ADAM12（含去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白12）ELISA试剂盒

20222022年修订第五版 （本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断!）ADAM12（含去整合素和金属蛋白酶结构域蛋白12）ELISA试剂盒HumanADAM12(Disintegrinandmetalloproteinasedomain-containingprotein12)ELISAKit产品货号：YZ-E00028H产品规格：96T/48T使用前请仔细阅读说明书。如果有任何问题，请通过以下方式联系我们：咨询电话：400-988-2324技术邮箱：\hservice_uplc_ms@163.comQQ客服：3353657922网址：具体保质期请见试剂盒外包装标签。请在保质期内使用试剂盒。联系时请提供产品批号(见试剂盒标签)，以便我们更高效地为您服务。Copyright©2020-2021Shanghaiuplc-mstestingtechnologyCo.,LtdAllRightsReserved目录TOC\o"1-2"\h\u17919目录 215577用途 323766基本性能 322003检测原理 327476试剂盒组成及保存 417717试验所需自备物品 521750样品收集方法 519255注意事项 619465检测前准备工作: 727318操作步骤 7132结果判断 823438典型数据 824384性能 95925问题分析 1025142声明 11用途该试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆或其他相关生物液体中ADAM12活性。基本性能性能灵敏度0.094ng/ml检测范围0.156-10ng/ml特异性可检测样本中的人ADAM12，且与其它类似物无明显交叉反应重复性板内，板间变异系数均<10%检测原理本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法。将目标抗体包被于酶标板上，分别向微孔中加入标准品和样本，其中的目标抗原与包被抗体结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗体特异性的结合形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，活性与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中的活性。试剂盒组成及保存未拆封的试剂盒可在2-8℃临时中文名称规格开封后保存条件ELISA酶标板MicroELISAPlate96T：8×1248T：8×6-20℃，可存放6个月标准品Standard96T：0.3mL×6支48T：0.3mL×6支HRP酶结合物HRPConjugate96T：1瓶10mL48T：1瓶5mL2-8℃，可存放6个月样品稀释液SampleDiluent96T：1瓶6mL48T：1瓶3mL浓缩洗涤液(20×)ConcentratedWashBuffer(20×)96T/48T：1瓶30mL底物溶液ASubstrateReagentA96T/48T：1瓶6mL/3mL2-8℃底物溶液BSubstrateReagentB96T/48T：1瓶6mL/3mL2-8℃(避光)反应终止液StopSolution96T/48T：1瓶6mL/3mL2-8℃封板覆膜PlateSealer96T/48T：2张产品说明书Manual1份说明：所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。试剂体积以实际发货版说明书为准。相关试剂在分装时会比标签上标明的体积稍多一些，请在使用时量取而非直接倒出。试验所需自备物品酶标仪(450nm波长滤光片)高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL,2-20μL,20-200μL,200-1000μL37℃恒温箱双蒸水或去离子水吸水纸加样槽样品收集方法(具体处理方法参考官网：\h)血清：全血样品于室温放置1小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20分钟，取上清即可检测（收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管）。血浆：抗凝剂推荐使用EDTA-Na2，样品采集后30分钟内于2-8℃，1000×g离心15分钟，取上清即可检测（避免使用溶血，高血脂样品）。组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10分钟，取上清检测。细胞提取液：贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每106个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10分钟，取上清检测。细胞培养上清或其他生物体液：收集液体后于2-8℃，1000×g离心20分钟，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。2022022年修订第五版注意事项■试剂盒注意事项本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断。验室安全防护条例执行。板条应拆卸后放入备用铝箔袋，按照上述表格中保存条件存放。分钟预热。请勿使用其他批号或其他来源的试剂混合或替代本试剂盒中的试剂。试验中所用的EP管和吸头均为一次性使用，严禁混用。请勿使用过期的试剂。■样品注意事项收集血液的试管应为一次性无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品。