X3-1-1-DNA重组技术的基本工具课件

1专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具1专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具1基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体2角似鹿鼻似狮目似虎唇似牛爪似鹰髭似马鳞似鱼身似蛇角似鹿3设想一

能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？设想一能否培养出具有抗虫4蓝色玫瑰蓝色玫瑰5能生产胰岛素的大肠杆菌能生产胰岛素的大肠杆菌6转基因鼠转基因鼠7能发荧光的转基因猪能发荧光的转基因猪89是指按照人们的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫DNA重组技术或基因拼接技术。什么叫基因工程？生长激素、胰岛素9是指按照人们的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转910基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新的生物类型和生物产品（或基因产物）剪切→拼接→导入→表达实质（原理）基因重组对基因工程概念的理解一种定向改造生物的新技术10基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人10第1节第1节11121.1DNA重组技术的基本工具121.1DNA重组技术的基本工具1213基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)13基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云1314关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键步骤二：抗虫基因与载体DNA连接。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。基因的分子手术刀——限制性内切酶。

基因的分子缝合针——DNA连接酶。

基因的分子运输车——载体。如何解决？抗虫棉培育14关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆基因的分子手术刀—14阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习一主要从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约4000种1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。形成两种末端：黏性末端或平末端阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容151’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构16G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端磷酸二酯键G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,51718仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列18仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序18中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRI限制酶的作用中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能19

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。错位切黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割20SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线21平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中22限制酶作用特点1、限制酶识别特定的核苷酸序列——回文序列回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。2、限制酶断开磷酸二酯键限制酶作用特点1、限制酶识别特定的核苷酸序列——回文序列回文23你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物（主要是细菌）易受自然界外源DNA（噬菌体DNA）的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物（主要24寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，25261、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。3、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。2、要把目的基因插入运载体的前提是什么必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。思考?261、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？2627类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体催化形成磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针——DNA连接酶”的相关内容，填写下表自主学习二27类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA2728基因工程的连接酶“DNA连接酶”将两段DNA片段连接1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的

磷酸二酯键。★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E·coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；

T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。28基因工程的连接酶“DNA连接酶”将两段DNA片段连接1．28把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键DNA连接酶的作用把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接29两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合30DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可31AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用AATTGC32都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质 不需要需要形成完整的重组D3334DNA连接酶的种类34DNA连接酶的种类34353535362个4个1、每连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？

2、用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？思考：362个4个思考：362.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植37载体的作用载体的必要条件载体的种类阅读课本第6页“分子运输车——运载体”的相关内容，填写下表自主学习三1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制①细菌的质粒(由天然的改造而成)②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。

载体的作用载体的必要条件载体的种类阅读课本第6页“分子运输车3839基因工程的载体目的基因指某些小型DNA分子能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有多个限制酶切点（每种限制酶切点最好只有一个）具有标记基因，便于进行筛选条件39基因工程的载体目的基因指某些小型DNA分子能够在宿主细3940常用的运载体主要有两类：

1）细菌细胞质的质粒

2）噬菌体或某些动植物病毒40常用的运载体主要有两类：40有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制4142

质粒是染色体外能够进行自主复制的裸露的、结构简单的、双链环状DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。

质粒Plasmids

质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。42质粒是染色体外能够进行自主复制的裸露的、4243大肠杆菌的质粒

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素、氨苄青霉素的标记基因。复制的形式：1、独立自我复制2、整合到染色体上，随染色体DNA同步复制。质粒（人工改造的质粒）是基因工程最常用的运载体。43大肠杆菌的质粒最常用的质粒是大肠杆菌的4344ACGTGCAG标记基因外源基因ACGTGCAT44ACGTGCAG标记基因外源基因ACGTG4445抗四环素基因四环素生长被抑制正常生活四环素重组DNA45抗四环素基因四环素生长被抑制正常生活四环素重组DNA4546

例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素46例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素4647对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因47对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组4748重组DNA分子的模拟操作注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。48重组DNA分子的模拟操作注意：这两条DNA分子的碱基对不4849天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。

是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：49天然的DNA分子可以直接用做基因工程提示：基因工程中作为49501）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。501）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目5051DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。51DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为5152思考：一、质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是（）1．能自我复制2、不能自我复制3、结构很小4、成分是蛋白质5、是环状DNA分子6、是环状RNA分子7、链状DNA分子8、能友好地借居在宿主细胞中二、质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？1、3、5、8便于筛选、识别三、要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？为什么？一种52思考：1、3、5、8便于筛选、识别三、要想将某个特定5253例1、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G

