工业微生物菌种保藏技术2

第九节工业微生物菌种保藏技术

在生产发酵中，具有高产有重要经济价值的某一期待代谢产物主能力的微生物菌种的保存和长期保藏，对于一成功的工业发酵过程极为重要。一、理想的菌种保藏方法应具备的条件(1)

经长期保藏后菌种存活健在；(2)

保证高产突变株不改变表型和基因型，特别是不改变初级代谢产物和次级代谢产物生产的高产能力。(3)菌种保藏的基本措施是低温、干燥、真空。一、微生物菌种保藏在一定时间内使菌种不死、不变、不乱基本要求：基本方法：生活态休眠态培养基传代培养寄主传代培养冷冻干燥斜面、平板液氮、低温冰箱沙土管、冷冻真空干燥

由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。

对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。国际重要菌种保藏机构中国菌种保藏单位二、工业微生物菌种保藏技术

(1)超低温或在液氮中冷冻保藏；(2)冷冻干燥或真空干燥保藏；(3)

转接培养或斜面传代保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体于燥保藏。菌种保藏方法暂时保藏法

斜面传代法穿刺法长期保藏法

液体石蜡法甘油管法砂管保藏法砂土管保藏法滤纸片保藏法冷冻干燥保藏法液氮冷冻法

2.1

冷冻保藏

冷冻保藏为保藏微生物菌种的最简单而有效的方法。通过冷冻，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。为了获得满意的冷冻结果，通常应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。冷冻保藏时温度要求在-20℃以下，同时应认真掌握好冷冻速度和解冻速变。冷冻深藏的缺点之一是培养物运输较困难。冷冻保藏藏种类一、普通通冷冻保保藏技术术(-20℃)二、超低低温冷冻冻保藏技技术(-60一一-80℃)三、液氮氮冷冻保保藏技术术普通冷冻冻保藏技技术(-20℃℃)将液体培培养物或或从琼脂脂斜面培培养物收收获的细细胞分接接到试管管或指管管肉，然然后贮藏藏于一冰冰箱的冷冷藏室中中，或于于温度范范围在-5～-20℃℃的普通通冰箱(-20℃)中中。或者者，将菌菌种培养养在小的的试管或或培养瓶瓶斜面上上，待生生长适度度后，将将试管或或瓶口用用橡胶塞塞严格封封好，同同上置于于冰箱中中保存。。用此方法法可以维维持若干干微生物物的活力力1—2年。应注意的的是经过过一次解解冻的菌菌株培养养物不宜宜再用来来保藏。。保藏过程程中应注注意控制制保藏温温度，培培养瓶或或试管应应严格密密封。这一方法法虽简便便易行，，但不适适宜多数数微生物物的长期期保藏。。二、超低低温冷冻冻保藏技技术(-60一一-80℃)要求长期期保藏的的微生物物菌种，，一般都都要求在在-60℃以下下进行保保藏。在超低温温冷藏柜柜中保藏藏菌种的的一般方方法是：：1．离心心收获对对数生长长中期至至后期的的微生物物细胞；；2．用新新鲜培养养基重新新悬浮所所收获的的细胞；；3．加入入等体积积的20％甘油油或10％二甲甲亚砜；；4．混匀后后分装入冷冷冻指管或或安瓿中，，于-70℃超低温温冰箱中保保藏。如果待保藏藏菌种生长长在斜面上上，则可用用含10％％甘油的新新配制液体体培养基洗洗涤收获。。超低温冰冰箱的冷冻冻速度一般般控制在1-2℃／／min。。