生化课件第二十一章 DNA重组及重组DNA技术

DNA重组和重组DNA技术DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章刘向华南京医科大学生化与分子生物学系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiologyDNA重组和重组DNA技术第二十一章刘向华起初上帝创造天地，地是空虚混沌，渊面黑暗，上帝的灵运行在水面上，上帝说：“要有光，就有了光。”

------《旧约全书·创世纪》

萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光”，烟草就发光了。起初上帝创造天地，萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光”第二节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique第二节

重组DNA技术DNARecombinati本节主要内容

重组DNA技术相关概念重组DNA技术基本原理及操作步骤

PCR、核酸杂交DNA克隆工具酶目的基因基因载体本节主要内容重组DNA技术相关概念DNA克隆重组DNA技术应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力的重组DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称分子克隆或重组DNA技术

。

重组DNA技术基因克隆的主要操作步骤基因克隆的主要操作步骤粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分离)切(切割)粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分离)切(切割酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠大量生长提取大量质粒酶切鉴定大量生长提取大量质粒酶切鉴定基因克隆的基本步骤分：分离目的基因和载体DNA。切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生

匹配的末端。接：连接酶将目的基因装入载体。转：转入宿主细胞。筛：筛选具有重组DNA分子的阳性克隆。基因克隆的基本步骤分：分离目的基因和载体DNA。

限制性核酸内切酶

连接酶

聚合酶(Taq酶、末端转移酶)

多聚核苷酸激酶

碱性磷酸酶合成双链cDNA分子5ˊ羟基末端磷酸化

切除末端磷酸基一、工具酶限制性核酸内切酶合成双链cDNA分子5ˊ羟基末端磷酸化切1.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease,RE）

能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA1.限制性核酸内切酶能识别DNA的特异序列第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶分类

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名HindⅢⅡ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

GGATCCCCTAGG舟行水面水行舟Asegmentofdouble-strandedDNAinwhichthenucleotidesequenceofonestrandreadsinreverseordertothatofthecomplementarystrand.Inthesamestrandcontainingcomplementarynucleotidesequencewithoppositepolarity.Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'

II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为磷酸基，3’端为羟基。在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blunt

在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5'端切割产生5'端突出的粘性末端，如EcoRⅠ：

从3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstⅠ：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…G5'

AATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAA5'

G…5'5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCA3'G…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…G3'ACGTC…

5'

在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5'端切割产生5限制性内切酶作用过程点击播放限制性内切酶作用过程点击播放

1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一链序列)中不属于完全回文结构的是

A．AGAATTCTB.TGAATTCAC．GGAATTCCD．CGTTAAGCE．AGATATCT1．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5’…AGCTG▼AATTC…3’产生

2．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5’…CTGCA▼GAGTC…3’产生

3．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5’…AGGTT▼AACAG…3’产生5'端突出的粘性末端3'端突出的粘性末端平末端1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一链序列)中不属于完全常用的载体按来源分为：质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus)按得到的产物，载体可分为：克隆载体（cloningvector）主要用于基因片断的扩增表达载体（expressionvector）用于获得目的基因编码的蛋白质（二）载体的分类常用的载体按来源分为：按得到的产物，载体可分为：（二）载体的载体的选择标准复制起始点，能自主复制；具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。载体的选择标准复制起始点，能自主复制；质粒（plasmid）

质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组DNA操作的载体。质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体目录氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点ori目录氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点oriλ噬菌体

λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成。λ噬菌体（lambdabacteriophage）DNA，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。

SalⅠBamHⅠEcoRⅠSalⅠBamHⅠEcoRⅠλ噬菌体λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λlacZ’基因:编码-半乳糖苷酶的-片段

M13噬菌体载体—pUC18和pUC19载体多克隆位点rlacZ’基因:编码-半乳M13噬菌体载体—pUC18酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他酵母人工染色体其他三、重组DNA技术基本原理及操作步骤基本原理目的基因的获取重组DNA导入受体菌

外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

三、重组DNA技术基本原理及操作步骤基本原理目的基因的获取重

以质粒为载体的DNA

克隆过程目录以目录（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（见第20章）

（一）目的基因的获取1.化学合成法*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等。*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库P441(genomicDNAlibrary)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因

逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库的特点◆代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。◆mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。

cDNA文库的特点体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，合适的缓冲液系统(Mg2+)和DNA变性、复性(退火)及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增.聚合酶链式反应P407

（PolymeraseChainReaction,PCR）

体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。聚合酶5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR技术的工作原理目录DNA变性复性延伸5Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555

555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录Cycle35555555555DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cyclen理论上可达2n个拷贝原料（pg）

产物(μg)体外高效、快速、特异

地扩增DNA片段g→mg→ug→ng→pgDNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cycl（三）外源基因与载体的连接

粘性末端连接平端连接（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接粘性末端连接（二）克隆载体粘性末端连接

外源DNA片段与载体用同一种限制性内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶作用下，形成重组DNA分子。DNA连接酶“缝合”基因的“分子针线”。粘性末端连接外源DNA片段与载体用同一种限制性内DNA连接酶的作用过程点击播放DNA连接酶的作用过程点击播放BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶

T4DNA连接酶

15ºC重组体载体自连目的基因自连2.平端连接目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。如将poly（dA）加到双链DNA片段3’羟基上，而将poly（dT）加到质粒载体3’羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。3.同聚物加尾连接受体菌条件

安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式

转化(transformation)

将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转化.转染(transfection)

将外源DNA直接导入真核细胞.感染(infection)

以噬菌体和真核病毒作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为感染（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件安全宿主菌CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变感受态细胞的制备基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在低温条件下，用CaCl2（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”（competentcell）。CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变感受态细胞的连接目的基因基因载体连接酶转化宿主细胞转化后菌落或转染噬菌斑：（五）重组体的筛选1.载体遗传标记筛选抗药性标记选择标志补救(markerrescue)2.序列特异性筛选法（1）RE酶切法(2)PCR法（3）核酸分子杂交3.亲和筛选法如免疫化学方法及酶免检测分析等连接目的基因转化宿主细胞转化后菌落或转染噬菌斑：（五）重组体1）抗药性标志的选择(插入失活法)pBR322AmprTetr插入外源基因片段标志基因Tetr失活Amp平板Tet平板转化区别非转化菌与转化菌？双抗生素对照筛选重组子能在含有Ap的培养板上生长但不能在含有Tet的培养板上生长1）抗药性标志的选择(插入失活法)pBR322AmprTet2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段ß-半乳糖苷酶活性lacZ’缺陷型的大肠杆菌Ampuc18（LacZ’基因N端序列）2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段ßX-galX-galLacZ蓝色化合物X-galX-galLacZ蓝色化合物a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段（LacZ’基因失活）LacZ’基因C端序列LacZ酶w片段w片段X-galα互补：单独存在的α及

ω片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。如果插入的外源基因是在lacZ’基因内，就会影响lacZ’的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。白色菌落a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段LacZ’基因C目录-互补：通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组子与非重组子载体β-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。当外源基因插入后，LacZ’基因被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。目录-互补：通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组子与非重组子

指用探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。核酸分子杂交的基本原理变性（denaturation）复性（renaturation）预杂交（prehybridization）杂交（hybridization）

探针：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。

3)核酸分子杂交（molecularhybridization）指用探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补菌落原位杂交菌落原位杂交鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录3.亲和筛选法

鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录3.亲和筛选法重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因

切限制酶切割目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体菌

筛筛选重组体

重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基①分______分离出目的基因及载体DNA。②切______利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体。③接______利用连接酶将目的基因与载体DNA共价连接形成重组DNA分子。④转______重组DNA分子转化受体细胞。⑤筛______筛选和鉴定含有重组DNA分子的受体细胞（阳性克隆）。重组DNA的基本过程①分______分离出目的基因及载体DNA。重组DNA的基本重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源大量生长克隆载体：拷贝大量目的基因表达载体：获得大量目的蛋白克隆基因的表达表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化大量生长克隆载体：拷贝大量目的基因克隆基因的表达表达体系的建基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤（一）疾病基因的发现与克隆第三节、重组技术与医学的关系（二）生物制药（三）基因诊断（四）基因治疗（一）疾病基因的发现与克隆第三节、重组技术与医学的关系（二）