(1)其中①和

是由一种限制酶切割形成的

末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是

。(2)

和

是由另一种限制酶切割形成的

末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是

。③平T4DNA连接酶②④黏性E·coliDNA连接酶53例1、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，③平T45354例2、某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a,通过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。这一过程涉及A.目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞B.基因a导入成功后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径C.细菌的DNA分子较小，可直接作为目的基因，导入受体中不需要整合到马铃薯的DNA分子中D.目的基因来自细菌，可以不需要运载体直接导入受体细胞A54例2、某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基54例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？

可以连接。因为由上述两种不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互补的）小试身手例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制55随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（）答案：56572、以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来C572、以下说法正确的是（）C57583、下列不是基因载体具备的条件的是（）

A、能自我复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD583、下列不是基因载体具备的条件的是（）D58594、有关基因工程的叙述中，错误的是（）

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A594、有关基因工程的叙述中，错误的是（）A59605、有关基因工程的叙述正确的是（）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D605、有关基因工程的叙述正确的是（）D60616、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因工程操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达C616、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因工61A7、在将胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的①同一种限制酶切割两者；②不需同一种限制酶切割两者；③加入适量的DNA连接酶；④不需加DNA连接酶A．①③ B．①④ C．②④ D．②③A7、在将胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列628、（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体答案：BD8、（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是答案：BD639、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D9、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是答案：D6410、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是（）A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④11、下列哪一种酶是基因工程的工具酶A、DNA连接酶B、DNA酶C、RNA酶D、运载体AA10、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的TC6512、下列不适合用于基因工程的运载体是（）A、质粒B、噬菌体C、细菌D、病毒C13、下列说法正确的是：（）A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列B、质粒是基因工程中唯一的运载体C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、运载体D、利用运载体在宿主细胞内对目的基因进行大量复制的过程可称为“克隆”D12、下列不适合用于基因工程的运载体C13、下列说法正确的是6614、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因

的DNA片段，需使用（）同种限制酶B.两种限制酶同种连接酶D.两种连接酶15、基因工程常用的受体细胞有（）

(1)大肠杆菌（2）枯草杆菌（3）支原体（4）动植物细胞A.（3）（4）B.（1）（2）（4）C.（2）（3）（4）D.（1）（2）（3）14、在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片6716、如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下列问题。16、如图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，据图回答下68X3-1-1__DNA重组技术的基本工具课件69(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为____________________，其作用是_________________________。(4)下列常在基因工程中用作载体的是(

)A．苏云金芽孢杆菌抗虫基因B．土壤农杆菌中的RNA分子C．大肠杆菌的质粒D．动物细胞的染色体(3)氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为_________70【思路点拨】本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，分析如下：【思路点拨】本题通过质粒结构的模式图考查质粒的功能和特点，71X3-1-1__DNA重组技术的基本工具课件72

17、(2011年北大附中高二检测)下列关于DNA连接酶的叙述正确的是(

)①催化相同黏性末端的DNA片段之间的连接②催化不同黏性末端的DNA片段之间的连接③催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成④催化DNA分子两条链的脱氧核糖与磷酸之间磷酸二酯键的形成A．①③

B．②④C．②③D．①④

【尝试解答】

D17、(2011年北大附中高二检测)下列关于DNA连接73

18

、(2011年雅礼中学高二检测)基因工程中，须使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是－G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。根据图示判断下列操作正确的是(

)18、(2011年雅礼中学高二检测)基因工程中，须74A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割【尝试解答】

DA．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割75【解析】

首先把目的基因切下来要用到限制酶Ⅱ；如果再用限制酶Ⅱ切割质粒，则2个标记基因都被切开，标记基因将失去作用。而用限制酶Ⅰ切割质粒可保留一个标记基因，而产生的黏性末端和限制酶Ⅱ切割下来的目的基因可以互补配对。【互动探究】上题中限制酶Ⅰ切开化学键后产生哪种类型的末端？【解析】首先把目的基因切下来要用到限制酶Ⅱ；如果再用限制76【提示】黏性末端。【易误警示】

(1)限制性核酸内切酶是一类酶而不是一种酶。(2)限制性核酸内切酶作用的化学键为磷酸二酯键，而不是氢键。(3)不同种类的限制性核酸内切酶识别与切割的位点不同，这与酶的专一性是一致的。【提示】黏性末端。77总结规律限制酶所识别的序列有什么特点？无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。

思考与探究1．限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段：(1)…CTGCA

(2)…AC

(3)GC…

…G

…TG

CG…（4）…G

(5)