若干细菌菌和真菌菌菌种可通过过此保藏方方法保藏5年而活力力不受影响响。三、液氮冷冷冻保藏技技术(一)冷冻冻保护剂在液氮冷冻冻保藏中，，最常用的的冷冻保护护剂是二甲甲亚砜和甘甘油，最终终使用浓度度一般为甘甘油10％％、二甲亚亚砜5％。。所使用的的甘油—般般用高压蒸蒸汽灭菌，，而二甲亚亚砜最好为为过滤灭菌菌。(二)液氮氮冷冻保藏藏微生物菌菌种的步骤骤1．待冷冻冻保藏菌种种悬液的制制备(1)从生生长斜面制制备菌悬液液：每一斜斜面加入5ml含10％甘油油的营养液液体培养；；用巴氏吸吸管吹吸斜斜面制成孢孢子及菌体体细胞悬液液；0.5～lml分装玻璃璃安瓿或液液氮冷藏专专用塑料瓶瓶。(2)从浸浸没培养物物制备菌悬悬液：在浸没培养养液中加入入等体积20%无菌菌甘油；轻轻轻振荡混混匀培养液液，如果菌菌体絮凝较较紧，则需需先用玻璃璃珠打散；；0.5-lml分分装玻璃安安瓿或液氮氮冷藏专用用塑料瓶，，玻璃安瓿瓿用酒精喷喷灯封口；；将所有封封好的安瓿瓿置于5℃℃冰箱中3min，，以使细胞胞和悬浮培培养基之间间达到平衡衡。2．．控控速速冷冷冻冻．．(1)将将安安瓿瓿或或液液氮氮瓶瓶置置于于铝铝盒盒或或布布袋袋中中，，然然后后置置于于一一较较大大的的金金属属容容器器中中；；(2)将将此此金金属属容容器器置置于于控控速速冷冷冻冻机机的的冷冷冻冻室室中中；；(3)以1-2℃/min的的致冷冷速度度降温温，直直到温温度达达到相相对温温度之之上几几度的的细胞胞冻结结点(通常常为-30℃)；(4)补加加一定定量的的液氮氮至系系统中中，使使细胞胞在冻冻结点点时尽尽可能能快地地发生生相变变；(5)细胞胞冻结结后，，将致致冷速速度降降为1℃/min，，直到到温度度达-50℃；；(6)将安安瓿迅迅速移移入液液氮罐罐中于于液相相(-196℃℃)或或气气相(-156℃)中保保存。。如果无无控速速冷冻冻机，，则一一般可可将安安瓿或或液氮氮瓶置置于一一70℃冰冰箱中中冷冻冻4h，然然后迅迅速移移入液液氮罐罐中保保存。。(三)复苏苏1．从从液氮氮罐中中取出出所需需的安安瓿，，立即即置于于冰浴浴中；；2．迅迅速将将安瓿瓿置于于37-40℃℃水浴浴中，，并轻轻轻摇摇动以以加速速解；；3．用用巴氏氏吸管管将安安瓿中中贮存存培养养物移移接入入含有有2m1无无菌液液体培培养基基的试试管中中，用用同一一支吸吸管反反复抽抽吸数数次，，然后后取0.1-0.2ml(约4、8滴)转接接入琼琼脂斜斜面上上。2.2冻干保藏藏冷冻干燥燥的基本本方法：：是通过过在减压压条件下下使冻结结的细胞胞悬液中中的水分分升华，，使培养养物干燥燥。此法是微微生物菌菌种长期期保藏的的最为有有效的方方法之一一。冷冻干燥燥过程中中必须使使用冷冻冻保护剂剂，目前前国内常常用脱脂脂乳和蔗蔗糖，国国外尚有有运用动动物血清清等的。。大部分微生生物菌种可可以在冻干干状态下保保藏10年年之久而不不丧失活力力。而且经经冻干后的的菌株无需需进行冷冻冻保藏，便便于运输。。培养物的冻冻干过程冷冻真空干干燥操作流流程安培瓶配制保护剂灭菌菌种培养制备菌悬液分装安培瓶洗净烘干装标签加棉塞预冻真空干燥测定水分熔封管口检查真空度包藏(三)冻干干菌种的保保藏与再生生1．保藏：：冷冻干燥燥后的培养养物在低于于5℃下保保藏。较低低的保藏温温度(-20～-70℃)对对于培养物物的长期稳稳定更好。。2．复苏：：(1)在超超净工作台台中用70％酒精棉棉球擦洗安安瓿，然后后用砂轮在在安瓿中锉锉一道沟。。