神话成现实

——绿叶变为鲜花神话成现实基因武器

20克超级基因可使60亿人死于非命

一旦基因武器运用于战争，将使未来战争发生巨大变化。基因武器使用者再也不用兴师动众，而只需要在临战前将经过基因工程培养的病菌投入他国，使敌方人畜在短时间患上一种无法治疗的疾病，从而丧失战斗能力。

基因武器可根据需要任意重组基因，可在一些生物中移入损伤人类智力的基因。当某一特定族群的人沾染上这种带有损伤智力基因的病菌时，就会丧失正常智力。另一方面，基因作为战术武器使用时，将使对方防不胜防，束手无策。基因武器的特有功能之一，就是从武器的使用到发生作用都没有明显的征候，即使发现了也难以破解遗传密码和实施控制。基因武器一旦基因武器运用于战争，将使未来战争发基因工程生产人的胰岛素的简要过程：基因工程与医学的关系普通大肠杆菌人的细胞提取人的胰岛素基因与运载体DNA拼接导入大肠杆菌细胞(含人的胰岛素基因)大肠杆菌(产生人的胰岛素)上述过程的关键要解决是什么？？基因工程生产人的胰岛素的简要过程：基因工程与医学的关系普通大基因工程生产人的胰岛素：关键步骤一：胰岛素基因从人的细胞内提取出来关键步骤二：胰岛素基因与运载体DNA连接关键步骤三：人的基因导入受体(大肠杆菌)细胞限制性内切酶DNA连接酶基因工程与医学的关系基因工程生产人的胰岛素：关键步胰岛素基因从人的细胞内提取出来大鼠胰岛素原cDNA的表达和分泌 目录大鼠胰岛素原cDNA目录生化课件第二十一章DNA重组及重组DNA技术“非典”可能是针对中国的基因武器

俄罗斯医学科学院院士卡雷辛柯夫在非典疫情大规模爆发初期就断言，非典型肺炎是一种生物武器，极可能是从实验室里流出来的。他的依据是：非典是麻疹病毒与流行性腮腺炎病毒的混合体，而这种混合病毒只有在实验室里才可能培育出来，在自然环境中根本不可能发生。

非典来自生化武器这一观点提出来后，美国政府还曾两次否定非典是美国的生化武器。“非典”可能是针对中国的基因武器俄罗斯医基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。取患者骨髓分离干细胞病毒正常基因并入正常基因的干细胞注入患者体内基因治疗(GeneTherapy)基因治疗是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾基因诊断(GeneticDiagnosis):

利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法.基因诊断(GeneticDiagnosis):DNAcloningPalindromeTargetgeneCloningvectorPlasmidRestrictionendonucleaseMolecularhybridizationPCRKeywordsGenomicDNAlibrarycDNAlibraryDenaturationAnnealingExtensionExpressionvectorSummaryDNAcloningKeywordsGenomicDN1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。2.何谓目的基因，有哪些来源？3.解释基因载体，哪些DNA可作为基因载体？(质粒)4.基本概念

DNA重组技术,限制性核酸内切酶,回文结构,目的基因,基因组DNA文库,cDNA文库,PCR,核酸分子杂交第二十一章DNA重组及重组DNA技术1.何谓基因重组技术，简述其基本过程。第二十一章DNA实验结果实验结果Summary1.RecombinantDNAtechnologybuildsonafewbasictechniques:isolationofDNA,cleavageofDNAatparticularsequences,ligationofDNAfragments,introductionofDNAintohostcells,replicationofDNA,andidentificationofhostcellsthatcontainrecombinants.Summary1.RecombinantDNAtechSummary2.AgenomiclibraryrepresentsalltheDNAofanorganism;AcDNAlibrarycontainsDNAthatiscomplementarytothemRNAfromaparticularcellortissue.3.FragmentsofDNAgeneratedbyrestrictionendonucleasesareincorporatedintovectors,whichcanbeplasmids,bacteriophages,viruses,orartificialchromosomes.Summary2.AgenomiclibraryreSummary4.Cellscontainingthedesiredrecombinantareidentifiedbyscreening.5.SpecificDNAsequencescanbeamplifiedbythepolymerasechainreaction(PCR).Summary5.SpecificDNAsequenc