G…

(6)…GC

…CTTAA

ACGTC…

…CG(7)GT…

(8)AATTC…

CA…

G…你是否能将同种限制酶切割后产生的末端连接起来？总结规律限制酶所识别的序列有什么特点？无论是6个碱基还是4个78比较有关的DNA酶（1）DNA水解酶：能够将DNA水解成四种脱氧核苷酸，彻底水解成膦酸、脱氧核糖和含氮碱基（2）DNA解旋酶：能够将DNA或DNA的某一段解成两条长链，作用的部位是碱基和碱基之间的氢键。注意：使DNA解成两条长链的方法除用解旋酶以外，在适当的高温（如94℃）、重金属盐的作用下，也可使DNA解旋。（3）DNA聚合酶：能将单个的核苷酸通过磷酸二酯键连接成DNA长链。（4）DNA连接酶：是通过磷酸二酯键连接双链DNA的缺口。比较有关的DNA酶79【探规寻律】几种酶的作用部位限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶作用于①部位,DNA解旋酶作用于②部位。【探规寻律】几种酶的作用部位80演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！8182专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具1专题1基因工程1.1DNA重组技术的基本工具82基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体的发现2)工具酶的发现3)DNA合成和测序技术的发明4)DNA体外重组的实现5)重组DNA表达实验的成功6)第一例转基因动物问世7)PCR技术的发明基础理论和技术发展催生了基因工程科技探索之路1)基因转移载体83角似鹿鼻似狮目似虎唇似牛爪似鹰髭似马鳞似鱼身似蛇角似鹿84设想一

能否培养出具有抗虫性状的抗虫棉呢？设想一能否培养出具有抗虫85蓝色玫瑰蓝色玫瑰86能生产胰岛素的大肠杆菌能生产胰岛素的大肠杆菌87转基因鼠转基因鼠88能发荧光的转基因猪能发荧光的转基因猪8990是指按照人们的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫DNA重组技术或基因拼接技术。什么叫基因工程？生长激素、胰岛素9是指按照人们的意愿，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转9091基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的新的生物类型和生物产品（或基因产物）剪切→拼接→导入→表达实质（原理）基因重组对基因工程概念的理解一种定向改造生物的新技术10基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人91第1节第1节92931.1DNA重组技术的基本工具121.1DNA重组技术的基本工具9394基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云金芽孢杆菌提取抗虫基因与载体DNA拼接导入棉花细胞(含抗虫基因)棉花植株(有抗虫特性)13基因工程培育抗虫棉的简要过程：普通棉花(无抗虫特性)苏云9495关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取。关键步骤二：抗虫基因与载体DNA连接。关键步骤三：抗虫基因进入棉细胞。基因的分子手术刀——限制性内切酶。

基因的分子缝合针——DNA连接酶。

基因的分子运输车——载体。如何解决？抗虫棉培育14关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆基因的分子手术刀—95阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容，填写下表自主学习一主要从原核生物中分离纯化而来已经分离出大约4000种1、识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列2、使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。形成两种末端：黏性末端或平末端阅读课本4-5页“限制性核酸内切酶——分子手术刀”的相关内容961’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构1’2’3’4’5’脱氧核苷酸的结构97G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯键3’端5’端3’端5’端磷酸二酯键G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,59899仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序列限制酶所识别的序列的特点是：找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的，称为回文序列18仔细观察各限制酶识别的特定序列有何特点？限制酶的识别序99中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。EcoRI限制酶的作用中轴线在G与A之间切割大肠杆菌的一种限制酶(EcoRⅠ)只能100

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切开的DNA两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。错位切黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割101SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线SmaI限制酶的作用在G与C之间切割SmaI只能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切开。中轴线102平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。平末端平末端SmaI限制酶的切割当限制酶从识别序列的中103限制酶作用特点1、限制酶识别特定的核苷酸序列——回文序列回文序列：在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致。2、限制酶断开磷酸二酯键限制酶作用特点1、限制酶识别特定的核苷酸序列——回文序列回文104你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物（主要是细菌）易受自然界外源DNA（噬菌体DNA）的入侵，但生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。寻根问底你能推测限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？原核生物（主要105寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。寻根问底为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？通过长期的进化，1061071、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。3、如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？