样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3-6个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。浓缩。若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。检测前准备工作:提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温(18-25℃)。如果试剂盒需分多次使用，请仅取出本次实验所需的酶标板条和试剂，剩余板条和试剂需按照指定条件保存。洗涤液：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:20)。提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。标准品工作液：将已配置好的标准品上下颠倒数次，待其充分混匀（可用低速涡旋仪充分混匀，可通过低速离心去除涡旋过程中产生的气泡）。标准品活性为10,5,2.5,1.25,0.625,0.3125ng/ml。请勿重复使用上次实验的标曲、每次实验都需重新绘制标准曲线。操作步骤第一步：试剂盒室温平衡30min，然后从铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃，以备下次使用。第二步：设置标准品孔、样本孔和空白孔(建议所有的待检样本在检测中设立复孔)。第三步：标准品孔分别加不同活性的标准品50μL，样本孔中分别加入待测样本50μL；空白孔不加。提示：实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的“温育”时间，从而影响到测量值的准确性及重复性，加样时间宜控制在10分钟内。第四步：除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入酶结合物工作液（HRP）100μL，酶标板加上覆膜，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。第五步：甩尽孔内液体，在洁净的吸水纸上拍干。每孔加洗涤液350μL，浸泡1分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，拍干。重复此洗板步骤3次。提示：此处洗板步骤可使用洗板机(参数设置：每孔加入洗涤液350μL，振板5秒，吸液0.5秒)。洗板完成后请立即进行下步操作，不要让微孔板干燥。第六步：每孔加入底物A、B各50μL，酶标板加上覆膜，37℃避光孵育15分钟左右。提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时(前4个显色孔出现明显蓝色梯度)，即可终止。提前15分钟打开酶标仪预热。第七步：每孔加终止液50μL，终止反应。提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。第八步：立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。20222022年修订第五版结果判断计算标准品和样本复孔减去空白孔的OD值作为校正值。以活性为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标轴上拟合四参数逻辑函数的标准曲线，操作详情请参阅“上海液质”官网/微信公众号内技术文章(作图时去掉空白组的值)。若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测并在计算样本活性时乘以相应的稀释倍数。典型数据以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。标曲OD校正OD标曲S62.4042.318S51.5791.493S40.9000.812S30.4920.406S20.2600.174S10.1760.090空白0.0482022022年修订第五版性能■精密度板内精密度：低，中，高活性样本分别在1块板子上检测20板间精密度：低，中，高活性样本分别在3块板子上检测20批内变异系数批间变异系数样本123123数量202020202020平均值0.501.204.300.501.304.50标准差0.040.060.150.030.060.25变异系数(%)8.005.003.496.004.625.56■回收率分别往不同样本中添加已知活性的人ADAM12，做回收实验，得出回收率范围和平均回收率。样本类型回收率范围(%)平均回收率(%)血清(n=8)91-10396血浆(EDTA)(n=8)97-110102细胞培养基(n=8)87-9992■线性将添加有人ADAM12的样本分别稀释2倍，4倍，8倍，16倍做回收实验，得出回收率范围及平均回收率。血清(n=5)血浆(EDTA)(n=5)细胞培养基(n=5)1:2回收率范围(%)94-11293-10691-103平均回收率(%)102100981:4回收率范围(%)99-11784-9996-110平均回收率(%)107901021:8回收率范围(%)99-11687-10299-114平均回收率(%)106941051:16回收率范围(%)99-10987-10293-105平均回收率(%)1049399问题分析若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保存实验数据，保留所用板条及未使用试剂，然后联系我公司技术支持为您解决问题。同时您也可以参考以下资料：问题描述可能原因相应对策标准曲线梯度差吸液或加液不准检查移液器及吸头标准品稀释不正确溶解标准品时稍微旋转瓶身，轻轻混匀使粉末完全溶解洗涤不完全保证洗涤时间和洗涤次数及每孔的加液量显色很弱或无色孵育时间太短保证充足的孵育时间实验温度不正确使用推荐的实验温度试剂体积不够或漏加检查吸液及加液过程，保证所有试剂按顺序足量添加稀释不正确酶标记物失活或底物失效混合酶结合物和底物，通过迅速显色来检查判断读数数值低酶标仪设置不正确在酶标仪上检查波长及