DNA重组和重组DNA技术DNARecombinationandRecombinantDNAtechnology第二十一章刘向华南京医科大学生化与分子生物学系NanjingmedicaluniversityDepartmentofbiochemistryandmolecularbiologyDNA重组和重组DNA技术第二十一章刘向华起初上帝创造天地，地是空虚混沌，渊面黑暗，上帝的灵运行在水面上，上帝说：“要有光，就有了光。”

------《旧约全书·创世纪》

萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光”，烟草就发光了。起初上帝创造天地，萤火虫的发光基因对烟草说：“要有光”第二节

重组DNA技术DNARecombinationTechnique第二节

重组DNA技术DNARecombinati本节主要内容

重组DNA技术相关概念重组DNA技术基本原理及操作步骤

PCR、核酸杂交DNA克隆工具酶目的基因基因载体本节主要内容重组DNA技术相关概念DNA克隆重组DNA技术应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力的重组DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称分子克隆或重组DNA技术

。

重组DNA技术基因克隆的主要操作步骤基因克隆的主要操作步骤粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分离)切(切割)粘性末端质粒目的基因粘性末端匹配的粘性末端分(分离)切(切割酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子酶切后的目的基因片段接(连接)连接后的重组质粒DNA分子重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!重组质粒目的基因大肠杆菌转(转化)染色体真好玩!筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠杆菌大肠杆菌筛(筛选)分解抗生素的酶含抗生素的培养基还活着!玩完啦!大肠大量生长提取大量质粒酶切鉴定大量生长提取大量质粒酶切鉴定基因克隆的基本步骤分：分离目的基因和载体DNA。切：用合适的限制性内切酶切割上述两者，产生

匹配的末端。接：连接酶将目的基因装入载体。转：转入宿主细胞。筛：筛选具有重组DNA分子的阳性克隆。基因克隆的基本步骤分：分离目的基因和载体DNA。

限制性核酸内切酶

连接酶

聚合酶(Taq酶、末端转移酶)

多聚核苷酸激酶

碱性磷酸酶合成双链cDNA分子5ˊ羟基末端磷酸化

切除末端磷酸基一、工具酶限制性核酸内切酶合成双链cDNA分子5ˊ羟基末端磷酸化切1.限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease,RE）

能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。主要来源于原核生物由于能限制外源DNA的“入侵”而得名。与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA1.限制性核酸内切酶能识别DNA的特异序列第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名Hin

dⅢ

属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶分类

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；命名HindⅢⅡ类酶识别序列特点——

回文结构(palindrome)

GGATCCCCTAGG舟行水面水行舟Asegmentofdouble-strandedDNAinwhichthenucleotidesequenceofonestrandreadsinreverseordertothatofthecomplementarystrand.Inthesamestrandcontainingcomplementarynucleotidesequencewithoppositepolarity.Ⅱ类酶识别序列特点——回文结构(palindrome)在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（bluntend），如HpaI：5'…GTT▼AAC…3'HpaI5'…GTTAAC…3'3'…CAA▲TTG…5'3'…CAATTG…5'

II型酶切割双链DNA产生3种不同的切口切割：以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生的DNA片段5’端为磷酸基，3’端为羟基。在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blunt

在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5'端切割产生5'端突出的粘性末端，如EcoRⅠ：

从3'端切割产生3'端突出的粘性末端。如PstⅠ：5'…G▼AATTC…3'EcoRI5'…G5'

AATTC…3'3'…CTTAA▲G…5'3'…CTTAA5'

G…5'5'…CTGCA▼G…3'PstI5'…CTGCA3'G…3'3'…G▲ACGTC…5'3'…G3'ACGTC…

5'

在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从5'端切割产生5限制性内切酶作用过程点击播放限制性内切酶作用过程点击播放

1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一链序列)中不属于完全回文结构的是

A．AGAATTCTB.TGAATTCAC．GGAATTCCD．CGTTAAGCE．AGATATCT1．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5’…AGCTG▼AATTC…3’产生

