DNA分子标记在中药鉴定中的应用

DNA分子标记技术在中药鉴定中的应用目录1、概论2、DNA分子标记技术3、DNA分子标记技术的应用4、讨论1、概论1.1概念

分子标记或称遗传标记，本质上是指生物个体或居群间的基因组由于缺失、插入、易位、倒置、重排或长短与排列不一的重复序列等机制而产生的多态性DNA片段。1.2原理在漫长的进化过程中,生物在属间、种间、品种间,甚至个体间存在着基因组水平上的广泛变异,包括突变、缺失、插入等方式,这些变异导致了基因组DNA层次多样的多态性,通过考查这种多态性来分析生物的亲缘关系。1.4进展1953年Watson和Crick提出DNA分子结构双螺

旋模型，宣布了分子遗传学时代的到来。1974年，Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型

的腺病毒DNA突变体时，利用限制性内切酶

酶解后得到的DNA片段的差异，首创了DNA

分子标记。1980年Bostein和White利用RFLP作为遗传标

记,开创了直接应用DNA多态性发展遗传标记

的新阶段。1.3分类

根据目的基因所在细胞器的不同可分为核DNA标记、线粒体DNA(mtDNA)标记和叶绿体DNA(cpDNA)标记。mtDNA标记主要用于动物的起源进化、亲缘关系、遗传变异、物种鉴别等研究

核DNA和cpDNA分子标记主要存在于高等植物中，尤其以核DNA分子标记的应用最多。根据其所采用的技术原理不同分为三类基于电泳技术和southern分子杂交技术为核心的DNA标记技术。

如：

RFLP、DNA指纹技术基于电泳技术和PCR技术为核心的DNA

标记技术。

如：RAPD、SSR、AFLP基于DNA序列分析为核心的DNA标记技

术。

如：ITS序列分析技术1.4应用于中药鉴定的优越性传统中草药鉴定方法：基源鉴定、显微鉴定、理化鉴定、生物鉴定。鉴定的特征几乎都是遗传的表现形，不仅受遗传因素的影响，而且与生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等有着密切的关系。有很大的变异性和随意性。DNA分子标记

大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异，表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。只需要极少的样品，尤其适用于贵重药材，濒危动物和有毒伪品的研究。2、DNA分子标记技术2.1限制性片段长度多态性（RFLP）原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生。那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，就可以得到长短、数量、种类不同的限制性DNA片段。通过电泳和Southern杂交转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，选用一定的DNA标记探针与之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的DNA限制性片段多态性图谱。

GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAGCATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTCEcoRI酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性RFLP是由DNA一级水平的变异造成的。然而，如果DNA变异的位点不在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内切酶的种类来弥补，实际工作中一般用6~8种酶来筛选多态性。不同个体DNA的提取限制性内切酶酶切DNA凝胶电泳分开DNA片段DNA片段转移到滤膜放射性标记探针杂交显示特定的DNA片段结果分析基本步骤RFLP

既可以检测基因组DNA,也可以检测rDNA

或叶绿体DNA,结果较为稳定,标记为共显性表达,可以区分杂合、纯合基因型。但在应用中,该方法含Southern

印迹等繁琐的试验步骤,周期长，成本高，多态性检出效率低(只能检测探针长度内切酶识别位点上的变异),在实际应用中受到一定程度的限制。特点：2.2随机扩增片段长度多态性（RAPD）是一种以PCR技术为基础，可对整个未知序列基因组进行多态性分析的DNA分子标记技术。原理：

利用一个随机引物(一般为10个碱基)通过PCR反应非定点地扩增DNA片段，然后扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺出泳分离后配合溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录RAPD指纹，进行DNA多态性分析。RAPD所用的一系列随机引物其序列各不相同，但对于每个特定的引物来讲，它同目标基因组的DNA序列都有其特定的结合位点、扩增DNA特定的区域片断，如果基因组的这些区域发生DNA片断或碱基的插入、缺失等突变，就可能导致这些特定结合位点、扩增片断发生相应的变化，而使RAPD扩增产物在电泳图谱中DNA带数增加、减少或片断长度发生相应变化，从而可以检测出基因组DNA在这些区域的多态性。WMWM原理图：电泳图：DNA提取引物的制备PCR扩增DNA凝胶电泳分离扩增DNA片段染色显示相应区内的DNA片段结果分析基本步骤特点：无种属特异性，适合自动化分析；无需制备探针，杂交等程序，成本低；但其稳定性和重复性差，是一种显性标记，不能识别杂合子位点。显性与共显性：2.3扩增片段长度多态性（AFLP）

是建立在基因组限制性片段基础上的PCR扩增。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段，使用特定的双链接头与酶切得到的DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相配对的限制性片段才可被扩增。扩增产物经过放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA条带的有无来检测多态性。DNA提取两种限制性内切酶酶切DNA寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析基本步骤AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，是一种新的有效的DNA指纹技术。但是AFLP技术有专利保护，试剂盒价格昂贵；另外，操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格等，限制了其在实践中的应用。2.4简单重复序列（SSR）又称微卫星DNA，指以少数几个核苷酸(1～6个)为单位多次串联重复的DNA序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性，这种多态性的信息量是比较丰富的。微卫星的突变率在不同物种、在同一物种的不同位点和同一位点的不同等位基因间存在很大差异。但尽管它们分布于基因组的位置不同，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因而可以根据这两端的序列设计一对特意引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。原理：DNA酶切收集酶切片段连接载体合成末端标记的SSR探针筛选含SSR的阳性克隆用于测序根据测序结果设计引物进行PCR扩增基本步骤特点：