会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。2、要把目的基因插入运载体的前提是什么必须用同一种限制酶来切割目的基因和运载体。思考?261、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？107108类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶大肠杆菌T4噬菌体催化形成磷酸二酯键只能连接黏性末端能连接黏性末端和平末端(效率较低)阅读课本第5页“分子缝合针——DNA连接酶”的相关内容，填写下表自主学习二27类型来源功能相同点差别E·coliDNA连接酶T4DNA108109基因工程的连接酶“DNA连接酶”将两段DNA片段连接1．分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类2．功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的

磷酸二酯键。★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E·coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；

T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。28基因工程的连接酶“DNA连接酶”将两段DNA片段连接1．109把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接起来催化形成磷酸二酯键DNA连接酶的作用把切下来的DNA片段拼接成新的DNA，即将脱氧核糖和磷酸连接110两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合作用可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，注意：DNA连接酶可连接双链DNA中的DNA单链缺口，但不能连接单链DNA！两DNA片段要具有互补的黏性末端才能拼起来DNA连接酶的缝合111DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低DNA连接酶的缝合作用DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗？T4DNA连接酶还可112AATTGCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用AATTGC113都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质

不需要需要形成完整的重组DNA分子形成DNA的一条链基因工程DNA复制DNA连接酶与DNA聚合酶的比较只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键都能催化形成磷酸二酯键都是蛋白质 不需要需要形成完整的重组D114115DNA连接酶的种类34DNA连接酶的种类115116351161172个4个1、每连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？

2、用限制酶切一个特定基因要切断几个磷酸二酯键？思考：362个4个思考：1172.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植物和动物中没有?

原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。2.为什么限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高等植118载体的作用载体的必要条件载体的种类阅读课本第6页“分子运输车——运载体”的相关内容，填写下表自主学习三1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2）具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3）具有某些标记基因，便于进行鉴定和选择。4）必须是安全的，对受体细胞无害。5）载体DNA分子应大小适中，以便于提取和操作1）作为运载工具，将目的基因导入受体细胞中2）在受体细胞内对目的基因进行大量复制①细菌的质粒(由天然的改造而成)②病毒：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。

载体的作用载体的必要条件载体的种类阅读课本第6页“分子运输车119120基因工程的载体目的基因指某些小型DNA分子能够在宿主细胞中复制并稳定地保存具有多个限制酶切点（每种限制酶切点最好只有一个）具有标记基因，便于进行筛选条件39基因工程的载体目的基因指某些小型DNA分子能够在宿主细120121常用的运载体主要有两类：

1）细菌细胞质的质粒

2）噬菌体或某些动植物病毒40常用的运载体主要有两类：121有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制并带着插入的目的基因一起复制质粒——裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。最常用运载体——质粒实际上在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。有标记基因的存在，可用含青霉素的培养基鉴别。有切割位点能复制122123

质粒是染色体外能够进行自主复制的裸露的、结构简单的、双链环状DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中核以外的DNA分子。

质粒Plasmids

质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内完成。42质粒是染色体外能够进行自主复制的裸露的、123124大肠杆菌的质粒

最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素、氨苄青霉素的标记基因。复制的形式：1、独立自我复制2、整合到染色体上，随染色体DNA同步复制。质粒（人工改造的质粒）是基因工程最常用的运载体。43大肠杆菌的质粒最常用的质粒是大肠杆菌的124125ACGTGCAG标记基因外源基因ACGTGCAT44ACGTGCAG标记基因外源基因ACGTG125126抗四环素基因四环素生长被抑制正常生活四环素重组DNA45抗四环素基因四环素生长被抑制正常生活四环素重组DNA126127

例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素的基因，现探讨某细菌的质粒中有无标记基因或标记基因是什么？请设计实验、预期实验结果，并得出相应的实验结论。对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素46例、已知标记基因有抗四环素基因和抗氨苄青霉素127128对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组2：添加一定浓度的氨苄青霉素实验组3：添加一定浓度的四环素和氨苄青霉素既含有抗四环素基因也含有抗氨苄青霉素基因只含有抗四环素基因只含有抗氨苄青霉素基因既不含有抗四环素基因也不含有抗氨苄青霉素基因47对照组：不添加抗生素实验组1：添加一定浓度的四环素实验组128129重组DNA分子的模拟操作注意：这两条DNA分子的碱基对不是随意乱写的。首先，每个DNA分子上的两条链上的碱基要互补配对；第二，每个DNA分子中每条链都存在一个G-A-A-T-T-C的碱基序列，也就是说是EcoRI限制酶的识别位点，并存在G-A的切割位点。48重组DNA分子的模拟操作注意：这两条DNA分子的碱基对不129130天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？提示：基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。