2．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5’…CTGCA▼GAGTC…3’产生

3．某识别6核苷酸序列的限制性内切酶切割5’…AGGTT▼AACAG…3’产生5'端突出的粘性末端3'端突出的粘性末端平末端1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一链序列)中不属于完全常用的载体按来源分为：质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus)按得到的产物，载体可分为：克隆载体（cloningvector）主要用于基因片断的扩增表达载体（expressionvector）用于获得目的基因编码的蛋白质（二）载体的分类常用的载体按来源分为：按得到的产物，载体可分为：（二）载体的载体的选择标准复制起始点，能自主复制；具有一个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。载体的选择标准复制起始点，能自主复制；质粒（plasmid）

质粒是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，能在宿主细胞独立自主地进行复制，并在细胞分裂时保持恒定地传给子代细胞。质粒带有某些遗传信息，会赋予宿主细胞新的遗传性状。因为质粒DNA有自我复制功能及携带遗传信息等特性，可作为重组DNA操作的载体。质粒（plasmid）质粒是存在于细菌染色体目录氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点ori目录氨苄青霉素抗性基因四环素抗性基因多克隆位点oriλ噬菌体

λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成。λ噬菌体（lambdabacteriophage）DNA，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。

SalⅠBamHⅠEcoRⅠSalⅠBamHⅠEcoRⅠλ噬菌体λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λlacZ’基因:编码-半乳糖苷酶的-片段

M13噬菌体载体—pUC18和pUC19载体多克隆位点rlacZ’基因:编码-半乳M13噬菌体载体—pUC18酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他酵母人工染色体其他三、重组DNA技术基本原理及操作步骤基本原理目的基因的获取重组DNA导入受体菌

外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

三、重组DNA技术基本原理及操作步骤基本原理目的基因的获取重

以质粒为载体的DNA

克隆过程目录以目录（一）目的基因的获取1.化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)

（见第20章）

（一）目的基因的获取1.化学合成法*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列合成的基因有：人生长激素释放抑制因子、胰岛素原、脑啡肽、干扰素基因等。*化学合成法获取目的基因由已知氨基酸序列推测可能的DNA序组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌限制性内切酶受体菌基因组DNA文库P441(genomicDNAlibrary)组织或细胞染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分子含重组分mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*从cDNA文库获取目的基因

逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库的特点◆代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。◆mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。

cDNA文库的特点体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，dNTPs,DNA聚合酶，合适的缓冲液系统(Mg2+)和DNA变性、复性(退火)及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增.聚合酶链式反应P407

（PolymeraseChainReaction,PCR）

体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。聚合酶5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555PCR技术的工作原理目录DNA变性复性延伸5Primer15Primer2Cycle2CycCycle3555555

555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录Cycle35555555555DNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cyclen理论上可达2n个拷贝原料（pg）

产物(μg)体外高效、快速、特异

地扩增DNA片段g→mg→ug→ng→pgDNA片段Cycle1Cycle2Cycle3Cycl（三）外源基因与载体的连接

粘性末端连接平端连接（二）克隆载体的选择和构建（三）外源基因与载体的连接粘性末端连接（二）克隆载体粘性末端连接

外源DNA片段与载体用同一种限制性内切酶切割，获得相同的粘性末端，相互互补配对，在DNA连接酶作用下，形成重组DNA分子。DNA连接酶“缝合”基因的“分子针线”。粘性末端连接外源DNA片段与载体用同一种限制性内DNA连接酶的作用过程点击播放DNA连接酶的作用过程点击播放BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接BamHⅠ切割反应GGATCCT4DNA连接酶GATC不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg2.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶

T4DNA连接酶

15ºC重组体载体自连目的基因自连2.平端连接目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶3.同聚物加尾连接在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。如将poly（dA）加到双链DNA片段3’羟基上，而将poly（dT）加到质粒载体3’羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。3.同聚物加尾连接受体菌条件

安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式

转化(transformation)

将质粒或以它为载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为转化.转染(transfection)

将外源DNA直接导入真核细胞.感染(infection)