(2)用无无菌纱布或或无菌毛巾巾包好安瓿瓿，然后用用手掰开安安瓿。(3)在安安瓿中加入入0.5～～1ml营营养液体培培养基，慢慢慢旋转安安瓿，使冻冻干菌种复复水。然后后将此转接接到一含有有再生培养养基的无菌菌试管中，，或直接接接种琼脂斜斜面或涂布布平板。(4)在在指指管管中中冻冻干干的的菌菌种种通通常常为为絮絮粉粉状状，，可可以以将将此此直直接接振振落落入入盛盛有有l～～2ml液液体体培培养养基基的的试试管管中中，，轻轻轻轻振振荡荡5～～l0min，，然然后后用用此此悬悬液液接接种种适适宜宜的的再再生生培培养养基基。。2.3传传代代保保藏藏将菌菌种种定定期期在在新新鲜鲜琼琼脂脂培培养养基基上上传传代代，，然然后后在在一一定定的的生生长长温温度度下下生生长长和和保保存存的的传传代代保保藏藏方方法法。。可用用于于实实验验室室中中若若干干菌菌种种的的保保藏藏。。此法法最最为为简简单单和和经经济济，，且且不不要要求求任任何何特特殊殊的的设设备备。。但此此方方法法易易发发生生培培养养基基干干枯枯、、菌菌体体自自溶溶、、基基因因突突变变。。2.3传代代培培养养法法实验验原原理理：：保保藏藏的的菌菌种种通通过过斜斜面面、、穿穿刺刺或或疱疱肉肉培培养养基基（（用用于于厌氧氧细细菌菌））培培养养好好后后，，置置4C˚˚冰冰箱箱中中存存放放，，定定期期进行行传传代代培培养养、、再再存存放放。。可用用胶胶塞塞代代替替棉棉塞塞或或在在斜斜面面上上覆覆盖盖一一层层无无菌菌液液体体石蜡蜡来来进进一一步步延延长长保保存存期期。。操作作方方法法1、、斜斜面面保保藏藏法法将菌菌种种转转接接在在适适宜宜固固体体斜斜面面培培养养基基上上，，待待其其充充分分生生长长后后，，用用牛牛皮皮纸纸将将棉棉塞塞部部分分包包扎扎好好（（棉棉塞塞换换成成胶胶塞塞效效果果更更好好）），，置置4C˚˚冰冰箱箱中中包包藏藏。。保藏藏时时间间依依微微生生物物的的种种类类而而定定。。霉霉菌菌、、放放线线菌菌及及芽芽孢孢菌菌保保存存2－－4个个月月移移种种一一次次，，酵酵母母菌菌间间隔隔两两个个月月，，普普通通细细菌菌一一个个月月，，假假单单胞胞菌菌两两周周传传代代一一次次。。此法优优点是是操作作简单单、使使用方方便，，缺点点是保保藏时时间短短、易易被污污染。。2、液液体石石蜡保保藏法法将无菌菌石蜡蜡加在在已长长好菌菌的斜斜面上上，其其用量量以高高出斜斜面顶顶端1CM为准准，使使菌种种与空空气隔隔绝。。将试管管直立立，置置低温温或室室温下下保存存。此法实用且且效果较好好。霉菌、、放线菌、、芽孢菌可可保藏两年年以上，酵酵母菌可保保藏1－2年，普通通细菌也可可保藏1年年左右。3、穿刺保保藏法按穿刺接种种方式培养养菌种，菌菌种长好后后用胶塞封封严，置4℃冰箱存存放。矿物油中浸浸没保藏将琼脂斜面面或液体培培养物浸入入矿物油中中于室温下下保藏，此此方法简便便有效。可用于丝状状真菌、酵酵母、细菌菌和放线菌菌的保藏。。特别对难难于冷冻干干燥的丝状状真菌和难难以在固体体培养基上上形成孢子子的担子菌菌等的保藏藏更为有效效。浸没保藏的的操作要点点是首先让让待保藏菌菌种在适宜宜的培养基基上生长，，然后注入入经170℃下灭菌菌1-2h的矿物油油，矿物油油的用量以以高出培养养物1cm为宜。以液体石蜡蜡作为保藏藏方法时，，应对需保保藏的菌株株预先作试试验。因为为某些菌株株在液体石石蜡下生长长还十分明明显，有些些菌株如某某些假丝酵酵母还会同同化液体石石蜡，也有有的对液体体石蜡保藏藏敏感。