2〕:206-212.9ludwiga,zongx,jeglitschm,etal.afamilyofhyperpolarizationactivatedmammaliancationchannels[j].nature,1998,393〔4〕:587-591.10santorob,liudt,yaoh,etal.identificationofageneencodingahyperpolarizationactivatedpacemakerchannelofbrain[j].cell,1998,93〔5〕:717-729.11ishiitm,takanom,xielh,etal.molecularcharacterizationofthehyperpolarizationactivatedcationchannelinrabbitheartsinoatrialnode[j].jbiolchem,1999,274〔4〕:12835-12839.12notomit,shigemotor,etal.immunohistochemicallocalizationofihchannelsubunits,hcn14,intheratbrain[j].jcompneurol,2004,471〔2〕:241-276.13ludwiga,buddet,stieberj,etal.absenceepilepsyandsinusdysrhythmiainmicelackingthepacemakerchannelhcn2[j].emboj,2003,22〔2〕:216-224.14nolanmf,malleretg,leekh,etal.thehyperpolarizationactivatedhcn1channelisimportantformotorlearningandneuronalintegrationbycerebellarpurkinjecells[j].cell,2003,115〔4〕:551-564.15schulzebahre,neua,friederichp,etal.pacemakerchanneldysfunctioninapatientwithsinusnodedisease[j].jclininvest,2003,111〔11〕,1537-1545.16uedak,nakamurak,hayashit,etal.functionalcharacterizationofatrafickingdefectivehcn4mutation,d553n,associatedwithcardiacarrhythmia[j].j