以噬菌体和真核病毒作载体构建的重组分子导入受体细胞的过程称为感染（四）重组DNA导入受体菌受体菌条件安全宿主菌CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变感受态细胞的制备基因片段（特别是纯化的DNA）很难直接导入受体细胞，通常将受体细胞预先加以处理，如在低温条件下，用CaCl2（冰浴）处理大肠杆菌，可以大大提高质粒的转化效率。这种经过预处理、容易导入外源核酸分子的受体细胞被称作“感受态细胞”（competentcell）。CaCl2诱导转化特殊处理受体细胞细胞膜特性改变感受态细胞的连接目的基因基因载体连接酶转化宿主细胞转化后菌落或转染噬菌斑：（五）重组体的筛选1.载体遗传标记筛选抗药性标记选择标志补救(markerrescue)2.序列特异性筛选法（1）RE酶切法(2)PCR法（3）核酸分子杂交3.亲和筛选法如免疫化学方法及酶免检测分析等连接目的基因转化宿主细胞转化后菌落或转染噬菌斑：（五）重组体1）抗药性标志的选择(插入失活法)pBR322AmprTetr插入外源基因片段标志基因Tetr失活Amp平板Tet平板转化区别非转化菌与转化菌？双抗生素对照筛选重组子能在含有Ap的培养板上生长但不能在含有Tet的培养板上生长1）抗药性标志的选择(插入失活法)pBR322AmprTet2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段ß-半乳糖苷酶活性lacZ’缺陷型的大肠杆菌Ampuc18（LacZ’基因N端序列）2）标志补救（ß-半乳糖苷酶法）N2Ha片段COOHw片段ßX-galX-galLacZ蓝色化合物X-galX-galLacZ蓝色化合物a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段（LacZ’基因失活）LacZ’基因C端序列LacZ酶w片段w片段X-galα互补：单独存在的α及

ω片段都没有半乳糖苷酶的活性，只有宿主细胞与克隆载体同时表达两个片段时，宿主细胞内才有半乳糖苷酶活性，使特异性作用物（X-gal）变为蓝色化合物。如果插入的外源基因是在lacZ’基因内，就会影响lacZ’的表达，利用lac-E.coli为转染或感染细胞，在含X-gal的培养基上生长时会出现白色菌落；若无外源基因插入，则出现蓝色菌落。白色菌落a片段LacZ’基因N端序列插入外源片段LacZ’基因C目录-互补：通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组子与非重组子载体β-半乳糖苷酶能分解X-gal，形成蓝色菌落。当外源基因插入后，LacZ’基因被破坏，不能合成完整的β-半乳糖苷酶，因此不能分解底物X-gal，菌落成白色。目录-互补：通过蓝白斑筛选可以筛选、鉴定重组子与非重组子

指用探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。核酸分子杂交的基本原理变性（denaturation）复性（renaturation）预杂交（prehybridization）杂交（hybridization）

探针：带有可检测标记的已知序列的DNA或RNA片段。

3)核酸分子杂交（molecularhybridization）指用探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补菌落原位杂交菌落原位杂交鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录3.亲和筛选法

鸡的β肌球蛋白的克隆和检出目录3.亲和筛选法重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因

切限制酶切割目的基因与载体接拼接重组体

转转入受体菌

筛筛选重组体

重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基①分______分离出目的基因及载体DNA。②切______利用限制性核酸内切酶分别切割目的基因和载体。③接______利用连接酶将目的基因与载体DNA共价连接形成重组DNA分子。④转______重组DNA分子转化受体细胞。⑤筛______筛选和鉴定含有重组DNA分子的受体细胞（阳性克隆）。重组DNA的基本过程①分______分离出目的基因及载体DNA。重组DNA的基本重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录重组DNA技术操作的主要步骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源大量生长克隆载体：拷贝大量目的基因表达载体：获得大量目的蛋白克隆基因的表达表达体系的建立表达载体的构建受体细胞的建立表达产物的分离纯化大量生长克隆载体：拷贝大量目的基因克隆基因的表达表达体系的建基因操作的基本步骤基因操作的基本步骤（一）疾病基因的发现与克隆第三节、重组技术与医学的关系（二）生物制药（三）基因诊断（四）基因治疗（一）疾病基因的发现与克隆第三节、重组技术与医学的关系（二）

神话成现实

——绿叶变为鲜花神话成现实基因武器

20克超级基因可使60亿人死于非命

一旦基因武器运用于战争，将使未来战争发生巨大变化。基因武器使用者再也不用兴师动众，而只需要在临战前将经过基因工程培养的病菌投入他国，使敌方人畜在短时间患上一种