变异丰富，广泛分布于整个基因；为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；所需DNA量少，对DNA质量要求不高；实验重复性好，结果可靠。

需要针对每个染色体座位的微卫星序列,发现其两端的单拷贝序列以设计引物,因而需一系列建立基因组文库、克隆识别与筛选、测序等过程,要克隆足够数量的SSR,并对其进行测序和设计引物,对于初学者来说难度较大，直接利用SSR对药用植物进行研究的不多。ISSR是在微卫星基础上发展起来的分子标记技术。用锚定的微卫星DNA为引物，即在SSR序列的3‘端或5’端加上2-4个随机核苷酸，在PCR反应中，锚定引物可引起特定位点退火，导致与锚定引物互补的间隔不太大的重复序列间DNA片段进行PCR扩增。所扩增的ISSR区域的多个条带通过聚丙烯酞胺凝胶电泳得以分辨，扩增谱带多为显性表现。内部简单重复序列（ISSR）与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不像SSR标记一样具有较强的种特异性;与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记。特点：2.5DNA序列分析技术DNA序列的变化是保守和变异共存的,不同基因在进化过程中变异率各异,一些基因在种间存在适度的差异,直接分析这些基因的序列能起到鉴别的作用。

首先,需要对考查对象亲缘关系较近的种、目的基因序列进行分析,建立数据库;然后，测定待试样品序列,即可在数据库中进行比对鉴别。目前,用于中草药鉴别的基因包括植物叶绿体基因组的rbcL,matK,rpoC等、植物核基因组的rRNA,ITS等,这些基因进化速率都较快,但一些区段保守性又较强。IST测序分析技术ITS(internaltranscribedspacer)是被5.8srDNA所分隔的ITS1和ITS2两个片段所组成,其转录产物在rRNA加工过程中被切掉,它在rRNA成熟过程中具有重要作用。ITS是高度重复的串联序列单位,具位点内或位点间的协同进化3、DNA分子标记在中药鉴定中的应用3.1遗传多样性和种植资源研究陈永久等用RAPD标记分析了冬虫夏草的遗传分化，从分子水平刻画虫草遗传进化、亲缘关系与地理分布的关系，为虫草资源利用与保护提供了依据。彭云滔用ISSR标记研究了野生罗汉果的遗传多样性，结果表明野生罗汉果不同居群的遗传多样性水平差异较大，居群间的遗传距离与地理距离相关性不明显，从而为保护野生罗汉果和拓宽栽培罗汉果遗传资源提供了依据。3.2物种进化与亲缘关系研究通过RAPD、RFLP、AFLP标记及基因测序技术等分子标记的研究，可从DNA水平有效揭示药用植物物种自然居群、品种中遗传结构的基因流动与演变等系统发育与亲缘关系的真实本质，真实地阐明生物的遗传背景差异、物种演化与亲缘关系，为药用动植物的开发利用提供真实的生物学依据。丁小余等在对枫斗类石斛利用rDNA-ITS序列分析,建立了数据库,可以对枫斗类进行鉴别。张铭等利用RAPD对石斛属进行亲缘关系分析,构建了属内聚类树状图,并设计出了铁皮石斛的特异性鉴定引物。3.3中药真伪、近缘药材及代用品鉴别传统中药鉴别一般根据药材形态、组织、粉末特征、理化性质等进行鉴别,分子标记则直接根据药材的遗传本质DNA的多态特征,找出药材特有的DNA片段(标记)进行鉴别,因而提高了准确性。Shaw等用RAPD方法对人参、西洋参、三七及伪品进行鉴别,据扩增产物,能有效鉴别三种药材。

Fushimi等用18S-rRNA基因测定鉴别川芎。3.4药材的野生类型与栽培品种的研究

野生品和栽培品来自同一个物种,植物形态、药材性状、化学成分、生物活性等往往无明显差异，需要寻找一种有效的方法进行鉴别，RAPD等分子标记这种鉴定提供了良好的应用前景。马小军等利用RAPD、AFLP标记对人参、圆参与山参品种的研究中发现,RAPD、AFLP标记可以用于野生与栽培品种的鉴别，其长脖类型更接近野生人参，包含野生人参的某些性状。3.5道地药材的研究道地药材与非道地药材物种来源一致或十分相近，在形态、生药性状及化学成分等特征上具有高度相似性，因而道地药材的鉴别往往不容易。借助分子遗传标记技术,对道地药材形成的本质从DNA分子水平上进行阐述,可快速、准确地鉴别道地药材。

陈林娇等用RAPD技术对狭基线纹香条叶居群的扩增产物研究发现，广东瑶坪产的比广州产者多一1263bp带，为道地药材的研究提供