所所有这些菌菌株都不能能用液体石石蜡保藏。。为了预防防不测，一一般保藏株株2～3年年也应做一一次存活试试验。2.4载体法实验原理：：使生长合合适的微生生物吸附在在一定的载载体上进行行干燥。常用的载体体有土壤、、砂土、硅硅胶、明胶胶、麸皮、、磁珠和滤滤纸片等。操作方法（（砂土管保保藏法）（1）河砂砂处理取河砂若干干加入盐酸酸10%，，加热煮煮沸30min除去去有机机质质。倒去盐盐酸溶液，，用自来水水冲洗至中中性，最后后一次用蒸蒸镏水冲洗洗，烘干后后用40目目筛子过筛筛，弃去粗粗颗粒，备备用。（２）土壤壤处理取非耕作层层不含腐殖殖质的痩黄黄土或红土土，加自来来水浸泡洗洗涤数次，，直至中性性。烘干后后碾碎，用用100目目筛子过筛筛，粗颗粒粒部分丢掉掉。(3)砂土土混合处理妥当的的河砂与土土壤按3：：1的比例例掺合(或或根据需要要而用其他他比例，甚甚至可全部部作砂或土土)均匀后后，装入10x100mm的的小试管或或安瓿管中中，每管分分装1g左左右，塞上上棉塞，进进行灭菌(通常采用用间歇灭菌菌2--3次)，最最后烘干。。2.4基因工程菌菌的保藏由载体质粒粒等携带的的外源DNA片段通通常是遗传传不稳定的的、且很易易丢失其外外源质粒复复制子。质质粒基因通通常为宿主主细胞生长长非必需。。一般情况下下当细胞丢丢失这些质质粒时，生生长速度会会加快。当培养基中中加入抗生生素时，抗抗生素提供供了一有利利于携带质质粒的细胞胞群体的极极有用的生生长选择压压。而且在在运用基因因工程菌进进行发酵时时，抗生素素的加入可可帮助维持持质粒复制制与染色体体复制的协协调。我们建议基基因工程菌菌应保藏在在含低浓度度选择剂的的培养基中中。不同菌种保保藏方法比比较细菌的保藏藏放线菌菌种种的保藏保藏方法主主要有：沙土管法、、冷冻干燥燥法、液氮氮冷冻法放线线菌菌菌菌种种的的长长期期保保藏藏依依保保藏藏放放线线菌菌的的分分生生孢孢子子为为主主要要方方式式。。2.5微微生生物物活活力力和和稳稳定定性性测测定定所有有保保藏藏菌菌种种的的方方法法都都必必须须是是长长期期可可靠靠地地保保持持菌菌种种的的优优良良性性状状不不变变。。在保保藏藏时时定定期期检检测测菌菌种种活活力力，，以以确确定定保保藏藏培培养养物物的的保保藏藏期期限限和和保保藏藏方方法法的的可可靠靠性性，，以以及及确确定定在在实实际际保保藏藏过过程程中中出出现现的的细细胞胞死死亡亡程程度度和和遗遗传传稳稳定定性性。。对工工业业微微生生物物生生产产菌菌种种来来说说，，建建议议保保藏藏菌菌种种的的形形态态学学和和生生化化特特征征(如如代代谢谢产产物物的的产产生生、、酶酶活活力力、、遗遗传传特特征征及及生生化化指指标标)应应在在保保藏藏后后加加以以检检测测和和确确定定。。加速速保保藏藏试试验验可可用用于于预预测测保保藏藏过过程程中中保保藏藏培培养养物物的的稳稳定定性性。。在在一一给给定定温温度度下下通通过过对对高高温温下下短短期期活活力力丧丧失失程程度度检检测测，，可可以以用用来来预预测测嗜嗜酸酸乳乳杆杆菌菌的的稳稳定定性性。。成功的的菌种种长期期保藏藏方法法之有有价值值的指指标包包括在在保藏藏6个个月、、1年年或更更长时时间后后存活活百分分率(或存存活单单位)。细细胞群群体的的形态态学特特征或或一些些特别别的生生化特特征应应在菌菌种保保藏前前后保保持同同一性性，以以及实实验室室中、、中试试车间间中和和生产产发酵酵中产产品滴滴度的的稳定定性，，后者者极为为重要要。