是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？不是作为基因工程使用的载体必需满足以下条件：49天然的DNA分子可以直接用做基因工程提示：基因工程中作为1301311）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。2）载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。3）载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。4）载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。5）载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。501）载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目131132DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？

迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。51DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？迄今为132133思考：一、质粒是基因工程中最常用的运载体，它的主要特点是（）1．能自我复制2、不能自我复制3、结构很小4、成分是蛋白质5、是环状DNA分子6、是环状RNA分子7、链状DNA分子8、能友好地借居在宿主细胞中二、质粒上会存在某些标记基因，这些标记基因有什么用途？1、3、5、8便于筛选、识别三、要想将某个特定基因与质粒相连，需要用几种限制性内切酶和几种DNA连接酶处理？为什么？一种52思考：1、3、5、8便于筛选、识别三、要想将某个特定133134例1、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，试分析：①GC…②AATTC…③…GC④…CTTAACG…G……CG…G

(1)其中①和

是由一种限制酶切割形成的

末端，两者要重组成一个DNA分子，所用DNA连接酶通常是

。(2)

和

是由另一种限制酶切割形成的

末端，两者要形成重组DNA片段，所用的连接酶通常是

。③平T4DNA连接酶②④黏性E·coliDNA连接酶53例1、以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段，③平T4134135例2、某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基因a,通过基因工程的方法，将a转到马铃薯植株中，经检测发现Amy在成熟块茎细胞中存在。这一过程涉及A.目的基因进入受体细胞后，可随着马铃薯的DNA分子的复制而复制，传给子代细胞B.基因a导入成功后，将抑制细胞原有的新陈代谢，开辟新的代谢途径C.细菌的DNA分子较小，可直接作为目的基因，导入受体中不需要整合到马铃薯的DNA分子中D.目的基因来自细菌，可以不需要运载体直接导入受体细胞A54例2、某科学家从细菌中分离出耐高温淀粉酶（Amy）基135例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶Ⅱ的切点。（1）请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA连接酶作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？

可以连接。因为由上述两种不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互补的）小试身手例：限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制136随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（）A、限制酶是一种酶，只识别GAATTC碱基序列B、EcoRI切割的是G—A之间的氢键C．限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD．限制酶只存在于原核生物中答案：C随堂练习：1、关于限制酶的说法中，正确的是（）答案：1371382、以下说法正确的是（）

A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列

B、质粒是基因工程中唯一的运载体

C、载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接

D、基因控制的性状都能在后代表现出来C572、以下说法正确的是（）C1381393、下列不是基因载体具备的条件的是（）

A、能自我复制

B、有多个限制酶切点

C、具有标记基因

D、它是环状DNAD583、下列不是基因载体具备的条件的是（）D1391404、有关基因工程的叙述中，错误的是（）

A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来

B、限制性核酸内切酶用于目的基因的获得

C、目的基因须由载体导入受体细胞

D、人工合成目的基因不用限制性内切酶A594、有关基因工程的叙述中，错误的是（）A1401415、有关基因工程的叙述正确的是（）

A、限制酶只在获得目的基因时才用

B、重组质粒的形成在细胞内完成

C、质粒都可作为载体

D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料D605、有关基因工程的叙述正确的是（）D1411426、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因工程操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（）

A、人工合成目的基因

B、目的基因与载体结合

C、将目的基因导入受体细胞

D、目的基因的检测和表达C616、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因工142A7、在将胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列哪组是所需要的①同一种限制酶切割两者；②不需同一种限制酶切割两者；③加入适量的DNA连接酶；④不需加DNA连接酶A．①③ B．①④ C．②④ D．②③A7、在将胰岛素的基因与质粒形成重组DNA分子的过程中，下列1438、（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是A、基因工程技术能定向地改造生物的遗传性状，培育生物新品种B、重组DNA的形成在细胞内完成C、目的基因须由运载体导入受体细胞D、质粒都可作为运载体答案：BD8、（多选）有关基因工程的叙述中，错误的是答案：BD1449、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是

A．①②B．②③C．③④D．②④答案：D9、下列四条DNA分子，彼此间具有粘性末端的一组是答案：D14510、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是（）A、①②B、①③C、①④D、②③TCGAGCTTAAAGGTTCCAAGCTTCAGAATTCG③①②④11、下列哪一种酶是基因工程的工具酶A、DNA连接酶B、DNA酶C、RNA酶D、运载体AA10、下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的TC14612、下列不适合用于基因工程的运载体是（）A、质粒B、噬菌体C、细菌D、病毒C13、下列说法正确的是：（