第十节节菌种的的衰退退与复复壮在生物物进化化的历历史长长河中中，遗遗传性性的变变异是是绝对对的，，而它它的稳稳定性性反而而是相相对的的；退退化性性的变变异是是大量量的，，而进进化性性的变变异却却是个个别的的。在自然情情况下，，个别的的适应性性变异通通过自然然选择就就可保存存和发展展，最后后成为进进化的方方向；在在人为条条件下，，人们也也可以通通过人工工选择法法去有意意识地筛筛选出个个别的正正变体用用于生产产实践中中。相反，如如不自觉觉、认真真地去进进行人工工选择，，大量的的自发突突变菌株株就会趁趁机泛滥滥，最后后导致菌菌种的衰衰退（degeneration）。在长期接接触菌种种的实际际工作人人员中，，都有这这样的体体会，即即如果对对菌种工工作长期期放任自自流，不不搞纯化化、复壮壮（rejuve-nation））和育种种，则菌菌种就会会对你进进行“惩惩罚”，，反映到到生产上上就会出出现持续续的低产产、不稳稳产。这这说明菌菌种的生生产性状状也是不不进则退退的。菌种衰退退的表现现对产量性性状来说说，菌种种的负变变就是衰衰退。其他原有有的典型型性状变变得不典典型时，，也是衰衰退。最最易觉察察到的是是菌落和和细胞形形态的改改变。生长长速速度度缓缓慢慢，，产产孢孢子子越越来来越越少少。。代谢谢产产物物生生产产能能力力或或其其对对宿宿主主寄寄生生能能力力的的下下降降。。衰退退还还表表现现在在抗抗不不良良环环境境条条件件（（抗抗噬噬菌菌体体、、抗抗低低温温等等））能能力力的的减减弱弱等等。。菌种种衰衰退退的的实实质质菌种种的的衰衰退退是是发发生生在在细细胞胞群群体体中中的的一一个个由由量量变变到到质质变变的的逐逐步步演演变变过过程程。。开始始时时，，在在一一个个大大群群体体中中仅仅个个别别细细胞胞发发生生负负变变，，这这时时如如不不及及时时发发现现并并采采取取有有效效措措施施，，而而一一味味移移种种传传代代，，则则群群体体中中这这种种负负变变个个体体的的比比例例逐逐步步增增大大，，最最后后让让它它们们占占了了优优势势，，从从而而使使整整个个群群体体表表现现出出严严重重的的衰衰退退。。所以以，，在在开开始始时时所所谓谓““纯纯””的的菌菌株株，，实实际际上上其其中中已已包包含含着着一一定定程程度度的的不不纯纯因因素素；；同同样样，，到到了了后后来来，，整整个个菌菌种种虽虽已已““衰衰退退””了了，，但但也也是是不不纯纯的的，，即即其其中中还还有有少少数数尚尚未未衰衰退退的的个个体体存存在在着着。。复壮壮的的概概念念狭义义的的复复壮壮仅仅是是一一种种消消极极的的措措施施，，它它指指的的是是在在菌菌种种已已发发生生衰衰退退的的情情况况下下，，通通过过纯纯种种分分离离和和测测定定生生产产性性能能等等方方法法，，从从衰衰退退的的群群体体中中找找出出少少数数尚尚未未衰衰退退的的个个体体，，以以达达到到恢恢复复该该菌菌原原有有典典型型性性状状的的一一种种措措施施；；而广广义义的的复复壮壮则则应应是是一一项项积积极极的的措措施施，，即即在在菌菌种种的的生生产产性性能能尚尚未未衰衰退退前前就就经经常常有有意意识识地地进进行行纯纯种种分分离离和和生生产产性性能能的的测测定定工工作作，，以以期期菌菌种种的的生生产产性性能能逐逐步步有有所所提提高高。。所所以以，，这这实实际际上上是是一一种种利利用用自自发发突突变变（（正正变变））不不断断从从生生产产中中进进行行选选种种的的工工作作。。二、、菌菌种种的的衰衰退退与与复复壮壮1））从衰衰退退的的菌菌种种群群体体中